I car ru: Специализированный интернет-магазин автомобильной электроники

Содержание

Ремонт и ТО легковых автомобилей

Компьютерная диагностика и ремонт всех систем

Регулировка развала-схождения колес

Регламентное ТО и текущий ремонт автомобилей

Ремонт бензиновых

и дизельных

двигателей

любой сложности

Главная задача нашего техцентра — оказать Вам помощь при возникновении неполадок и неисправностей Вашего автомобиля. Мы всегда готовы выслушать вас по телефону и лично, а также принять Ваш автомобиль для проведения диагностики и ремонта.

Мы разберемся во всех технических проблемах Вашего автомобиля, наглядно и доступно предоставим Вам информацию по всем неисправностям и по их влиянию на эксплуатацию автомобиля, определим очередность

(приоритетность) их устранения.

Если Вас что-то беспокоит в работе автомобиля — позвоните или приезжайте, всегда найдем время осмотреть, послушать, продиагностировать, дадим свои рекомендации.

При проведении ремонта или планового ТО в нашем техцентре Вы можете заказать детали и расходные материалы (масла, жидкости) — доставим то, что Вам нужно — от проверенных бюджетных аналогов до абсолютного «оригинала». При необходимости дадим конкретные рекомендации по выбору.

ии

Подберем и доставим необходимые для ремонта Вашего автомобиля запасные части и эксплуатационные материалы !

Ремонт и заправка кондиционеров

Полная диагностика автомобиля перед покупкой

Сварочные работы, удаление катализаторов, тюнинг выпускной системы.

Ремонт автомобилей и поставка запасных частей и расходных материалов.

Диагностика и ремонт всех систем. Заправка и ремонт кондиционеров.

Кроме автомобилей, производим ремонт мототехники разных типов — мотоциклов, снегоходов, квадрициклов и др. Обращайтесь.

Заключаем договоры с бюджетными и коммерческими организациями на ТО и ремонт по безналичному расчету. Работаем по 44-ФЗ и 223-ФЗ.

iCar — машина или сервис?

И снова Apple объявила о своих больших планах, на сей раз речь о покорении автомобильной индустрии. Производитель iPhone намерен составить конкуренцию Tesla, GM и к 2020 году выпустить собственный электромобиль. Как видите, технологические гиганты из Кремниевой Долины, причем не только Apple, решили триумфально ворваться в новую для них сферу. (Вспомните об успехах Google с ее беспилотным авто.) Однако на данный момент туманность их планов скорее вызывает замешательство, чем помогает понять, что на самом деле ждет потребителей в данном контексте.

Сейчас представители автомобильной индустрии задаются единственным вопросом. Зачем компании, передовой в своей технологической области, потребовалась доля рынка в такой низкорентабельной, но капиталоемкой отрасли как автопром. Бывший генеральный директор GM Дэн Акерсон предостерегает владельцев акций Apple по поводу такого решения компании. По его словам, те, кто никогда не работал в сфере автомобилестроения, понятия не имеют, что это такое, они склонны недооценивать этот рынок. У данного человека есть все основания и права высказывать подобные предупреждения. Ведь за 5,5 лет на управленческом посту в автомобильной индустрии господин Акерсон совершил немало ошибок и получил огромный опыт.

Похоже, однако, что его последняя ошибка заключается в неспособности понять следующего. Ни один из гигантов из Кремниевой Долины не планирует просто взять и обскакать опытных производителей авто в их родной стихии. У Apple и Google сейчас есть исторически важная стратегическая возможность совершить переворот на этом рынке, причем, отнюдь не благодаря созданию нового вида машин. Никто не собирается изобретать автомобиль заново. Просто технологии на сегодняшний день достигли такого уровня своего развития, когда их интеграция в современные авто поможет вывести привычные транспортные средства на новый уровень в плане управления с помощью разных гаджетов и оснащения их уникальными функциями, не доступными ранее. То есть, Apple и Google не просто работают над созданием собственных автомобилей. Они решили удивить потребителей высокотехнологической оснасткой, что и может помочь этим компаниям успешно конкурировать со своими продуктами на данном рынке.

Еще есть мнение, что подобные средства передвижения вполне могут предлагаться потребителям в качестве сервиса, возможно, в аренду, вместо продажи. То есть, вместо того, чтобы приобретать в салоне машину с логотипом Apple или Google, клиент подыскивает для себя ближайшую по территориальному местоположению с помощью специализированного приложения. И соответственно, вместо того, чтобы быть универсальным транспортом, авто такого плана, вероятно, будут создаваться для определенных целей и сценариев, а оплачивать услугу можно будет по мере использования или на основе подписки. Так, одна версия машины может работать как такси для городских жителей, другая будет предназначена для более дальних переездов, а третья — для путешествий. Обычно для таких целей, в зависимости от стиля жизни и необходимости, выбирается либо седан, либо внедорожник. В случае с сервисами от Apple или Google пользователю вообще не понадобится владеть авто, он сможет выбрать нужный тип транспорта в зависимости от планов и необходимости.

Такой подход не просто открывает перед потребителями новые возможности мобильности. Он также поможет новичкам в автоиндустрии избежать подводных камней в этой области. В рамках описанного сервиса производители могут выпускать меньше автомобилей, чем любой другой автомобильный бренд. При этом все авто смогут функционировать по максимуму, они останутся на ходу, а не будут простаивать на стоянках большую часть времени, как сегодня это происходит с многими транспортными средствами.

Еще один плюс в данной модели ведения бизнеса в том, что сама организация производства должна быть более простой. Во-первых, потому что нужно выпускать меньшее количество машин. Во-вторых, поскольку само производство электромобилей проще, чем сборка обычных авто. Наконец, такой подход подразумевает в себе сервисную основу, и производителям не потребуется поддержка дилеров, занимающихся собственно продажами. Это позволит сэкономить огромные суммы, обычно затрачиваемые на организацию сотрудничества с дилерскими компаниями. То есть, в этом свете, при условии оптимизации производства и поставки услуги, решение технологических гигантов из Кремниевой Долины (Apple и Google) по покорению автомобильного рынка кажется не такой уж утопией.

Каждая из компаний — как Apple, так и Google — представляют реальную угрозу индустрии производства автомобилей, причем по-своему. У Google есть многолетние наработки и исследования, а также реальные успехи в разработке беспилотного транспортного средства. Это грозит перевернуть принципы производства машин чуть ли не с ног на голову. Компания из Купертино может брать новый рынок силой своего бренда. Ведь в то время как конкуренты с трудом справляются с производством уникальных, крутых продуктов, Apple заработала себе репутацию именно способностью разрабатывать качественные и революционные гаджеты. К тому же есть мнение, что как раз покорение автопрома — это хороший шанс для лидеров-преемников Стива Джобса доказать, что и без него компания способна вновь творить историю, совершая перевороты на новых рынках. Ведь если Apple сможет и здесь реализовать свой известный принцип «

Это просто работает!» («It Just Works!»), то у нее есть все шансы изменить отношение людей к владению автомобилем, заставить их пересмотреть такую необходимость в принципе.

Какой бы радужной не казалась подобная перспектива, все равно у технологических компаний есть масса препятствий в сфере автопрома, даже невзирая на их успехи в разработке и исследовании этой области. Что до Apple, ей даже далеко до Google с наработками интернет-гиганта в сфере беспилотных автомобилей. (В частности, беспокойство вызывают трудности, с которыми в свое время столкнулась Apple, создавая собственные Карты.) С другой стороны, при всех своих успехах Google все еще не готова запустить коммерческую беспилотную машину в массы. В первую очередь, потому что продукт еще не прошел проверку неблагоприятными условиями эксплуатации. К тому же с законодательной точки зрения правила вождения беспилотного авто до сих пор не разработаны. Производители автомобилей сами еще раздумывают, интегрировать ли им в свои продукты функцию беспилотного управления. В этом свете, кажется, что данный продукт Google еще не скоро поступит в массовую продажу.

Невзирая на все возможные препятствия и трудности, гиганты из Кремниевой Долины все же твердо решили представить потребителям оригинальный транспортный сервис, который станет альтернативой личному владению автомобилем. В стремлении реализовать эту идею сегодня трудятся две крупнейшие технологические фирмы Штатов, и производители автомобилей уже должны быть начеку. К тому же компания Tesla уже доказала, что стартапы способны производить одобренные общественностью конкурентные продукты в индустрии, где требуется консолидация сил, и где не принято рассматривать новые угрозы со стороны новоприбывших конкурентов.

Напомню, что и Apple, и Google запланировали выпуск своих новинок в автомобильной индустрии на 2020 год. Так что у традиционных производителей в автопроме есть один полный цикл изготовления продукта, в рамках которого они могут среагировать на надвигающуюся угрозу. То, как они ответят на вызов технологических гигантов из Кремниевой Долины, и определит их собственное будущее, и будущее индустрии в целом.

[Bloomberg]

🤓 Хочешь больше? Подпишись на наш Telegram. … и не забывай читать наш Facebook и Twitter 🍒 В закладки iPhones.ru И снова Apple объявила о своих больших планах, на сей раз речь о покорении автомобильной индустрии. Производитель iPhone намерен составить конкуренцию Tesla, GM и к 2020 году выпустить собственный электромобиль. Как видите, технологические гиганты из Кремниевой Долины, причем не только Apple, решили триумфально ворваться в новую для них сферу. (Вспомните об успехах Google с ее…

Роман Юрьев

@bigbeastus

Дотошный блогер, гаджетоман, лысый и бородатый фитнес-методист. Увлекаюсь технологиями, спортом и диетологией.

До ←
Final Cut Pro X получил второй шанс в Голливуде благодаря фильму «Фокус»
После →
Почему iPod shuffle до сих пор рулит

Apple iCar – всё 🙁

Где-то прямо сейчас в своем роскошном кабинете сотрясается в приступе безудержного смеха Элон Маск. В штаб-квартирах GM, Toyota и Volkswagen усталые, но довольные манагеры утирают пот со лба и названивают друг дружке с радостной вестью: «У них не получилось! Слышал уже?! Ни фига не вышло вообще!». Короче говоря, конкуренты ликуют: по информации из заслуживающих доверие источников, компания Apple прекратила разработку своего невероятно распиаренного, мегакрутого и гиперожидаемого автомобиля. Да, похоже, что Apple iCar — все. Рест ин пис, бейби…

Нет, конечно с самого начала весь проект выглядел сверхамбициозно. Слишком. Чересчур. Автомобильная промышленность сама по себе слишком сложная и дорогая штука, чтобы давать надежды на успех игрокам, прежде с отраслью никак не связанным. И то сказать: можно ли представить, чтобы, скажем, Volkswagen вдруг решил выйти на рынок смартфонов и составить реальную конкуренцию тем же Apple и Samsung? Вообще-то говоря, у немцев мог бы получиться прикольный аппаратик — iBeetle 4G с двумя сцепленьицами (тьфу, сим-картами) и беспроводной зарядкой на трех каплях солярки.

Ну а если серьезно, мы уже довольно подробно рассказывали о проблемах и перспективах Apple iCar. Как видно наши предположения оправдались. Увы. Отсутствие опыта в создании автомобилей, чудовищные расходы на разработку модели с нуля, завышенные ожидания по прибыльности на и так более чем перегретом рынке плюс нежелание Apple привлекать к разработке автомобильную компанию в конце концов сделали свое дело. Орешек знаний оказался для таблеточных гуру слишком твердым… Жаль-жаль…

Теперь Appple спешно переводит сотни сотрудников, специально нанятых для разработки iCar, на другие проекты. Да, с мечтами о своем автомобиле «яблочникам» пришлось расстаться, но совсем уходить из автомобильной области фирма не намерена. Теперь работа будет сконцентрирована на разработке технологий автономного вождения и систем интеграции. Это, конечно, тоже неплохо. Но не идет ни в какое сравнение с крутостью так и нерожденного Apple iCar…

Источник: электрокар от Apple дебютирует в 2021 году

Источник на одной из тайваньских фабрик сообщил о том, что первый электрокар от Apple может выйти в сентябре 2021 года, что опережает изначальное расписание компании. Сможет ли автомобиль от купертиновцев вступить в соперничество с Tesla уже следующей осенью и зачем производителю электроники выходить на новый рынок — в материале «Газеты.Ru». Однако эксперты сомневаются в том, что выпуск автомобиля произойдет в следующем году, по их мнению, следует ожидать лишь анонс и концепт электрической машины.

Электромобиль от Apple может быть представлен уже осенью следующего года, сообщает портал MacRumors ссылаясь на анонимных руководителей тайваньских фабрик.

По сообщению портала, производители Тайваня готовятся к наращиванию производства частей Apple Car во втором квартале следующего года. Также сообщается, что Apple тайно тестировала прототипы автомобилей в Калифорнии. Apple получила разрешение от Департамента автотранспортных средств штата на тестирование самоуправляемых автомобилей в 2017 году, и в том же году она была замечена в использовании внедорожников Lexus, оснащенных лидарным оборудованием.

По словам авторитетного аналитика Мин-Чи Куо, специализирующегося на продуктах Apple, первый «яблочный» автомобиль будет выпущен между 2023 и 2025 годами.

Однако источники в Тайване утверждают, что компания готовит релиз уже к сентябрю следующего года, что значительно опережает расписание.

Стоит отметить, что автопроизводители часто анонсируют новые автомобили на годы вперед, и, вероятно, что электрический автомобиль от Apple будет только представлен в конце 2021 года, но не выпущен. Кроме того, релиз электрокара в сентябре 2021 года, даже если он был запланирован руководством компании заранее, может быть отложен из-за последствий пандемии коронавируса.

Помимо прочего, в этом месяце MacRumors сообщил, что в отчете DigiTimes утверждалось о предварительных переговорах Apple с поставщиками автомобильной электроники. Предполагается, что проект автомобиля все еще находится на довольно ранней стадии, что также ставит сентябрьский релиз под сомнение.

Между тем, очевидным остается лишь один факт: электрокару от Apple — быть, рано это случится или поздно. Аналитик «Фридом Финанс» Валерий Емельянов на вопрос о том, зачем Apple нужны автомобили, рассказал «Газете.Ru», что выход на новый рынок может удвоить годовую выручку компании.

«Более шести лет идут слухи о проекте Titan от компании Apple, с помощью которой компания теоретически ворвется в рынок автомобилей. Желание поучаствовать в этом сегменте вполне понятно. Это рынок объемом около $6 трлн. Для сравнения рынок смартфонов – меньше $1 трлн, где у Apple оборот не более $130 млрд. Даже если компания сумеет занять всего 5% рынка авто, это удвоит ее годовую выручку», — объяснил Емельянов.

Однако эксперт сомневается в том, что компания выпустит Apple Car в следующем году.

«Компания сейчас работает в основном над системами искусственного интеллекта для автопилота, что рынку известно давно: ее роботы колесят по Калифорнии не первый год. Но вот на то, что Apple активно готовилась к выпуску готового автомобиля, нет никаких намеков: ни заказов комплектующих, ни тендеров, ни контрактов с дилерами», — считает аналитик «Фридом Финанс».

Емельянов отмечает, что, если бы проект по созданию электрокара был в высокой стадии готовности, это невозможно было бы скрыть.

«Максимум нас ждет анонс и концепт электрического автомобиля. Не исключено, что суть проекта в итоге будет не в создании своего «железа», а в фирменной прошивке для электрокаров других фирм, которая будет объединяться в общую экосистему iOS», — заключил эксперт.

iCar или ябломобиль? Apple потеснит Tesla на авторынке

Apple к 2024 г. планирует выпустить электромобиль, построенный с использованием созданных компанией аккумуляторов, сообщило Reuters. Революционная технология является собственной разработкой Apple, пишет агентство, ссылаясь на осведомленные источники. Возможно, автомобиль будет беспилотным.

Разработки собственного автомобиля велись Apple с 2014 г. В 2018 г. к руководству проектом вернулся Даг Филд, который ранее работал в Apple, а затем на какое-то время уходил в Tesla.

Ключевым преимуществом Apple будет новая конструкция аккумуляторов, которая позволит радикально снизить их стоимость и увеличить запас хода автомобиля. По словам одного из источников, Apple планирует использовать уникальную «одноэлементную» конструкцию, которая увеличивает отдельные элементы в аккумуляторе и освобождает место внутри аккумуляторного блока. Что касается химического состава батареи, компания планирует использовать LFP, феррофосфат лития, который менее подвержен перегреву и более безопасен, чем другие типы литий-ионных батарей. «Это следующий уровень, — сказал источник Reuters о технологии аккумуляторов Apple. — Как в первый раз, когда вы увидели iPhone».

Как компания будет организовывать производство и налаживать цепочку поставок в совершенно новой для себя области, пока неизвестно. Предполагается, что сборкой автомобилей займется кто-то из партнеров, и компания не будет реализовывать весь проект самостоятельно. Возможно, Apple сосредоточит свои усилия на создании автономной системы вождения, и просто встроит ее в автомобиль от традиционного производителя — тогда новинка вряд ли получит название от «яблочного» бренда.

Два человека сообщили, что Apple привлечет внешних партнеров для создания элементов системы, в том числе лидарных датчиков, которые помогают беспилотным автомобилям получать трехмерное изображение дороги. С другой стороны, у Apple есть собственные разработки лидаров, которые используются в выпущенных в этом году iPhone 12 Pro и iPad Pro. Возможно, они тоже будут использованы в будущем автомобиле. Reuters ранее сообщало, что Apple вела переговоры с потенциальными поставщиками, и сейчас на новостях взлетели акции двух производителей лидаров: Velodyne прибавили 23%, Luminar — 27%.

Пока все это лишь предположения, озвученные людьми, которые попросили журналистов сохранить их анонимность. Разработки держатся в секрете, компания Apple отказывается от комментариев по поводу своих планов и будущих продуктов. Эти же источники сообщают, что Apple планирует выпустить собственный автомобиль к 2024 г., но из-за пандемийных проблем может сдвинуть начало производства на 2025 г. или более поздние даты.

Акции Apple прибавили 1,2%.

БКС Мир инвестиций

Дом учащейся молодежи «ИКАР» — Информационное бюро ICAR

Страница 1 из 2

Кинчик week

С 21 по 29 июня МБОУ ДО «Икар», в сотрудничестве с АНО «Центр Российского Кино» в г. Тольятти, открывает профильную смену “Кинчик week”для всех любителей создавать кино, медиа-продукты.

В программе смены разноплановая и креативная деятельность, самые трендовые инструменты создания и продвижения медиаконтента, а также:

• сценарное мастерство и операторское искусство
• продакшн: режиссура съёмок
• пост-продакшн: режиссура монтажа
• Soft Skills: предпринимательское и критическое мышление.

Режим профильной смены “Кинчик week” 21 июня — 29 июня 2021г

Экскурсия в Центр Российского кино в г. Тольятти

27 мая, в рамках сетевого межведомственного проекта» «Информбюро ICAR», учащиеся МБУ №№ 2 и 15 посетили «Центр Российского Кино» в Тольятти. Экскурсию провел педагог и креативный продюсер центра Никита Беляев. Он рассказал ребятам об истории создания киноцентра, а также о том, как снимались первые тольяттинские фильмы. Ребята и педагоги увидели короткометражный фильм одного из молодых тольяттинских кинорежиссёров, который стал победителем Самарского кинофестиваля. После просмотра ребята обсудили технические моменты, с которыми столкнулась съёмочная группа в процессе создания фильма. Все ребята ушли в хорошем настроении! Надеемся, что подобное мероприятие придаст вдохновения молодым энтузиастам, чтобы начать творить что-то своё.

Технополигон

С 24 по 26 мая в пансионате «Радуга» состоялась профильная смена «ТЕХНОПОЛИГОН», в которой приняли участие и обучающиеся МБОУ ДО «Икар», во главе с педагогом Никитой Беляевым. Программа смены была насыщенной: интересные и познавательные мастер-классы, игры и научные лекции информационной, творческой и технической направленностей. Наши ребята активно и слаженно проявили себя на смене, заняв 1-е место в квест-игре «Военный радист». Спасибо организаторам интересной и очень познавательной смены!

Молодежный форум «Мой район»

21 мая в рамках проекта «Информбюро ICAR» в МБОУ ДО «Икар» состоялся 2-й молодёжный медиа-форум «Мой район». Более 40 ребят из школ-участниц проекта приняли в нем участие. Для интеллектуальной разминки ребятам было предложено ответить на вопросы о мультфильмах в кино-квизе, с чем они успешно справились. За ограниченное время участники школьных медиа-групп создавали медиа-контент, посмотрели короткометражный фильм и получили домашнее задание. Медиа-группа из МБУ «Школа № 15», лучше всех проявившая себя в создании медиа-контента, получила сладкие призы.
В завершении форума была анонсирована профильная смена по кинопроизводству, которая пройдёт с 21 по 28 июня. Следите за нашими новостями на сайте и в паблике «Информбюро ICAR» и присоединяйтесь!

3 апреля в Доме учащейся молодёжи «Икар» прошёл молодёжный медиа-форум «Мой район». В форуме приняли участие более 40 ребят в возрасте от 12 до 17 из школ Комсомольского района №№ 2, 11, 14, 15, 80. В рамках форума профессиональные эксперты из сферы кино, медиа молодёжной политики провели мастер-классы и рассказали ребятам, как можно вместе сделать свой город лучше, как реализовать свои социальные проекты, как создавать интересный медиа-контент и продвигать его в социальных сетях. На форуме школьные медиа-группы смогли придумать свои истории и сюжеты. Получилось интересно! Теперь, в ближайшие полтора месяца, ребята будут активно готовиться к следующему медиа-форуму. Вместе с координатором этого медиа-процесса и педагогом Никитой Беляевым, ребята напишут сценарии и снимут свои репортажи, социальные ролики, чтобы на следующем форуме продемонстрировать их экспертам «Центра Российского Кино» в Тольятти.

Желаем успехов участникам школьных медиа-групп и ждём их новые медиапродукты!

HUFFINES CHEVROLET PLANO COLLISION CENTER

1001 Coit Road Plano, TX 75075
Телефон: (972) 867-4000

Понедельник — пятница: с 7:00 до 19:00

Суббота: с 8:00 до 13:00
Воскресенье: закрыто

ПОЧЕМУ HUFFINES COLLISION CENTER ?

THE HUFFINES COLLISION CENTER ИСТОРИЯ

НАГРАДЫ HUFFINES COLLISION CENTER — PLANO

Автосалоны Huffines помогли тысячам людей отремонтировать свои автомобили, и мы уверены, что сможем помочь вам.Компания Huffines обслуживает автомобильные нужды Северного Техаса с 1924 года. Если вам нужны услуги по предотвращению столкновений, посетите наш отмеченный наградами центр по предотвращению столкновений в Плано, чтобы получить наилучшую возможную работу.

Наши технические специалисты упорно трудятся, чтобы предоставить вам лучший сервис, и это видно. Наш центр столкновений Plano был признан читателями газет DFW Community Newspapers и Dallas Morning News лучшими дилерами новых, бывших в употреблении, обслуживанием и запчастями и кузовными цехами в округах Дентон и Коллин. Наши автомастерские каждый год с 2008 года удостаиваются награды «Выбор потребителей за превосходство в бизнесе», «Группа автодилеров года».Dallas Morning News ежегодно с 2011 года выбирает автосалоны Huffines в список 100 лучших мест для работы в DFW.

МЫ СЛУШАЕМ НАШИХ КЛИЕНТОВ

Когда г-н Хаффинс открыл первое представительство Huffines в 1924 году, он спросил его клиенты то, что они хотели в центре столкновений. Они сказали нам, что им нужен оценщик, который проявил бы к ним уважение. Кого-то, кто будет их слушать и представлять их и их семью в это напряженное время. Дружелюбный эксперт, который определит все повреждения, нанесенные их транспортному средству, и будет работать от их имени, чтобы исправить их.Наши клиенты также хотели, чтобы оценщик не срезал углы, но следил за тем, чтобы их автомобиль был восстановлен в исходное состояние как можно быстрее. Наконец, нашим клиентам нужен оценщик, который понимал бы, как отказ от использования транспортного средства повлияет на их семью, быстро восстановил бы их транспортное средство, но не жертвовал бы качеством или безопасностью ради эффективности. Наши клиенты говорили нам, что они хотят, и мы слушали, и наш отмеченный наградами центр управления столкновениями в Плано ежедневно отражает это стремление.

ПОМНИТЕ НАШ ЦЕНТР ПЛАНИРОВАНИЯ СТОЛКНОВЕНИЙ В СЛЕДУЮЩИЙ ВРЕМЯ, ЧТО ВАМ НУЖДАЕТСЯ КОРПОРАТИВНАЯ РАБОТА

Наш центр столкновений открыт с понедельника по пятницу с 7:00 до 19:00. и в субботу с 8.00 до 13.00 Нет необходимости в записи, просто приходите в удобное для вас время.

Оценки бесплатны.
Мы оформляем за вас все страховые документы.
Huffines предлагает трансфер, который доставит вас домой или на работу и заберет, когда ваш автомобиль будет готов.

iRacing: присоединяйтесь к нашей онлайн-лиге eSports Sim Racing сегодня

iRacing — ведущая гоночная игра-симулятор для вашего ПК.Разработанный как централизованная служба гонок и соревнований, iRacing организует, проводит и обслуживает онлайн-гонки на виртуальных трассах по всему миру. В быстро меняющемся мире киберспорта iRacing — это универсальный магазин для онлайн-гонок. Мы используем новейшие технологии, чтобы воссоздать нашу постоянно расширяющуюся линейку знаменитых гоночных автомобилей и трасс, не выходя из вашего дома. Смоделируйте то, что испытывает профессиональный водитель NASCAR в сиденье серийного автомобиля или гонщик Гран-при видит через приборную панель. Все детали складываются в модельный ряд автомобилей и трасс, которые практически неотличимы от настоящих.Это создает непревзойденное погружение, когда гонщики-симуляторы получают зеленый флаг в нашем онлайн-симуляторе гонок. Хотя iRacing по сути является онлайн-симулятором гонок, его ценность как учебного пособия не менее реальна. Лучшие сим-гонщики мира соревнуются в iRacing, и вы можете смотреть трансляции гонок в прямом эфире в iRacing eSports Network.

Откройте для себя лучшую гоночную онлайн-игру

Геймеры, желающие получить незабываемые впечатления от вождения в киберспорте, будут чувствовать себя как дома с iRacing. Соревнуйтесь с другими онлайн-гонщиками на всех легендарных гоночных трассах по всему миру с более чем 100 доступными трассами и 230 конфигурациями.В iRacing есть все гоночные трассы NASCAR, на которых можно соревноваться. Присоединяйтесь ко многим из наших гоночных онлайн-лиг в любой категории гонок, которую вы предпочитаете. Мы предлагаем гоночные лиги для NASCAR, Grand Prix, Sports Car и Dirt & Rally Car. Каждый начинает свою карьеру в iRacing как новичок — и все, что вам нужно для сезона новичка, включено в ваше членство. Вы можете участвовать в онлайн-гонках в официально организованных сериях, где iRacing устанавливает расписание и отслеживает очки чемпионата или настраивает свои собственные частные сессии.Создавайте индивидуальные гонки или создавайте лигу на весь сезон — выбор практически безграничен. Присоединяйтесь к десяткам тысяч участников нашего гоночного онлайн-сообщества. iRacing проводит шесть серий чемпионатов мира и ежегодно выплачивает денежные призы на сумму более 500 000 долларов США.

Гонка на ПК, как профи

iRacing — гоночная игра для ПК, которую используют как профессиональные водители, так и обычные игроки. Ищете ли вы лучшие онлайн-гонки на своем компьютере или предпочитаете соревноваться против себя и на время, iRacing поможет вам.Все, что вам нужно, чтобы начать гонку, — это компьютер, руль или контроллер и подключение к Интернету. Гоночная игра для ПК уже более 10 лет запускает серию профессиональных киберспортивных игр и ориентирована на развитие этой категории симуляторов.

Присоединяйтесь к iRacing сегодня!

Гонки NASCAR, грязь, ралли-кросс и многое другое. iRacing сотрудничает с ведущими игроками в автоспорте — NASCAR, USAC, World of Outlaws, IndyCar, IMSA и другими!

I’Car Systems | ПЕРВЫЕ ДАННЫЕ | Портфельная компания | Providence Equity | Providence Strategic Growth приобретает I Car Systems Datafirst Group | Новости

Callaway и Topgolf объединятся и создадут глобального лидера в сфере гольфа и развлечений

Компании с высокой степенью взаимодополняемости, охватывающие всю мировую гольф-индустрию на 80 миллиардов долларов (1)
Замечательная группа брендов, хорошо подготовленных для извлечения выгоды из потребительских тенденций на открытом воздухе
Объединенные компании создают четкую видимость для более чем 1 миллиарда долларов скорректированных EBITDAS
Callaway объявляет о рекордных предварительных результатах за третий квартал 2020 года

КАРЛСБАД, Калифорния.и ДАЛЛАС, 27 октября 2020 г. / PRNewswire / — Callaway (NYSE: ELY) и Topgolf Entertainment Group («Topgolf») объявили сегодня, что компании заключили окончательное соглашение о слиянии. Согласно условиям соглашения, Callaway и Topgolf объединятся в сделку по приобретению всех акций, создав мирового лидера в сфере гольфа и развлечений. Количество выпущенных акций основано на предполагаемой стоимости капитала Topgolf примерно в 2 миллиарда долларов, включая 14% акций, уже принадлежащих Callaway.

Topgolf — ведущая компания в сфере развлечений в гольф, основанная на технологиях, с инновационной платформой, которая включает в себя революционные площадки под открытым небом, революционную технологию Toptracer и инновационную медиа-платформу, занимающую особое место в киберспорте.В 2019 году выручка Topgolf составила около 1,1 миллиарда долларов, а с 2017 года он вырос на 30% в год. Callaway является лидером на мировом рынке оборудования для гольфа, занимая крупную позицию в производстве мягких товаров для активного образа жизни и доказав свою способность обеспечивать высокую прибыль. , включая рост компании, превышающий рост рынка гольфа в течение семи лет подряд.

Компании вместе смогут ускорить рост, в том числе за счет:

Полностью финансируемые возможности для быстрого роста : Topgolf — это быстрорастущая платформа с привлекательной юнит-экономикой для всех предприятий, которая получит выгоду от сильного финансового положения Callaway, которое может полностью финансировать планы роста Topgolf при привлекательной стоимости капитала.
Отлично дополняют друг друга : обе компании уделяют особое внимание потребителям гольфа и активному образу жизни. Благодаря 90 миллионам точек соприкосновения с потребителями Topgolf в год, объединенная компания получит выгоду от привлекательной семьи брендов с охватом через несколько каналов, включая розничную торговлю, заведения, электронную коммерцию и цифровые сообщества. Topgolf знакомит новых игроков с игрой в гольф, мощной тенденцией, которая приносит пользу компаниям Callaway, занимающимся оборудованием для гольфа и производством мягких товаров.
Расширенные ресурсы для ускорения роста : Ведущая в отрасли инфраструктура продаж, маркетинга и партнерства объединенной компании будет стимулировать посещаемость, увеличивать продажи на тех же площадках и ускорять преобразование новых бизнес-возможностей.Вместе, Callaway и Topgolf значительно расширили охват потребителей, что приведет к увеличению объема рекламы, распространения и продаж оборудования и одежды как среди игроков в гольф, так и среди игроков, не играющих в гольф.
Инновации для развития долгосрочного потенциала : Общая инновационная культура создает захватывающие долгосрочные возможности, включая возможность распространения контента на подключенных экранах для обучения, фитнеса и образа жизни.

«Вместе Callaway и Topgolf создают непревзойденный бизнес в сфере гольфа и развлечений, — сказал Чип Брюэр, президент и главный исполнительный директор Callaway.«Эта комбинация объединяет проверенных лидеров с общей страстью к предоставлению исключительных впечатлений от игры в гольф для всех — от элитных профессионалов туров до новые и целеустремленные участники игры. Мы давно убедились в ценности Topgolf и уверены, что вместе мы сможем создать более крупного и быстрорастущего мирового лидера в сфере гольфа и развлечений. Сильный финансовый профиль Callaway позволит объединенной компании ускорить внедрение инноваций, разрабатывать новые интересные продукты и опыт, а также создавать привлекательную ценность для акционеров, предоставляя преданным командам обеих компаний больше возможностей для демонстрации своих талантов и дополнительных возможностей.«

«Мы рады присоединиться к семье Callaway и усилить опыт, который мы создаем на стыке спорта и технических развлечений», — сказал Дольф Берле, генеральный директор Topgolf. «Благодаря огромной команде сотрудников и разнообразным предложениям на наших площадках, Toptracer и медиа-платформе Topgolf действительно меняет ландшафт отрасли, делая гольф более инклюзивным и доступным для людей всех возрастов, демографических групп и уровней квалификации. Являясь частью Callaway, мы планируем укрепить свои лидерские позиции, используя репутацию бренда Callaway, отношения с отраслью и финансовую мощь, чтобы соединить большее количество сообществ по всему миру с опытом Topgolf.«

Callaway впервые инвестировала в Topgolf в 2006 году, и с тех пор компании поддерживают тесные партнерские отношения, включая эксклюзивное соглашение о партнерстве в гольф на всех площадках Topgolf. Topgolf добился быстрого роста и активного взаимодействия с клиентами с момента своего основания в 2000 году благодаря нескольким платформам, в том числе:

Площадки — Фирменная платформа компании, определяемая ее захватывающим игровым процессом, запатентованными технологиями и местными высококачественными продуктами питания и напитками, предлагает уникальное социальное направление для всех.Площадки Topgolf с открытыми отсеками с климат-контролем имеют структурные преимущества, позволяющие извлечь выгоду из предпочтений потребителей в отношении активного отдыха. Topgolf имеет 63 филиала по всему миру, в том числе множество новых заведений, обслуживающих более 23 миллионов гостей в 2019 году, при этом более 50% потребителей считают, что не играют в гольф.
Toptracer — Ведущая технология отслеживания мяча, наиболее известная как трансформация телевизионного гольфа, теперь используется непосредственно в повседневном гольфе.Внедряя профессиональную технологию отслеживания в мобильные устройства и тренировочные площадки, Topgolf улучшает опыт игры в гольф. За три года технология была внедрена в более чем 7500 отсеков диапазона (что составляет примерно один процент проникновения от общего адресного рынка). Это бизнес-подразделение добилось роста выручки на 233% за последние три года.
Media — Благодаря World Golf Tour, ведущей мобильной игре в гольф с 28 миллионами участников по состоянию на 2019 год, Topgolf обеспечил сильное цифровое присутствие в игре в гольф.Собственные собственные игровые возможности компании также создают инновационные возможности для спонсорства и взаимодействия с потребителями во всем сообществе игроков Topgolf, конкурирующих на связанных между собой цифровых платформах и платформах для личного общения.

«С момента своего основания Topgolf создал инновационный, технологичный поворот в области тренировочного поля для гольфа, превратив его в глобальное развлекательное и спортивное движение. Наш опыт творчества и разнообразия предложений будет только укрепляться в рамках Callaway, мировой лидер в отрасли, — сказал Эрик Андерсон, исполнительный председатель Topgolf.«Все мы с нетерпением ждем возможности создавать новые впечатления, охватывать новую аудиторию и укреплять нашу цифровую инфраструктуру по мере того, как мы объединяем сообщества по всему миру».

Помимо Callaway, в настоящее время в состав Topgolf входят Providence Equity Partners, WestRiver Group и Dundon Capital Partners, которые добавили: «Это естественная комбинация, которая объединяет два взаимодополняющих бизнеса в центре одного из самых динамичных спортивных и развлекательных мероприятий. доступно сегодня.Мы рады поддержать их дальнейший рост как единой компании ».

Финансовые выгоды и структура сделки

Callaway и Topgolf показали сильные финансовые результаты непосредственно перед пандемией COVID и с тех пор оправились от ожиданий. Обе компании имеют хорошие возможности для использования как краткосрочных, так и долгосрочных изменений в поведении потребителей в результате пандемии. Это включает в себя благоприятные тенденции в количестве сыгранных раундов и рост числа начинающих и вернувшихся игроков в гольф, а также более широкие предпочтения потребителей в отношении активного отдыха.(2,3) Объединенная компания будет иметь очень диверсифицированную структуру доходов, включая оборудование для гольфа, 30%; Топгольф, 46%; и Softgoods, 24% (4).

Объединенная компания также выиграет от сильного финансового положения, в том числе:

Предварительная выручка в размере примерно 2,8 млрд долларов США по результатам 2019 финансового года, которая, как ожидается, вырастет примерно до 3,2 млрд долларов США к 2022 году и примерно 10% в год в следующие годы после
Скорректированная проформа EBITDAS в размере 270 миллионов долларов США на основе результатов 2019 финансового года, которая, как ожидается, вырастет примерно до 360 миллионов долларов США к 2022 году и на уровне подростков среднего и высокого уровня в год в следующие годы после
Кредитное плечо (5) примерно 3.6x в 2022 году, с возможностью снятия рычага с этого уровня

Topgolf находится на ранней стадии своего роста, имея более чем десять лет запланированных возможностей роста подразделений в своем бизнесе в сфере развлечений в США и всего 2% охватываемого рынка на международных площадках и 1% в бизнесе Toptracer Range. Компания доказала свою способность вводить новшества, чтобы расширить свой адресный рынок и использовать потенциал игр и контента на своей взаимосвязанной платформе.

Callaway продолжает стабильно генерировать денежные средства и обеспечивать достаточную ликвидность, в том числе более 630 миллионов долларов США наличными и доступными кредитными линиями по состоянию на 3 квартал 2020 года, что позволяет компании финансировать продолжающийся рост Topgolf со значительной способностью одновременно погашать задолженность.

Согласно условиям соглашения о слиянии, Callaway выпустит около 90 миллионов обыкновенных акций для акционеров Topgolf, за исключением Callaway, которому в настоящее время принадлежит примерно 14% находящихся в обращении акций Topgolf. По завершении слияния акционеры Callaway будут владеть примерно 51,5%, а акционеры Topgolf (за исключением Callaway) будут владеть примерно 48,5% объединенной компании на полностью разводненной основе.

Количество выпущенных акций основано на предполагаемой стоимости капитала Topgolf в 1 доллар.986 миллиардов (6) (включая позицию собственности Callaway). Количество выпущенных акций также основано на фиксированной цене обыкновенных акций Callaway в размере 19,40 доллара за акцию. Callaway возьмет на себя чистый долг Topgolf, который оценивается в 555 миллионов долларов на момент закрытия (7), в результате чего оценочная стоимость предприятия Topgolf составит примерно 2,5 миллиарда долларов.

Управление и лидерство

После закрытия Совет директоров объединенной компании будет состоять из 13 директоров, включая трех директоров, назначенных акционерами Topgolf.Чип Брюэр продолжит руководить объединенной компанией в качестве президента и главного исполнительного директора. Дольф Берле продолжит руководить бизнесом Topgolf в течение переходного периода после закрытия сделки, когда он намеревается уйти в отставку, чтобы использовать другие возможности для руководства. Джон Лундгрен останется председателем совета директоров объединенной компании, а Эрик Андерсон — заместителем председателя.

Topgolf продолжит работу из своей штаб-квартиры в Далласе, штат Техас.

Сроки и разрешения

Сделка подлежит одобрению акционеров как Callaway, так и Topgolf, а также других обычных условий закрытия, включая необходимое одобрение регулирующих органов. Стороны рассчитывают завершить сделку в начале 2021 года при соблюдении данных условий.

Callaway: предварительные результаты за 3 квартал и бизнес-новости

Чип Брюэр добавил: «Мир заново открывает для себя гольф, и это привело к рекордному кварталу для нашей компании.И наш бизнес по производству оборудования для гольфа и производства мягких товаров восстанавливается быстрее, чем мы ожидали, и наши прогнозы на третий квартал отражают эту динамику. Наши недавние инвестиции в наши возможности электронной коммерции оказались особенно ценными, продемонстрировав сильный рост во всех наших бизнес-сегментах в этом году, включая 108% -ный рост электронной коммерции для нашего сегмента мягких товаров в третьем квартале ».

На основании имеющейся на данный момент информации Компания оценивает следующие результаты за квартал, закончившийся 30 сентября 2020 г .:

(в миллионах долларов, кроме EPS)

Расчетный показатель за третий квартал 2020 года:
Чистый объем продаж: 476 млн долларов США
Годовой показатель: + 12%

Прибыль на акцию не по GAAP: $ 0.60
Год за годом: + 67%

Скорректированная EBITDAS *: 87 миллионов долларов
Годовой отчет: + 53%

* Прибыль до уплаты процентов, налогов, износа и амортизации и расходов на компенсацию акций

Консультанты

Goldman Sachs & Co. LLC выполняла функции финансового консультанта Callaway, а Latham & Watkins LLP — юридического консультанта. Morgan Stanley & Co. LLC и J.P. Morgan выступали в качестве финансовых консультантов, а Weil, Gotshal & Manges LLP — в качестве юрисконсульта Topgolf.

Предварительные финансовые оценки

За представленные выше предварительные оценки несет ответственность руководство, и они были подготовлены добросовестно и в соответствии с предыдущими периодами. Однако Компания не завершила процедуру закрытия финансовой отчетности за три месяца, закончившихся 30 сентября 2020 г., и ее фактические результаты могут существенно отличаться от этих предварительных оценок. Кроме того, независимая зарегистрированная аудиторская фирма Компании не проводила аудит этой информации и не завершала свои процедуры ежеквартальной проверки за квартал, закончившийся 30 сентября 2020 года, и не выражает мнения или какой-либо другой формы заверения в отношении этих предварительных оценок или их достижимости. .В ходе подготовки консолидированной финансовой отчетности Компании и соответствующих примечаний по состоянию на три месяца, закончившихся 30 сентября 2020 г., и за три месяца, закончившихся 30 сентября 2020 года, Компания и ее аудиторы могут выявить элементы, которые потребуют от Компании внесения существенных корректировок в представленные предварительные оценки. выше. В результате инвесторы должны проявлять осторожность, полагаясь на эту информацию, и не должны делать из этой информации какие-либо выводы относительно непредоставленных финансовых или операционных данных.Эти предварительные оценки не следует рассматривать как замену полной финансовой отчетности, подготовленной в соответствии с ОПБУ. Кроме того, эти предварительные оценки не обязательно указывают на результаты, которые должны быть достигнуты в любом будущем периоде. Инвесторам рекомендуется не полагаться чрезмерно на такие предварительные оценки.

Информация не по GAAP

Результаты GAAP, содержащиеся в данном пресс-релизе, были подготовлены в соответствии с общепринятыми в США принципами бухгалтерского учета («GAAP»).В дополнение к результатам по GAAP Компания предоставила определенную финансовую информацию не по GAAP, а именно:

EBITDAS. Компания предоставляет информацию о своих результатах без учета процентов, налогов, расходов на износ и амортизацию, а также расходов на неденежную компенсацию акций. Кроме того, EBITDAS исключает эти же статьи из прогнозируемой чистой прибыли. Долгосрочный прогноз по каждой из этих позиций невозможен без необоснованных усилий из-за изменчивости этих позиций и невозможности их предсказать с уверенностью.Соответственно, мы не проводили дальнейшей сверки EBITDAS с чистой прибылью по GAAP.

Кроме того, Компания включила в приложения к этому выпуску сверку информации, не относящейся к GAAP, с наиболее сопоставимой информацией GAAP. Информация, не относящаяся к GAAP, представленная в этом выпуске и связанных таблицах, не должна рассматриваться отдельно или в качестве замены каких-либо показателей, полученных в соответствии с GAAP. Информация, не относящаяся к GAAP, также может не соответствовать способу получения или использования аналогичных показателей другими компаниями.Руководство использует такую информацию, не относящуюся к GAAP, для принятия финансовых и операционных решений, а также в качестве средства для оценки сопоставлений периода с периодом и для прогнозирования бизнеса Компании в будущем. Руководство считает, что представление такой информации, не относящейся к GAAP, в сочетании с наиболее непосредственно сопоставимой информацией по GAAP, дает инвесторам дополнительную полезную сравнительную информацию при оценке основных показателей деятельности Компании в отношении этих статей.Компания предоставила сверочную информацию в прилагаемых таблицах.

О компании Callaway Golf

Callaway Golf Company (NYSE: ELY) — компания, специализирующаяся на оборудовании для гольфа и активном образе жизни, с портфелем мировых брендов, включая Callaway Golf, Odyssey, OGIO, TravisMathew и Jack Wolfskin. Благодаря непоколебимой приверженности инновациям, Callaway производит и продает клюшки для гольфа премиум-класса, мячи для гольфа, сумки для гольфа и повседневные сумки, одежду для гольфа и повседневную одежду, а также другие аксессуары.Для получения дополнительной информации посетите www.callawaygolf.com, www.odysseygolf.com, www.OGIO.com, www.travismathew.com и www.jack-wolfskin.com.

О Topgolf Entertainment Group

Topgolf Entertainment Group — это глобальное спортивно-развлекательное сообщество, основанное на технологиях, которое конструктивно объединяет людей через создаваемый нами опыт, инновации, которые мы отстаиваем, и то, что мы делаем. То, что начиналось как простая идея улучшить игру в гольф, превратилось в движение, в котором люди из всех слоев общества объединяются на стыке технологий и спортивных развлечений.Платформы Topgolf Entertainment Group включают площадки Topgolf, Topgolf International, Toptracer, Topgolf Media и Topgolf Swing Suite. Подпишитесь на @topgolf в Instagram, Facebook, Twitter и LinkedIn или посетите страницу Topgolf Press, чтобы узнать последние новости.

Контакты

для Callaway:
Брайан Линч
Патрик Берк
(760) 931-1771
[email protected]

Для Topgolf:
Кара Барри
[email protected]

Дополнительная информация и где ее найти

Callaway Golf Company подаст в SEC заявление о регистрации по форме S-4, которое будет включать заявление о доверенности Callaway Golf Company, которое также представляет собой проспект эмиссии Callaway Golf Company и заявление о запросе согласия Topgolf International, Inc.(«заявление о доверенности / проспект / запрос согласия»). ИНВЕСТОРАМ И АКЦИОНЕРАМ ПРИЗЫВАЕМ ВНИМАТЕЛЬНО ПРОЧИТАТЬ ЗАЯВЛЕНИЕ / ПРОГРАММУ / СОГЛАСИЕ И ДРУГИЕ СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ДОКУМЕНТЫ, БУДУЩИЕ ПОДАТЬ В СЕКУНДУ, В СООТВЕТСТВИИ С НИМИ, КОГДА ОНИ СТАНОВЯТСЯ ДОСТУПНЫМИ, ПОТОМУ ЧТО ИНФОРМАЦИЯ ОБЪЯВЛЯЕТ ИНФОРМАЦИЮ, ПРЕДОСТАВЛЯЮЩАЯ ИНФОРМАЦИЮ КОМПАНИИ ., ПРЕДЛАГАЕМАЯ СДЕЛКА И СМЕЖНЫЕ ВОПРОСЫ. Инвесторы и акционеры смогут получить бесплатные копии заявления о доверенности / проспекта / запроса согласия и других документов, поданных сторонами в SEC через веб-сайт, поддерживаемый SEC по адресу www.sec.gov. Кроме того, инвесторы и акционеры смогут получить бесплатные копии заявления о доверенности / проспекта / запроса согласия и других документов, поданных в SEC на веб-сайте Callaway по адресу https://www.callawaygolf.com (для документов, поданных в SEC через Отозвать).

Нет предложений или ходатайств

Это сообщение предназначено только для информационных целей и не предназначено и не представляет собой предложение о продаже или ходатайство о подписке или покупке, или приглашение к покупке или подписке на какие-либо ценные бумаги, или побуждение к голосованию в любом юрисдикции в соответствии с предлагаемой сделкой или иным образом, а также не допускается продажа, выпуск или передача ценных бумаг в какой-либо юрисдикции в нарушение применимого законодательства.Предложение ценных бумаг не может быть сделано иначе, как посредством проспекта, отвечающего требованиям Раздела 10 Закона о ценных бумагах 1933 года с поправками.

Участники конкурса

Callaway, Topgolf и их соответствующие директора и исполнительные должностные лица могут считаться участниками запроса доверенностей от акционеров Callaway в связи с предлагаемой сделкой. Информация о лицах, которые в соответствии с правилами Комиссии по ценным бумагам и биржам участвуют в привлечении акционеров Callaway и Topgolf, соответственно, в связи с предлагаемой сделкой, включая описание их прямых или косвенных интересов посредством залогового капитала или иным образом , будет изложено в заявлении о доверенности / проспекте / запросе согласия при его подаче в SEC.Информация о директорах и исполнительных должностных лицах Callaway содержится в Годовом отчете Callaway по форме 10-K за год, закончившийся 31 декабря 2019 г., и в его пересмотренном окончательном заявлении о доверенности в Приложении 14A от 27 марта 2020 г., которые подаются в SEC и могут быть бесплатно полученным из указанных выше источников.

Заявления прогнозного характера

Это сообщение содержит прогнозные заявления по смыслу Раздела 27A Закона о ценных бумагах 1933 года с поправками и Раздела 21E Закона о фондовых биржах 1934 года с поправками.Слова «может», «должен», «будет», «мог бы», «был бы», «предвидеть», «планировать», «полагать», «проект», «оценивать», «ожидать», «стратегия», «будущее», «вероятно» и подобные выражения, среди прочего, обычно обозначают заявления прогнозного характера, которые действительны только на дату, когда эти заявления были сделаны, и не являются гарантиями будущих результатов. Такие прогнозные заявления включают, но не ограничиваются ими, заявления о преимуществах сделки по объединению бизнеса с участием Callaway и Topgolf, включая ожидаемые операции, финансовое положение, ликвидность, производительность, перспективы или возможности роста и масштабирования Callaway, Topgolf или объединенная компания, стратегии, перспективы, планы, ожидания или цели менеджмента Callaway или Topgolf в отношении будущих операций объединенной компании, любые заявления относительно утверждения и закрытия слияния, включая необходимость утверждения акционерами и удовлетворение закрытия условия, а также заявления о убеждениях и любые предположения, лежащие в основе всего вышеизложенного.

Заявления о перспективах связаны с известными и неизвестными рисками, неопределенностями и другими факторами, которые могут привести к тому, что наши фактические результаты, показатели или достижения будут существенно отличаться от любых будущих результатов, показателей или достижений, выраженных или подразумеваемых в прогнозных заявлениях. Эти риски, неопределенности и другие факторы относятся, среди прочего, к: рискам и неопределенностям, связанным с нашим ожидаемым слиянием с Topgolf, включая невозможность получения или задержки в получении необходимого разрешения регулирующих органов, риск того, что такое разрешение может привести к наложению условия, которые могут отрицательно повлиять на Callaway или ожидаемые выгоды от предлагаемой транзакции, любую плату за прекращение, которая может быть выплачена Callaway в соответствии с условиями соглашения о слиянии, или невыполнение любого из условий закрытия предлагаемой транзакции в установленные сроки базе или вовсе; затраты, расходы или трудности, связанные со слиянием с Topgolf, включая интеграцию бизнеса Topgolf; неспособность реализовать ожидаемые выгоды и синергетический эффект от предложенной сделки в ожидаемые сроки или вообще; потенциальное влияние объявления, рассмотрения или завершения предлагаемой сделки на отношения с сотрудниками Callaway и / или Topgolf, клиентами, поставщиками и другими деловыми партнерами; риск судебных или регуляторных действий в отношении Callaway и / или Topgolf; невозможность удержать ключевой персонал; изменения в законодательстве или постановлениях правительства, влияющие на Callaway и / или Topgolf; неопределенность продолжительности, масштаба и воздействия COVID-19; дальнейшее распространение или обострение COVID-19; любые дальнейшие регулирующие меры, принятые в ответ на COVID-19, включая будущее закрытие или ограничение торговых точек Callaway или Topgolf, торговых центров, центров распределения, производственных предприятий или других объектов; эффективность защитного снаряжения Callaway или Topgolf, рекомендаций по социальному дистанцированию и других превентивных мер или мер безопасности; сбои в бизнес-деятельности Callaway и Topgolf в результате COVID-19, включая сбои в бизнес-операциях из-за ограничений на поездки, предписываемых государством или добровольных приказов о закрытии или карантина, или добровольного «социального дистанцирования», которое затрагивает сотрудников, клиентов и поставщиков ; постоянный рост, динамика и возможности в гольф-индустрии; задержки производства, закрытие производственных мощностей, торговых точек, складов и цепочек поставок и распределения; нехватка персонала в результате необходимости удаленной работы или иным образом; неопределенность в отношении глобальных экономических условий, особенно неопределенность, связанная с продолжительностью и воздействием пандемии COVID-19, и связанное с этим снижение потребительского спроса и расходов; а также экономические, финансовые, социальные или политические условия, которые могут отрицательно повлиять на Callaway, Topgolf или предлагаемую сделку.

Приведенный выше список не является исчерпывающим. Для получения дополнительной информации об этих и других рисках и неопределенностях, которые могут повлиять на эти заявления, гольф-индустрию и бизнес Callaway, см. Годовой отчет Callaway по форме 10-K за год, закончившийся 31 декабря 2019 г., а также другие риски и неопределенности, подробно описанные в время от времени в отчетах Callaway по формам 10-Q и 8-K, впоследствии поданных в SEC, включая заявление о доверенности / проспект / запрос согласия, которые будут включены в заявление о регистрации в форме S-4, которое будет подано в SEC в связи с предлагаемой сделкой.Читателям рекомендуется не полагаться чрезмерно на эти прогнозные заявления, которые действительны только на дату настоящего документа. Callaway не берет на себя никаких обязательств по повторной публикации пересмотренных прогнозных заявлений для отражения событий или обстоятельств после даты, указанной в настоящем документе, или для отражения наступления непредвиденных событий.

1 Отраслевой отчет Golf Datatech опубликован 21 сентября 2020 г.

2 Национальный фонд гольфа, августовские раунды игры, опубликовано в сентябре 2020 г.

3 Morning Consult Polling, опубликовано 21 июля 2020 г.

4 На основе прогнозов на 2022 год

5 без учета предполагаемого финансирования со стороны арендодателя

6 Предполагаемая стоимость собственного капитала в размере 1 доллар США.739 миллиардов с учетом различных привилегированных прав акционеров Topgolf, исключая предполагаемые опционы на акции и позицию собственности Callaway

7 Чистый долг Topgolf включает 152 миллиона долларов США, выделенных на финансирование условного арендодателя и 152 миллиона долларов США наличными

Доклиническая эффективность, безопасность и стабильный клинический процессинг клеток индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, производных от химерного антигипикан-3 рецептора, экспрессирующих природные киллеры / врожденные лимфоидные клетки

Cancer Sci.2020 Май; 111 (5): 1478–1490.

, ¹, ¹, ¹, ^1
, ², ¹, ¹, ¹, ³, ³, ⁴, ⁴, ⁴, ⁵, ³, ⁶, ³ и ¹

Тацуки Уэда

¹ Лаборатория Шин Канеко, Отдел клеточного роста и дифференциации, Центр исследования и применения iPS-клеток (CiRA), Киотский университет, Киото Япония,

Аяко Кумагаи

Shoichi Iriguchi

Ютака Ясуи

² Thyas Co.ООО, Киото Япония,

Тадайо Миясака

Кенго Накагоши

Казуки Накане

Кейго Сайто

³ Отделение иммунотерапии рака, Научно-клинический центр исследовательской онкологии, Национальный онкологический центр, Кашива Япония,

Мари Такахаши

Аки Сасаки

⁴ Департамент Life Science Frontiers, Центр исследования и применения iPS-клеток (CiRA), Киотский университет, Киото Япония,

Синсуке Ёсида

Наоко Такасу

Хироши Сено

⁵ Отделение гастроэнтерологии и гепатологии, Высшая школа медицины Киотского университета, Киото Япония,

Ясуси Уэмура

Кодзи Тамада

⁶ Кафедра иммунологии, Высшая школа медицины Университета Ямагути, Ямагути Япония,

Тэцуя Накацура

Шин Канеко

² Thyas Co.ООО, Киото Япония,

⁵ Отделение гастроэнтерологии и гепатологии, Высшая школа медицины Киотского университета, Киото Япония,

⁶ Кафедра иммунологии, Высшая школа медицины Университета Ямагути, Ямагути Япония,

Автор, ответственный за переписку.^* Переписка
Шин Канеко, Лаборатория Шин Канеко, Отдел клеточного роста и дифференциации, Центр исследования и применения iPS-клеток (CiRA), Университет Киото, 53 Кавахара-чо, Сёгоин, Сакё-ку, Киото 606-8507, Япония.
Электронная почта: [email protected],

Поступила в редакцию 28 ноября 2019 г .; Пересмотрено 7 февраля 2020 г .; Принято 2020 8 февраля.

Copyright © 2020 Авторы. Наука о раке , опубликованная John Wiley & Sons Australia, Ltd от имени Японской онкологической ассоциации.Это статья в открытом доступе в соответствии с условиями http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ лицензии, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно процитирована и не используется в коммерческих целях. Эту статью цитировали в других статьях в PMC.

Дополнительные материалы

Рис. S1

GUID: DECC619E-163F-4738-A225-096E686B35EE

Рис S2

GUID: 555D591F-CF53-4F4E-83F8-4E109C604000 9352000 GUID 9958C603A -427F-9C8E-BDCAF925655E

Рис S4

GUID: 3A7D5FE2-BD24-4CC0-9812-CD41A6D7A9EF

Рис S5

GUID: 7552296A-B091-543CE-BF2000

-43000

GUID: 7552296A-B091-53000

BE6E-4058-AD91-1E6151A7510E

Рис S7

GUID: 3DAC4D30-CC4B-4152-8F77-B294EC6291D7

Рис S8

GUID: D1F40794-CCE2-417A9-AB52000: D1F40794-CCE2-417A9-AB52 -095A-47E5-B116-A8DA50117CE8

Рис. S10

GUID: 63CEA286-1684-48D3-8ADA-A97DE087F792

Таблица S1

GUID: D893CD70-0B04-419B-B-B

54-DA

0 9105 использование аллогенных, плюрипотентных иммунных клеток, полученных из стволовых клеток, для • Иммунотерапия рака была предметом недавних клинических испытаний.В Японии скоро начнутся инициированные исследователем клинические испытания лечения рака яичников с использованием индуцированного лейкоцитарным антигеном (HLA) гомозиготного индуцированного плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК) анти-глипикана-3 (GPC3) рецептора химерного антигена (CAR), экспрессирующего естественные киллеры / врожденные лимфоидные клетки (NK / ILC). Использование плюрипотентных стволовых клеток в качестве источника аллогенных иммунных клеток способствует строгому контролю качества конечного продукта с точки зрения эффективности, безопасности и возможности производства. В этой статье мы описываем наши методы стабильного производства без фидера экспрессирующих CAR NK / ILC клеток из CAR-трансдуцированных ИПСК с клинически значимыми масштабами и материалами.Среднее количество клеток, которые можно было дифференцировать от 1,8–3,6 × 10 ⁶ ИПСК в течение 7 недель, составило 1,8–4,0 × 10 ⁹. Эти клетки продемонстрировали стабильную экспрессию CD45 / CD7 / CAR, эффекторные функции цитотоксичности и продукцию интерферона гамма (IFN-γ) против опухолевых клеток, экспрессирующих GPC3. Когда клетки CAR-NK / ILC вводили в GPC3-позитивную модель мышей с опухолью яичников и иммунодефицитом, мы наблюдали значительный терапевтический эффект, который продлевал выживаемость животных.Когда клетки вводили мышам с иммунодефицитом во время доклинических испытаний на безопасность, не наблюдалось острой системной токсичности или канцерогенности конечного продукта или остаточных ИПСК. Кроме того, обнадеживают результаты наших испытаний клеток CAR-NK / ILC, полученных в соответствии со стандартами клинического производства, и эти методы должны ускорить разработку методов лечения рака иммунных клеток на основе аллогенных плюрипотентных стволовых клеток.

Ключевые слова: химерный антигенный рецептор , GPC3, ILC, иммунотерапия, iPSC, NK

Abstract

Это трансляционное исследование было направлено на разработку анти-GPC3 CAR-экспрессирующих клеток NK / ILC, полученных из HLA-гомозиготного клона iPSC, в качестве эффективных клеточная терапия против диссеминированных опухолей яичников и оценка клинического производства клеток и доклинических аспектов терапии, включая безопасность и эффективность.Те аспекты терапии, которые были разъяснены в исследовании, обеспечивают перспективу для запланированного клинического испытания.

1. ВВЕДЕНИЕ

Природные киллеры (NK) — это подмножество врожденных лимфоидных клеток (ILC), которые оказывают прямое цитотоксическое действие на патогенные клетки, вызывая апоптоз. NK-клетки ощущают «чужой» или «потерявший себя» статус клеток-мишеней с помощью активирующих NK и ингибирующих NK рецепторов, соответственно, и отличаются от цитотоксических Т-клеток. NK-клетки были впервые идентифицированы в начале 1970-х годов у обеих мышей ¹ и люди, ² как новый тип лимфоцитов с сильной цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам и в настоящее время считается подмножеством ILC.³ Почти полвека с момента их идентификации возлагались большие надежды на их использование в иммунотерапии рака. Несмотря на огромное количество клинических исследований с участием различных типов рака, иммунотерапия на основе NK-клеток до недавнего времени не демонстрировала значительной клинической эффективности. Однако недавняя разработка IL-15-содержащих режимов для культуры NK-клеток ex vivo для увеличения пролиферации и продукции цитотоксических гранул улучшает терапевтическую эффективность иммунотерапии рака на основе NK-клеток.Кроме того, в этой области применяются новые технологии, в том числе технология химерных рецепторов антигена (CAR), которая была использована для повышения антигенной специфичности в NK-клетках, ⁴, ⁵, ⁶ и технологии плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать для регенерации ILC, включая NK-клетки, для неограниченного количества терапевтических клеток. ⁷, ⁸ Примечательно, что эти две технологии были объединены для регенерации CAR-экспрессирующих NK-клеток.⁹

Ранее мы сообщали об омоложении антиген-специфических Т-клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), ¹⁰ и продемонстрировали свой потенциал для иммунотерапии рака. В частности, мы использовали аллогенные клетки HLA homo-iPS, ¹¹, которые, как ожидается, станут не только универсальным источником продуктов для множества пациентов, но и платформой для техник манипуляции, таких как редактирование генома, для улучшения различных функций конечного продукта клетки.¹² Мы также сообщили о регенерации ILC из iPSC с помощью альтернативного, но прямого пути дифференцировки из CD7-позитивных клеток-предшественников NK / T-клеток. ⁸, ¹³ Индуцированный ILC обладал врожденными функциями, подобными лимфоидным клеткам, схожими с NK-клетками, полученными из PSC, о которых сообщали другие исследовательские группы. ¹⁴, ¹⁵

Было показано, что химерные антигенные рецепторы-Т-клетки обладают особой терапевтической эффективностью против злокачественных новообразований В-клеток; однако терапия с помощью CAR-T-клеток менее эффективна для солидных опухолей независимо от того, являются ли они первичными или метастатическими.Глипикан-3 (GPC3) представляет собой специфический для рака мембранный белок, который экспрессируется в гепатобластоме, гепатоцеллюлярной карциноме и светлоклеточной карциноме яичника, но практически не экспрессируется в нормальной ткани. С точки зрения нацеливания вне опухоли, GPC3 является отличной мишенью для иммунотерапии на основе CAR. Поскольку в ходе фазы I клинического испытания терапии анти-GPC3 CAR-T клетками при рецидиве рефрактерного рака печени не было выявлено побочных эффектов выше 3 степени (информация о клинических испытаниях: {«type»: «клиническое испытание», «attrs»: {«text «:» NCT02395250 «,» term_id «:» NCT02395250 «}} NCT02395250 ¹⁶), мы решили применить GPC3-CAR к клеткам NK / ILC, чтобы разработать безопасное и эффективное лечение локальных опухолей, экспрессирующих GPC3.Мы сосредоточились на диссеминированной светлоклеточной карциноме яичника, поскольку стандартная химиотерапия менее эффективна для рецидивирующих или рецидивирующих случаев.

Это трансляционное исследование было направлено на разработку анти-GPC3 CAR-экспрессирующих NK / ILC клеток в качестве эффективной клеточной терапии против диссеминированных опухолей яичников, а также на оценку производства клинических клеток и доклинических аспектов терапии, включая безопасность и эффективность. Те аспекты терапии, которые были разъяснены в исследовании, обеспечивают перспективу для запланированного клинического испытания.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Экспериментальная модель и детали предмета

2.1.1. Мыши

, использованные в этом исследовании, были самками мышей NOD-SCID IL2Rγc ^null (NSG) в возрасте от 6 до 12 недель, приобретенными у Oriental Bio для исследований эффективности без GLP, или самками мышей NOD.Cg в возрасте 6 недель. -Prkdcscid I12rgtm1Sug / ShiJic (NOG) мышей, приобретенных у In Vivo Science (Токио, Япония) для исследований безопасности GLP. Мышей содержали в контролируемых условиях, влажности и цикле свет / темнота в помещении, свободном от конкретных патогенов.Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Комитетом по этике Киотского университета.

2.1.2. Клеточные линии

Клетки JHH7 были приобретены в JCRB Cell Bank. KOC7c, SK ‐ Hep ‐ 1 и SK ‐ Hep ‐ 1, трансдуцированные GPC3 ¹⁷ были предоставлены доктором Накацура. Состояние микоплазмы клеток регулярно проверяли. JHH7, HepG2, KOC7c и SK-Hep-1 поддерживались в DMEM с добавлением 10% FBS.

QHJI ‐ iPSC, линия iPSC, полученная из клеток крови здорового человека, гомозиготного по наиболее распространенному типу HLA в Японии, поддерживалась на планшетах с покрытием iMatrix ‐ 511 (Matrixome) в среде StemFit AK03 (Ajinomoto) при 5% CO. ₂, при 37 ° C.

2.2. Иммунизация и конструирование фагмидной библиотеки иммунизированных антител

Для получения моноклональных антител, реактивных к GPC3, мы иммунизировали 6-недельных мышей SKG / Jcl (CLEA Japan) 100 мкл PBS, содержащего 50 мкг растворимого рекомбинантного GPC3 человека (R&D Systems ) для четырехкратной и повторной инъекции 2,5 × 10 ⁶ клеток SK-Hep-1, сверхэкспрессирующих GPC3 (SK-Hep-1-GPC3), для иммунизации (мыши SKG). Титры сыворотки оценивали с помощью ELISA и клеточного ELISA с использованием SK-Hep-1-GPC3.Лимфатические узлы собирали у иммунизированных мышей SKG с высоким титром антител. Тотальную РНК экстрагировали из лимфатических узлов и использовали в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК с олиго dT. Гены VH и VL амплифицировали отдельно и сливали с гибким линкером (Gly ₄ Ser) ₃ с помощью сборочной ПЦР. Полученный одноцепочечный Fv (scFv) вставляли в фагмидный вектор pTZ19R. Фагмиду scFv-cp3 вводили в штамм Dh22S Escherichia coli путем электропорации.Трансформированные E. coli были инфицированы вспомогательным фагом M13KO7 для получения фаговых частиц, отображающих scFv-cp3. Отбор фагов scFv-cp3 осуществляли путем биопэннинга с использованием 6 × His-tagged рекомбинантного GPC3, фиксированного с использованием набора Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown (Veritas). Окончательный биопэннинг проводили с использованием клеток JHH7. Чтобы выделить амино-конец GPC3-специфического антитела, анти-GPC3-антитела, включая GC33 и GC199, которые имеют С-концевые эпитопные антитела, были предварительно смешаны с GPC3-магнитными шариками во время биопэннинга.Последовательность клонов фага scFv анализировали с использованием BigDye ver3.1 (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом производителя. Аффинность связывания scFv с человеческим GPC3 определяли с помощью SPR (BIACORE T100), оценивали с помощью оценочного программного обеспечения Biacore X100 (версия 2.0.1) и анализировали с использованием набора для захвата мышиного IgG (GE Healthcare) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, антитело против GPC3 было захвачено антителом против Fc мыши на сенсорном чипе CM5 (GE Healthcare) на уровне захвата 100 RU.После этого взаимодействие с рекомбинантным GPC3 (системы R и D) было проанализировано в серии разведений от 47 до 380 нмоль / л с использованием времени ассоциации 120 с и времени диссоциации 600 с при скорости потока 60 мкл / мин при 25 ° С. ° C. Кривые связывания оценивали с использованием оценочной программы Biacore X100. Моновалентную модель связывания Ленгмюра использовали для расчета кинетических параметров связывания.

2.3. Создание лентивирусного вектора, кодирующего рецептор химерного антигена

Последовательность, кодирующая scFv против GPC3 в ориентации VH-VL, была получена на основе последовательности Ab (G2 scFV).Как показано на фигуре, scFv G2 был связан с шарнирной трансмембранной областью человеческого CD8α и внутриклеточными сигнальными доменами молекул CD28, CD137 и CD3ζ в тандеме с образованием конструкции CAR, а затем дополнительно связан с усеченным EGFR с помощью T2A для мониторинга экспрессии трансгена. Расширенная конструкция CAR была клонирована в pLVSIN, модифицированный промотором Ubc, для создания pLVSIN (G2 CAR) (Clontech).

Характеристика химерного антигенного рецептора (CAR) третьего поколения с помощью нового scFv, который эффективно связывается с N-концом GPC3.А. Схематическое изображение лентивирусного вектора, экспрессирующего G2 CAR. B-C, специфичность связывания антитела против GPC3 B. Антитело против GPC3 связывается с полноразмерным GPC3 и N-концевым фрагментом, но не с C-концевым доменом, экспрессирующим клетки 293T. C. Сродство связывания анализировали с помощью многоциклового метода измерения SPR. Антитело, зафиксированное на сенсорном чипе CM5, было связано с GPC3. D, Цитолитическая активность CAR-T-клеток против GPC3, специфичных для клеток SK-Hep-1-GPC3. CAR-T-клетки против GPC3 или нетрансдуцированные T-клетки совместно культивировали с GPC3-позитивными или GPC3-негативными SK-Hep-1 клетками при соотношении CAR-T к мишени 1: 1 или 1: 3 в течение 48 часов.Культивированные клетки собирали и анализировали проточной цитометрией для обнаружения CD45, маркера, экспрессируемого на Т-клетках, но не на опухолевых клетках-мишенях

2.4. Создание человеческих Т-клеток, экспрессирующих G2 CAR, с помощью ретровирусной трансдукции

Мы генерировали человеческие Т-клетки, экспрессирующие G2 CAR, с помощью ретровирусной трансдукции, как сообщалось ранее, ¹⁸ с некоторыми доработками. Вкратце, ретровирусный вектор MSGV1 для экспрессии G2 CAR был получен путем трансфекции плазмиды G2 CAR в линию упаковывающих клеток Ampho с последующим сбором культуральных супернатантов.Для трансдукции человеческих Т-клеток мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) культивировали в присутствии mAb против CD3 человека и IL-2, а затем дополнительно инкубировали с супернатантами, содержащими ретровирусный вектор G2 CAR, в присутствии RetroNectin. Мы центрифугировали и размножили клетки в присутствии IL-2, чтобы получить клетки G2 CAR-T.

2.5. Дифференцировка лимфоцитов от QHJI01s04, трансдуцированного G2-CAR,

QHJI01s04, трансдуцированного G2-CAR, была дифференцирована в гематопоэтический предшественник с помощью метода формирования эмбриоидных телец без кормления.Недифференцированные колонии T-iPSC обрабатывали TrypLE select (Gibco) в течение 8 минут, переносили на планшеты с низким прикреплением и инкубировали в течение ночи в Stemfit AK03N, содержащем 10 мкмоль / л Y-27632, для образования эмбриоидных телец (EB). EB были собраны и перенесены в среду EB (StemPro-34 [Invitrogen], 2 ммоль / л l-глутамин, 400 мкмоль / л монотиоглицерин, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты-2-фосфата и добавки инсулин-трансферрин-селен) и культивировали в присутствии 40 нг / мл hBMP ‐ 4, 10 нг / мл hbFGF и 50 нг / мл VEGF.На 4 день EB культивировали с коктейлем гемопоэтических цитокинов (50 нг / мл hSCF, 20 нг / мл hFlt3L, 20 нг / мл hIL-3 и 30 нг / мл TPO). На 14 день культивирования дифференцированные клетки переносили на планшеты, покрытые FcDLL4, и культивировали в присутствии коктейля цитокинов T-линии (10 нг / мл hFlt3L, 5 нг / мл IL-7). Через 21 день культивирования гемопоэтические клетки дифференцировались в CD7, CD45-позитивные клетки-предшественники лимфоцитов (iCAR-LPC). ICAR ‐ LPC были собраны и стимулированы к расширению с помощью PHA для создания iCAR ‐ NK / ILC.

2.6. Проточная цитометрия

Образцы окрашенных клеток анализировали с использованием проточного цитометра LSR или FACSAria II (BD Biosciences), а данные обрабатывали с помощью FlowJo (Tree Star). Для фенотипирования Т-клеток использовали следующие антитела: PE-EGFR (клон AY13; BioLegend), FITC-CD14 (клон HCD14; BioLegend), PacificBlue-CD235a (клон HI264; BioLegend), PE / Cy7-CD34 (клон 4h21; Abcam), APC-CD43 (клон 1G10; BD Bioscience), BV510-CD45 (клон HI30; BioLegend), APC-cy7-CD3 (клон UCHT1; BioLegend), BV421-CD4 (клон OKT4; BioLegend), FITC-CD5 ( клон UCHT2; eBioscience), CD7-APC (клон CD7-6B7; BioLegend), APC-CD8a (клон SK1; BioLegend), PerCPcy5.5-CD8 (клон SK1; BioLegend) и PE-Cy7-CD8β (клон SIDI8BEE; eBioscience).

2.7. Анализы высвобождения 51Cr

Мы выполнили анализы высвобождения 51Cr для оценки цитолитической способности эффекторных клеток. Опухолевые клетки-мишени загружали 1,85 МБк 51Cr в течение 1 часа, а затем 2500 опухолевых клеток совместно инкубировали с эффекторными клетками в течение 5 часов при соотношении эффектор-мишень (E: T) от 40: 1 до 5: 1. Собирали супернатанты и количественно определяли высвобождение 51Cr с использованием бета-счетчика. Процент лизиса рассчитывали как% лизиса = (экспериментальный лизис — спонтанный лизис) / (максимальный лизис — спонтанный лизис) × 100%, где максимальный лизис индуцировали инкубацией в 2% растворе Triton X-100.

2,8. Внутриклеточное окрашивание гамма-интерфероном

iCAR-NK / ILC совместно культивировали с облученным SK-Hep-1 или SK-Hep-1 o / e GPC3 в течение 5 часов в среде, содержащей монензин. После окрашивания поверхностных антигенов клетки фиксировали, пермеабилизировали и метили АРС-конъюгированными антителами против IFN гамма.

2.9. Биолюминесцентная визуализация

Мы обнаружили биолюминесценцию с помощью системы визуализации Xenogen IVIS (Xenogen), как описано ранее. Мы провели визуализацию через 10-15 минут после внутрибрюшинной инъекции люциферина VivoGlo (3 мг / мышь; Promega).

2.10. Модель in vivo

2.10.1. Модель животных с диссеминированием брюшины

В общей сложности 2 × 10 ⁵ трансдуцированных люциферазой клеток KOC7C вводили внутрибрюшинно. в мышей NSG с последующим i.p. инъекции 5 × 10 ⁶ клеток iCAR ‐ NK / ILC на 3, 7, 10, 14, 17 и 21 дни. Опухолевую нагрузку контролировали с помощью биолюминесцентной визуализации in vivo (система визуализации IVIS 100, штангенциркуль).

2.10.2. Модель теста на общую токсичность

В общей сложности 6 × 10 ⁷ iCAR-ILC вводили мышам NOG в дни 0, 3, 7, 10, 14 и 17, и мышей умерщвляли на 20 день.Следующие органы / ткани были собраны у всех животных, зафиксированы 10% раствором формалина с фосфатным буфером, залиты парафином, сделаны срезы и окрашены гематоксилином / эозином (H / E): головной мозг, мозжечок, спинной мозг (грудная клетка), седалищный нерв, глазное яблоко, зрительный нерв, железа Хардера, гипофиз, щитовидная железа, паращитовидная железа, надпочечник, селезенка, сердце, грудная аорта, трахея, легкое (включая бронхи), язык, пищевод, желудок, двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку, слепую кишку, толстую кишку, прямую кишку , подчелюстная железа, подъязычная железа, печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, почка, мочевой пузырь, яичник, матка, мокрота, молочная железа (пах), грудина (включая костный мозг), бедренная кость (включая коленный сустав и костный мозг), скелетные мышцы бедра, кожа (пах), тимус, подчелюстной лимфатический узел и брыжеечный лимфатический узел.

2.10.3. Модель теста на опухоль

Всего 1 × 10 ⁷ iCAR ‐ NK / ILC или 3,6 × 10 ⁵ G2 CAR QHJI ‐ iPSC # 22 вводили мышам NOG в день 0, и эти мыши были умерщвлены через 6 месяцев. . Используемые процедуры были такими же, как и для модели испытания на общую токсичность.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Характеристика CAR третьего поколения с помощью нового scFv, который эффективно связывается с N-концом GPC3.

Моноклональные антитела против GPC3

были получены с использованием библиотеки иммунизированных GPC3 антител и метода фагового дисплея.Связывание моноклональных антител с N-концом-мишенью было охарактеризовано с использованием полноразмерных GPC3 и N-концевых фрагментов линий клеток, экспрессирующих GPC3, и проанализировано с помощью FCM. Как показано на рисунке, антитело против GPC3 (Ab) было вновь идентифицировано как N-конец GPC3-специфического Ab, аффинность связывания которого составила 3,4 × 10 ^-8 моль / л с помощью SPR. Одноцепочечный Fc Ab (G2 scFv), созданный из аминокислотной последовательности Ab, был вставлен в CAR третьего поколения, ¹⁹, который состоит из шарнирной трансмембранной области человеческого CD8α и внутриклеточных сигнальных доменов молекул CD28, CD137 и CD3ζ.Чтобы подтвердить терапевтический потенциал scFv в CAR, ретровирусный вектор, кодирующий G2 scFv CAR, трансдуцировали в первичные Т-клетки человека для генерации G2 CAR-T-клеток, затем их совместно культивировали с GPC3-позитивным или GPC3-негативным SK-Hep- 1 в соотношении 1: 1 или 1: 3 CAR-T к опухолевым клеткам для оценки CAR-опосредованной целевой специфической цитотоксичности. Через 48 часов CD45-отрицательные опухолевые клетки почти полностью элиминировались при соотношении 1: 1 или значительно уменьшались при соотношении 1: 3, когда клетки G2 CAR-T совместно культивировали с GPC3-положительными клетками-мишенями (рисунок).Удаление опухолевых клеток не наблюдалось для GPC3-отрицательных клеток-мишеней, что указывает на GPC3-специфическую цитолитическую активность анти-GPC3 CAR-T клеток.

3.2. Модификация CAR против GPC3 и отбор HLA-гомозиготного клона iPSC для создания банка мастер-клеток в качестве источника NK / ILC-клеток, экспрессирующих iPSC,

Поскольку эффективное связывание и цитотоксическая функция G2 scFv CAR в отношении GPC3 -Экспрессирующие клетки были подтверждены, мы применили CAR к NK / ILC-клеткам, полученным из iPSC.Чтобы избежать генной инженерии с помощью инсерционных вирусных векторов на более поздней стадии производства, мы попытались создать банк мастер-клеток (MCB) клона iPSC, который эффективно экспрессирует анти-GPC3 CAR. Сначала мы трансдуцировали G2 scFv CAR и EGFR, несущие лентивирусный вектор (LVSIN [G2CAR], рисунок), в клоны iPSC, названные QHJI01s04, которые были получены из мононуклеарных клеток крови гомозиготного здорового донора по наиболее частому HLA в Японии. Клон QHJI01s04 был создан в клинически значимых условиях в учреждении клинической обработки клеток.QHJI01s04 трансдуцировали LVSIN (G2CAR) путем спиновой инфекции, что приводило к эффективности трансдукции CAR 71,9%, затем QHJI01s04, трансдуцированный G2 CAR, клонировали путем ограничивающего разведения. Поскольку экспрессия tEGFR варьировалась от клона iPSC к клону iPSC, мы выбрали шесть клонов, экспрессирующих самые высокие уровни tEGFR и маркеров плюрипотентности Tra1-60 и SSEA4 (рисунок S1). Затем мы дифференцировали все клоны в CD7-позитивные клетки T / NK-линии, чтобы выбрать клоны, которые могут лучше всего поддерживать экспрессию CAR в течение всего процесса дифференцировки.

Процедура дифференцировки состояла из трех этапов, представленных на рисунке: (а) этап дифференцировки гематопоэтических клеток-предшественников, (б) этап дифференцировки лимфоидных клеток-предшественников (ЛПК) и (в) генерация NK / ILC-подобных клеток и шаг расширения. На этапе 1 почти все клоны дифференцировались в CD34- и CD43-двойные позитивные гематопоэтические клетки-предшественники (рис. S2). На этапе 2 почти все клетки дифференцировались в CD45- и CD7-двойные положительные, но CD4- и CD8-двойные отрицательные клетки-предшественники T / NK-линии; однако уровни экспрессии tEGFR различались в шести клонах (рисунок S3).Затем клетки-предшественники культивировали совместно с облученными PBMC от донора для создания и размножения NK / ILC-подобных клеток с использованием фитогемагглютинина-P (PHA-P). Некоторые характеристики этих NK / ILC-подобных клеток, полученных из клонов ИПСК, были сравнены для определения лучших клонов для дальнейшего изучения, и клон № 22 QHJI01s04, трансдуцированный G2 CAR, был выбран как лучший клон ИПСК для доклинических и клинических исследований, поскольку об их превосходной способности к размножению и цитотоксичности полученных из клона ИПСК CAR-экспрессирующих NK / ILC-подобных клеток.(Рисунки [Ссылка], [Ссылка], [Ссылка]).

Клинически значимая манипуляция с анти-GPC3 28bbz QHJI-iPSC # 22 для создания iCAR-NK / ILC. A. Схема дифференциации анти-GPC3 28bbz QHJI-iPSC № 22 в iCAR-NK / ILC. Б. Проточно-цитометрический анализ дифференцированных клеток в конце первого этапа. В. Проточно-цитометрический анализ дифференцированных клеток в конце второго этапа. D, количество дифференцированных клеток на втором этапе. E, проточно-цитометрический анализ дифференцированных клеток в конце третьего этапа.F, номер ячейки iCAR ‐ NK / ILC на третьем этапе

3.3. Клинически значимая манипуляция для создания iCAR ‐ NK / ILC из G2 CAR QHJI01s04 # 22

Благодаря успеху клона № 22 мы создали основной банк клеток клона, который можно было бы использовать в доклинических испытаниях и клинических испытаниях. . Таким образом, клон № 22 был расширен и сохранен в центре обработки клинических клеток для терапии на основе iPS-клеток (FiT) в Университете Киото.

Перед тем, как перейти к производству клеток для доклинических исследований, мы изменили некоторые реагенты и материалы, используемые в протоколе дифференциации, чтобы они соответствовали нормативным стандартам Японии для сырья, полученного из живых организмов (Таблица S1).Несмотря на изменения, G2 CAR QHJI01s04 # 22 успешно дифференцировался в CD7- и CD45-двойные положительные клетки, далее называемые iCAR-LPC, и увеличился в 164 раза за счет CD34- и CD43-двойных положительных гематопоэтических клеток-предшественников (рисунок). Мы дополнительно расширили эти iCAR-LPC на облученных фидерах аллогенных РВМС с использованием PHA-P. При стимуляции почти все клетки сохраняли экспрессию как CD7, так и CD45 на протяжении всего процесса размножения (Рисунок,). Профили успешного расширения iCAR ‐ NK / ILC от iCAR ‐ LPC в трех испытаниях с использованием каждого донорского PBMC показаны в таблице.В большинстве случаев замороженные клетки iCAR ‐ NK / ILC сохраняли достаточную жизнеспособность во время транспортировки на место для доклинических испытаний, примерно в 500 км от производственного объекта, а также сохраняли количество клеток и жизнеспособность в течение 3 часов после размораживания при хранении. на льду до введения подопытным животным (таблица). Кроме того, мы разморозили хранимые iCAR-LPC, а затем протестировали их жизнеспособность и способность к расширению, чтобы определить их стабильность в жидком азоте (рисунки S7A-C).

Таблица 1

Профиль iCAR ‐ NK / ILC от iCAR ‐ LPC в трех испытаниях с использованием мононуклеарных клеток периферической крови разных доноров

907 Конец культуры × 10 ⁸%

	Лот 1	Лот 2	Лот 3
Всего живых клеток	1.8 × 10 ⁹	1,7 × 10 ⁹	1,7 × 10 ⁹
Живые клетки в пластине	1,1 × 10 ⁸	1,1 × 10 ⁸
Жизнеспособность	90%	84%	91%
Заморозка
Всего живых клеток	1,6 × 10 ⁹ 907 902 9016	2.5 × 10 ⁹
Жизнеспособность	92%	93%	86%
Размораживание
Жизнеспособность	89%	537 907 907 907 тест
Бактериальный, микоплазма, эндотоксин	Отрицательный	Отрицательный	Отрицательный

Таблица 2

Оценка жизнеспособности и стабильности iCAR ‐ NK / I4701 перед транспортировкой После транспортировки Жизнеспособность (%) Число клеток / мл Жизнеспособность (%) Число клеток / мл Лот 1 92 550 000 92 550 000 908 550 000 Лот 2 72 510 000 84 580 000 9070 2 Лот 3 98 600000 93 510 000

3.4. Клетки CAR-NK / ILC, полученные из G2 CAR iPSC # 22, эффективно подавляют рост опухоли, экспрессирующей GPC3, in vitro и in vivo

Чтобы исследовать, оказывает ли iCAR-NK / ILC, созданный с помощью протокола манипуляции клинического уровня, достаточное подавление опухоли на GPC3-экспрессирующие клетки in vitro, мы выполнили тест на высвобождение хрома ⁵¹ с использованием нескольких линий раковых клеток, экспрессирующих GPC3 (SK-Hep-Vector и SK-Hep-GPC3). Как было показано в предыдущих отчетах, ⁸ iCAR-NK / ILC убил не только линию клеток, экспрессирующих GPC3 (SK-Hep-GPC3), но также и линию GPC3-отрицательных клеток (SK-Hep-Vector) (рисунок), возможно, с использованием рецепторов NK, таких как NKG2A. , NKG2D, NKRP1, NKp30, NKp44 и DNAM1, которые были экспрессированы на iCAR ‐ NK / ILC (рисунок).Дополнительный цитолиз, наблюдаемый против GPC3-положительных клеток-мишеней по сравнению с отрицательными клетками, был оценен как следствие CAR-специфической цитотоксичности. По этой причине совокупная цитотоксичность iCAR-NK / ILC, которая складывалась из CAR-зависимой и CAR-независимой цитотоксичности, была оценена как более высокая, чем цитотоксичность первичных CD8 Т-клеток, трансдуцированных CAR (рисунок S8). Мы измерили продукцию IFN-γ, который является основным цитокином, продуцируемым NK-клетками. В совместном культивировании с GPC3-положительными опухолевыми клетками клетки iCAR-NK / ILC продуцировали значительно больше IFN-γ, чем клетки, культивированные с GPC3-отрицательными опухолевыми клетками (рисунок,).

Клетки iCAR ‐ NK / ILC, полученные из анти-GPC3 28bbz QHJI-iPSC # 22, эффективно подавляют рост опухоли, экспрессирующей GPC3, in vitro и in vivo. A, анализ высвобождения 51Cr in vitro для iCAR-NK / ILC, совместно культивируемых с SK-Hep-GPC3 или SK-Hep-Vector. n = 5 на балл. B. Экспрессия NK-связанных поверхностных антигенов анализировалась с помощью проточной цитометрии. C. Внутриклеточный IFN-γ iCAR-NK / ILC измеряли после совместного культивирования с SK-Hep-GPC3, SK-Hep-Vector или без клеток-мишеней. D, Сравнение продукции IFN-γ iCAR-NK / ILC с SK-Hep-GPC3, SK-Hep-Vector или без клеток-мишеней.E, F, G, Анализ in vivo iCAR ‐ NK / ILC в модели ксенотрансплантата NOD ‐ SCID IL2Rγc ^null (NSG). Партию из 5 × 10 ⁵ KOC7c инокулировали во внутрибрюшинную полость мышей NSG на день 0. Затем 5 × 10 ⁶ iCAR ‐ NK / ILC вводили во внутрибрюшинную полость на 3, 7, 10 дни. 14, 17 и 21. Бремя опухоли анализировали с помощью визуализации in vivo. E, Люциферазная визуализация мышей из каждой группы. F, сводка биолюминесценции от каждой группы. G, Каплан-Мейер анализ выживаемости мышей.* p <.05, ** p <.01, *** p <.001, **** p <.0001

Чтобы выяснить, подавляет ли iCAR ‐ NK / ILC рост GPC3-положительных опухолевых клеток in vivo, мы вводили iCAR-NK / ILC в брюшную полость модели внутрибрюшинного распространения GPC3-экспрессирующего рака яичников, KOC7c у мышей NOG. Многократные инъекции iCAR-NK / ILC подавляли внутрибрюшинный рост KOC7c значительно лучше, чем PBS, и продлевали выживаемость мышей (рисунок).

3.5. Отсутствие доказательств ICAR-NK / ILC-опосредованной токсичности и туморогенности в доклинических тестах in vivo

Указанная терапевтическая эффективность iCAR-NK / ILC при CAR-зависимой и CAR-независимой цитотоксичности вызвала опасения по поводу системной токсичности продукта . Кроме того, оставался потенциальный риск канцерогенности конечного продукта из-за злокачественной трансформации или загрязнения плюрипотентными стволовыми клетками во время манипуляции с клетками. Перед переходом к клиническим испытаниям необходимо адекватно оценить риски.

Мы провели цитокин-независимый анализ клеточной пролиферации для выявления злокачественной трансформации. В отличие от трансформированных клеток, iCAR-NK / ILC никогда не размножался в культурах без цитокинов (рисунок S9). Затем мы оценили загрязнение ИПСК в конечном продукте. МРНК одного из генов, связанных с плюрипотентностью, LIN28, конечного продукта была количественно определена с помощью кПЦР для выявления загрязнения недифференцированными iPS-клетками (рис. S10). По результатам мы оценили возможное загрязнение конечного продукта ИПСК менее 0.02%, что ниже минимального уровня обнаружения анализа. Основываясь на результате и запланированном количестве клеток для введения в клинических испытаниях, мы оценили максимальное количество зараженных iPS-клеток, которые будут введены пациенту. В случае шестикратной инъекции 3 × 10 ⁶ клеток / кг пациенту весом 60 кг расчетное максимальное возможное количество контаминирующих iPS-клеток составило 3,6 × 10 ⁵. Чтобы исследовать, могут ли недифференцированные клетки образовывать тератому in vivo, мы ввели 3.6 × 10 ⁵ G2 CAR-трансдуцированных QHJI01s04 во внутрибрюшинную полость 10 самок мышей NOG через запланированный путь инъекции для клинического исследования. Параллельно с оценкой онкогенности загрязненных ИПСК, мы внутрибрюшинно вводили 1 × 10 ⁷ клеток iCAR-NK / ILC 10 самкам мышей NOG для оценки риска злокачественной трансформации конечного продукта. В течение 26-недельного периода наблюдения никаких симптомов, связанных с онкогенезом, не наблюдалось у мышей любой когорты.Затем, на 26-й неделе после инъекции, всех мышей в обеих когортах умерщвляли и оценивали гистологическим анализом. Поскольку клетки iPS ‐ NK / ILC, iPS-клетки, трансформированные клетки и тератома не были обнаружены ни в одном образце эксперимента, мы подтвердили, что клиническая доза клеток iCAR-NK / ILC не содержала онкогенных клеток.

Острая цитотоксичность продукта, связанная с внутрибрюшинной инъекцией, была затем оценена путем инъекции максимальной терапевтической дозы iPS-NK / ILC клеток мышам NOG с коэффициентом безопасности 100.Всего 10 самкам мышей внутрибрюшинно вводили 6 × 10 ⁷ клеток iPS ‐ NK / ILC, разделенных на шесть инъекций в течение 3 недель. Количество клеток, введенных 20-граммовым мышам, соответствовало 3 × 10 ⁹ / кг для человека (т.е. в 1000 раз превышало терапевтическую дозу). Данные гематологического и биохимического анализов, полученные в течение периода наблюдения, и гистологические данные для 42 органов, полученные через 4 дня после последней инъекции, суммированы на фиг. Некоторый остаточный iCAR-NK / ILC наблюдался в сальнике, но не было значительных токсических эффектов по сравнению с контрольными мышами, что позволяет предположить отсутствие риска общей или острой токсичности продукта, включая тяжелую РТПХ.Кроме того, чтобы оценить риски нежелательного связывания продукта scFv с клетками человека, мы провели анализ перекрестной реактивности тканей с 20 образцами нормальной ткани взрослого человека. Мы не наблюдали значительной реактивности в нормальной ткани человека, как предполагалось в различных предыдущих отчетах о GPC3 ^.
20, ^{21 год} (данные не показаны).

Нет доказательств ICAR-NK / ILC-опосредованной токсичности или онкогенности в доклинических тестах in vivo. A, Схема теста на общую токсичность. B, фиксированные формалином и залитые парафином срезы сальника, окрашенные H&E для гистологического анализа.Окрашивание ядерными антителами человека проводили, чтобы отличить человеческие клетки от мышиных. C, Сводная таблица гистологических анализов

3.6. Дифференциация клеток iCAR-NK / ILC в установке для обработки клеток с использованием клинически значимых материалов и манипуляций

Для окончательной проверки перед переходом к стадии клинического исследования клиническая доза клеток iCAR-NK / ILC была обработана в установке для обработки клеток Киотского университета, согласно нормальному процессу обработки и используемым внутрипроизводственным испытаниям (рисунок).Партию из 2 × 10 ⁵ клеток клона № 22 ИПСК размораживали и высевали на шестилуночные планшеты, затем размножали для образования EB, начиная с 21 дня. EB на 35 день анализировали с помощью FACS для оценки количества HSC в культуре. . Согласно результатам проточной цитометрии 1,87 × 10 ⁶ эквивалентных клеток CD34 + 43 + (общее количество клеток: 2,16 × 10 ⁶, 86,8% CD34 + 43 +) были засеяны и культивированы на покрытых DLL4 планшетах в течение 21 дня. . В последний день культивирования DLL4 мы подтвердили, что дифференцирующиеся клетки имели фенотип iCAR-LPC, и мы культивировали их совместно с облученными здоровыми донорскими PBMC (альтернатива только в пилотных запусках PBMC, полученным от пациентов) для размножения и окончательного созревание до клеток iCAR ‐ NK / ILC.Подобно нашему предыдущему опыту производства клеток для доклинических испытаний, расчетное количество (3,3 × 10 ⁹) и качество клеток iCAR ‐ NK / ILC были успешно получены (рисунок).

Дифференциация клеток ICAR ‐ NK / ILC в центре обработки клеток с использованием клинически значимых материалов и манипуляций. A, Схема обработки ячеек iCAR ‐ NK / ILC. B, Проверка качества дифференцированных клеток во время клеточной обработки

4. ОБСУЖДЕНИЕ

С момента первого описания NK-клеток иммунные клетки постоянно разрабатывались для клинического применения в иммунотерапии рака в аутологичных или аллогенных условиях, и в настоящее время их насчитывается около 400 Во всем мире проводятся клинические испытания иммунотерапии на основе NK-клеток при различных типах рака.²² Несмотря на многочисленные продолжающиеся клинические исследования с участием NK-клеток и обширный репертуар отчетов об исторических исследованиях, инфузированные NK-клетки показали непродолжительную устойчивость, ограниченную пролиферацию и неточное нацеливание на опухоли у пациентов, что привело к низкой терапевтической эффективности. ²³, ²⁴, ²⁵, ²⁶, ²⁷ Однако недавние достижения в терапевтических технологиях, которые поддерживают противоопухолевые функции NK-клеток, такие как Fc-модифицированная антителозависимая клеточная цитотоксичность, ^{28 год}, ²⁹ модификация АВТО, ⁴, ³⁰ эффективное снабжение цитокинов, ²⁵, ³⁰ блокада ингибирующих рецепторов ^{31 год}, ³² и использование аллогенных NK-клеток, полученных из пуповинной крови с трансдукцией гена IL-15, ³³ повысили эффективность лечения NK-клетками.Технология ИПСК может обеспечить дополнительные преимущества для развития терапии NK-клетками за счет увеличения скорости, количества клеток и контроля качества аллогенного продукта, что может способствовать повышению терапевтической эффективности.

Клетки iCAR ‐ NK / ILC будут повторно вводиться в брюшную полость пациента для лечения диссеминированного рака яичников, экспрессирующего GPC3, в аллогенных условиях в рамках нашего запланированного клинического исследования. Стратегия локальной инъекции в перитуум CAR-модифицированных регенерированных NK-клеток может преодолеть естественные недостатки NK-клеток, такие как недостаточность самонаведения опухоли, селективности и продолжительности действия мишеней, при одновременном снижении риска нежелательных явлений, таких как цитокиновый синдром и CAR-опосредованные. нежелательная цитотоксичность как в отношении цели, так и вне ее.С этой точки зрения мы можем рассмотреть возможность совместного введения цитокинов или трансдукции генов цитокинов в iCAR-NK / ILC для дальнейшего повышения терапевтической эффективности. Даже в условиях, богатых цитокинами, теоретически iCAR-NK / ILC не вызывают РТПХ, поскольку они не экспрессируют аллореактивный TCR.

В этом трансляционном исследовании мы продемонстрировали возможность клинической дифференциации клеток iCAR ‐ NK / ILC и сопоставили доклинические данные по клеткам, облегчая переход на стадию клинических испытаний.Процесс дифференциации клеток iCAR-NK / ILC клинического уровня был установлен в отношении материалов, методов и техник манипуляции, в частности, в соответствии с японскими правилами регенеративной медицины. Кроме того, мы создали клон №22 ИПСК с трансдуцированным и расширенным с помощью CAR в MCB, который является исходным материалом для производства GMP в соответствии с руководящими принципами ICH-Q5A. Кроме того, этот метод позволил нам выполнить трансдукцию CAR и отбор клонов iPSC для создания банка исследовательских клеток в условиях, отличных от GMP, что позволяет регулярно использовать материал iPSC в исследованиях, сокращая затраты на рабочую силу и время без какого-либо негативного воздействия на безопасность конечный продукт.

Что касается управления качеством, одно из преимуществ использования дифференцированных клеток на основе iPS-клеток заключается в том, что клональные манипуляции с iPSC позволяют очень точно контролировать качество продукта, особенно на стадии генетической модификации. Фактически, ранее сообщалось, что вставка ретровируса рядом с протоонкогенами гемопоэтических стволовых клеток усиливала клональный лейкемогенез у пациентов с иммунодефицитом. ³⁴ В случае CART сообщалось, что TET2-мутированные клоны CD19 клеток CART стали доминирующими после инъекции пациенту, показавшему полную ремиссию лейкемии.^{35 год} Эти клоны с пролиферативным преимуществом in vivo обычно трудно обнаружить в продуктах поликлонально трансдуцированной клеточной терапии перед инъекцией. Следовательно, геномная характеристика и тесты безопасности, которые возможны с клоном ИПСК, способствуют более точной оценке риска конечного продукта.

В этом исследовании мы обнаружили, что противоопухолевая эффективность нашего продукта обусловлена как CAR-зависимой, так и CAR-независимой цитотоксичностью. Умеренный вклад G2-CAR в цитотоксичность частично объясняется выбором сигнальных молекул в CAR.Первоначально антитело против GPC3-CAR 28bbz третьего поколения, содержащее трансмембранный домен CD8a и сигнальные домены от CD28, 4-1BB и CD3z, было разработано для первичных Т-клеток. Недавно сообщалось, что полученные из ИПСК NK-клетки, вооруженные оптимизированным анти-мезотелиновым CAR, состоящим из компонентов рецептора NK-клеток, таких как трансмембранный домен NKG2D, сигнальный домен от 2B4 и CD3z, ингибируют рост опухоли, экспрессирующей целевую молекулу, значительно дольше, чем iPS-NK-клетки третьего поколения с анти-мезотелином CAR in vitro и in vivo.⁹ Результаты показали, что оптимальный выбор CAR для NK-клеток, возможно, также улучшил CAR-опосредованную цитотоксичность для NK / ILC-клеток, полученных из iPSC, в этом исследовании. Хотя нет доступных коммерческих продуктов, которые соответствуют японским стандартам для биологических ингредиентов, мы наблюдали возможность использования провоспалительных цитокинов, таких как IL-12 и IL-18, для увеличения пролиферативного и цитотоксического потенциала NK / ILC, полученных из ИПСК. ячеек (данные не показаны). На основании этих наблюдений мы предположили, что добавление провоспалительных цитокинов в процесс расширения конечного продукта может усилить его противоопухолевые функции; однако для их использования в клинических испытаниях требуются IL-12 и IL-18, которые соответствуют японским стандартам для биологических ингредиентов.

Частой проблемой в области клеточной терапии является выбор подходящих анализов для тестирования конечного продукта. Фактически, опыт, накопленный во время разработки терапии CART против CD19, показал, что тесты на цитотоксичность или выработку цитокинов в отношении линий лейкозных клеток, экспрессирующих CD19, in vitro никогда не позволяют правильно прогнозировать терапевтическую эффективность продукта. ³⁶ Таким образом, мы планируем использовать некоторые функциональные тесты в качестве эталонных тестов и использовать только несколько тестов для стандартных тестов, таких как стереотипность, количество клеток, жизнеспособность клеток, фенотипирование клеток с помощью проточной цитометрии и секреция IFN-g, до тех пор, пока эталонные тесты не станут достоверными. подтверждено, что он предсказывает реакцию иммунных клеток in vivo (таблица).

Таблица 3

Стандартные и эталонные тесты для конечного продукта

Coположительная культура клеток

	Тестовые образцы	Метод
Стандартный тест	Тест стерилизации	BacTpo7 ALERTia Тест на микоплазму	ПЦР
	Тест на бактериальный эндотоксин	Японская фармакопея
	Чистота ILC	Проточная цитометрия
	Чистота клеток EGFR 907 907 907 907 907 907	Проточная цитометрия или ИФА
	Номер клетки	Пятно трипановым синим
	Жизнеспособность клеток	Пятно трипановым синим или проточная цитометрия
	Контрольный тест	Скорость роста клеток	морилка трипановый синий или Thy анализ включения мидина
		Цитотоксичность in vitro	Тест высвобождения 51Cr
Экспрессия недифференцированного клеточного маркера		ПЦР (Lin28)

Таким образом, мы сообщили о создании надежного метода защиты GPC3 CAR-экспрессирующие iPSC-производные NK / ILC-клетки с использованием клинически значимых материалов и манипуляций.Кроме того, мы подтвердили различные аспекты терапевтического качества и безопасности конечного продукта. Наше исследование не только продемонстрировало возможность создания продукта (т.е., NK / ILC-клеток, экспрессирующих iPSC против GPC3 CAR), но также предоставило платформу для производства и контроля качества NK / ILC-клеток, полученных из iPSC, экспрессирующих различные виды АВТО.

РАСКРЫТИЕ ИНФОРМАЦИИ

Шин Канеко является основателем, акционером и главным научным сотрудником Thyas и получил финансирование исследований от Takeda Pharmaceutical, Kirin Holdings, Terumo, Tosoh, Sumitomo Chemical и Thyas.Тэцуя Накацура является акционером Killer T Save You. Коджи Тамада является акционером Noile ‐ Immune Biotech и получает гонорары за консультации и финансирование исследований от Noile ‐ Immune Biotech. Ютака Ясуи — сотрудник Thyas. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа была частично поддержана грантами 15H04655, 25293226 и 26293357 от: Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии; Проект развития инновационных исследований в области лечения рака, практических исследований инновационных методов борьбы с раком и основного центра исследований iPS-клеток Японского агентства медицинских исследований и разработок; и Фонд исследований Национального онкологического центра.Мы благодарим профессора Синья Яманака (Университет Киото) за критические советы для нашей исследовательской работы, докторов Изуми Ихара, Хироаки Судзуки, Хироки Маруяму, Муненори Нанао (КИРИН), Юити Хигути (Терумо), Юту Мисиму, Ван Бо и Хисаши Яно (Киото). Университет), г-н Шуичи Китаяма (Университет Киото), г-жа Йоши Таникава (KIRIN), Рэйко Сайкава (Тиас), Юхи Кумагири, Саяка Окамото, Каеде Макино, Санаэ Камибаяси, Эри Имаи, Хитоми Такакубо и Кацура Нода (Университет Киото) техническая помощь, а также доктора Тошихико Дои, Кеничи Харано, Дзюнъитиро Юда, Юкико Исигуро (Национальный онкологический центр) для планирования клинических разработок.Все исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и было разрешено институциональным советом по этике и ACUC Киотского университета.

Банкноты

Уэда Т., Кумагаи А., Иригути С. и др. Доклиническая эффективность, безопасность и стабильный клинический процессинг клеток индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, производных от анти-глипикан-3 химерного антигенного рецептора, экспрессирующих естественные киллеры / врожденные лимфоидные клетки. Cancer Sci. 2020; 111: 1478–1490. 10.1111 / cas.14374 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

ССЫЛКИ

1.Kiessling R, Klein E, Wigzell H. Естественные клетки-киллеры у мышей. Eur J Immunol. 1975; 5: 112-117. [PubMed] [Google Scholar] 2. Pross HF, Jondal M. Цитотоксические лимфоциты от нормальных доноров. Функциональный маркер не Т-лимфоцитов человека. Clin Exp Immunol. 1975; 21: 226-235. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Spits H, Artis D, Colonna M и др. Врожденные лимфоидные клетки — предложение единой номенклатуры. Nat Rev Immunol. 2013; 13: 145-149. [PubMed] [Google Scholar] 4. Чанг Й.Х., Коннолли Дж., Шимасаки Н., Мимура К., Коно К., Кампана Д.Химерный рецептор со специфичностью NKG2D усиливает активацию естественных клеток-киллеров и уничтожение опухолевых клеток. Cancer Res. 2013; 73: 1777-1786. [PubMed] [Google Scholar] 6. Чжан С., Оберой П., Эльснер С. и др. Клетки NK-92, сконструированные с помощью химерного антигенного рецептора: стандартный клеточный терапевтический препарат для целенаправленного уничтожения раковых клеток и индукции защитного противоопухолевого иммунитета. Фронт Иммунол. 2017; 8: 533. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Китайма С., Чжан Р., Лю Т-И и др. Свойства клеточного адъюванта, прямая цитотоксичность ре-дифференцированных инвариантных Vα24 NKT-подобных клеток из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток.Stem Cell Rep.2016; 6: 213-227. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Уэда Н., Уэмура Й., Чжан Р. и др. Генерация TCR-экспрессирующих врожденных лимфоидных хелперных клеток, которые индуцируют опосредованный цитотоксическими Т-клетками антилейкемический клеточный ответ. Stem Cell Rep.2018; 10: 1935-1946. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Ли Ю., Хермансон Д.Л., Мориарити Б.С., Кауфман Д.С. Полученные из ИПСК человека естественные клетки-киллеры, сконструированные с химерными антигенными рецепторами, усиливают противоопухолевую активность. Стволовая клетка. 2018; 23: 181‐192.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. Нисимура Т., Канеко С., Кавана-Тачикава А. и др. Создание омоложенных антиген-специфических Т-клеток путем перепрограммирования до плюрипотентности и повторной дифференцировки. Стволовая клетка. 2013; 12: 114-126. [PubMed] [Google Scholar] 11. Минагава А., Йошикава Т., Ясукава М. и др. Повышение стабильности рецепторов Т-клеток в омоложенных Т-клетках, полученных из ИПСК, улучшает их использование в иммунотерапии рака. Стволовая клетка. 2018; 23: 850-858. [PubMed] [Google Scholar] 12. Сюй Х., Ван Б., Оно М. и др.Направленное разрушение генов HLA с помощью CRISPR ‐ Cas9 генерирует ИПСК с повышенной иммунной совместимостью. Стволовая клетка. 2019; 24: 566‐578.e7. [PubMed] [Google Scholar] 13. Иригути С., Канеко С. На пути к разработке настоящей «готовой» синтетической Т-клеточной иммунотерапии. Cancer Sci. 2019; 110: 16-22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Croze RH, Buchholz DE, Radeke MJ, et al. Ингибирование ROCK увеличивает прохождение пигментного эпителия сетчатки, полученного из плюрипотентных стволовых клеток. Стволовые клетки Transl Med.2014; 3: 1066-1078. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 15. Hermanson DL, et al. Индуцированные естественные клетки-киллеры, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, для лечения рака яичников. Стволовые клетки. 2016; 34: 93-101. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Чжай Б., Ши Д., Гао Х. и др. Фаза I исследования Т-клеток, модифицированных химерным антигеном рецептора анти-GPC3 (GPC3-CAR-T), у китайских пациентов с рефрактерной или рецидивирующей гепатоцеллюлярной карциномой GPC3 + (r / r GPC3 + HCC). J Clin Oncol. 2017; 35: 3049. [Google Scholar] 17.Судзуки С., Йошикава Т., Хиросава Т. и др. Глипикан-3 может быть эффективной мишенью для иммунотерапии в сочетании с химиотерапией против светлоклеточной карциномы яичников. Cancer Sci. 2011; 102: 1622-1629. [PubMed] [Google Scholar] 18. Тамада К., Гэн Д., Сакода Ю. и др. Перенаправление генно-модифицированных Т-клеток на различные типы рака с использованием меченых антител. Clin Cancer Res. 2012; 18: 6436-6445. [PubMed] [Google Scholar] 19. Адачи К., Кано Й., Нагаи Т. и др. Экспрессия IL-7 и CCL19 в CAR-T-клетках улучшает инфильтрацию иммунных клеток и выживаемость CAR-T-клеток в опухоли.Nat Biotechnol. 2018; 36: 346-351. [PubMed] [Google Scholar] 21. Гао Х, Ли К, Ту Х и др. Развитие Т-клеток, перенаправленных на глипикан-3 для лечения гепатоцеллюлярной карциномы. Clin Cancer Res. 2014; 20: 6418-6428. [PubMed] [Google Scholar] 22. Дианат-Могхадам Х., Рокни М., Марофи Ф., Панахи Й., Юсефи М. Иммунотерапия на основе естественных клеток-киллеров: от трансплантации к нацеливанию на раковые стволовые клетки. J. Cell Physiol. 2018; 234: 259-273. [PubMed] [Google Scholar] 24. Чжан Ю., Уоллес Д.Л., де Лара С.М. и др.Кинетика естественных киллеров человека in vivo: эффекты старения, острой и хронической вирусной инфекции. Иммунология. 2007; 121: 258-265. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Бачанова В., Кули С., Дефор Т.Е. и др. Клиренс острого миелоидного лейкоза гаплоидентичными естественными клетками-киллерами улучшается при использовании слитого белка дифтерийного токсина IL-2. Кровь. 2014; 123: 3855-3863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 26. Миллер Дж. С., Суаньер Ю., Паноскальцис-Мортари А. и др. Успешный адоптивный перенос и экспансия гаплоидентичных NK-клеток человека in vivo у больных раком.Кровь. 2005; 105: 3051-3057. [PubMed] [Google Scholar] 27. Роми Р., Розарио М., Берриен-Эллиотт М.М. и др. Цитокин-индуцированные естественные клетки-киллеры, подобные памяти, демонстрируют усиленный ответ против миелоидного лейкоза. Sci Transl Med. 2016; 8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Raab S, Steinbacher J, Schmiedel BJ и др. Оптимизированные для Fc конструкции NKG2D-Fc индуцируют антителозависимую клеточную цитотоксичность NK-клеток в отношении клеток рака молочной железы независимо от статуса экспрессии HER2 / neu. J Immunol. 2014; 193: 4261-4272.[PubMed] [Google Scholar] 29. Снайдер К.М., Хуллсик Р., Мишра Х.К. и др. Экспрессия рекомбинантного высокоаффинного рецептора Fc IgG сконструированными NK-клетками в качестве стыковочной платформы для терапевтических mAb для нацеливания на раковые клетки. Фронт Иммунол. 2018; 9: 2873. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Mehta RS, Rezvani K. Химерный рецептор антигена, экспрессирующий естественные клетки-киллеры для иммунотерапии рака. Фронт Иммунол. 2018; 9: 1-12. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 31. Хсу Дж., Ходгинс Дж., Марат М. и др.Вклад NK-клеток в иммунотерапию, опосредованный блокадой PD-1 / PD-L1. J Clin Invest. 2018; 128: 4654-4668. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32. Андре П., Дени С., Сулас С. и др. MAb против NKG2A — это ингибитор контрольной точки, который способствует противоопухолевому иммунитету, высвобождая как Т-, так и NK-клетки. Клетка. 2018; 175: 1731-1743.e13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Лю Э., Дотти Дж., Шайм Х. и др. NK-клетки пуповинной крови, сконструированные для экспрессии IL-15 и CAR, нацеленного на CD19, проявляют долгосрочную устойчивость и сильную противоопухолевую активность.Лейкемия. 2018; 32: 520-531. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 34. Хасейн ‐ Бей ‐ Абина С., Фон Калле C , Шмидт М. и др. LMO2-ассоциированная пролиферация клональных Т-клеток у двух пациентов после генной терапии SCID-X1. Наука. 2003; 302: 415-419. [PubMed] [Google Scholar] 35. Fraietta JA, Nobles CL, Sammons MA и др. Нарушение TET2 способствует терапевтической эффективности Т-клеток, нацеленных на CD19. Природа. 2018; 558: 307-312. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Ли Й, Хо Й, Ю Л, Ван Дж.Контроль качества и доклинические исследования продуктов для CAR-T-клеток: общие принципы и ключевые вопросы. Инженерное дело. 2019; 5: 122-131. [Google Scholar] .