Шины, диски на Лада (ВАЗ) 2110 (LADA (ВАЗ) 2110)

Нижний Новгород, ул. Деловая, 7 +7 (800) 707-65-40

Нижний Новгород, ул. Ванеева, 209А +7 (831) 422-14-22

г. Нижний Новгород, ул.Переходникова, д.28/1 +7 (831) 422-14-20

Нижний Новгород, ул. Коминтерна, 39, к.1 +7 (831) 422-14-16

Нижний Новгород, ул.

Карла Маркса, 60в +7 (831) 422-14-15

Нижний Новгород, Комсомольское шоссе, 3б +7 (831) 422-14-23

Нижний Новгород, ул. Удмуртская, 10 +7 (831) 411-50-50, (831) 416-16-00, (831) 416-19-00

Нижний Новгород, пр. Гагарина, 37б +7 (831) 413-03-89

Нижний Новгород, ул. Дьяконова, 2г +7 (831) 414-65-76

г. Нижний Новгород, ул. Гаугеля 2А/2 +7 магазин: (831) 225-92-72, шиномонтаж: (831) 415-38-07

г. Нижний Новгород, ул. Юбилейная, 16а +7 (831) 413-38-16, (986) 763-34-03, (930) 66-86-777

Нижний Новгород, ул. Голубева, д. 7 +7 (831) 422-14-17

Нижний Новгород, ул. Фучика, д. 36

+7 (831) 422-14-18

Нижний Новгород, ул. Генерала Ивлиева, дом 24А +7 (831) 422-14-19

«Лада-21099» и «Лада-2110»: Две небольшие разницы

Выпускается ВАЗ-21099 с 1990 года, в 2004-м производство модели из Тольятти перевели в Запорожье. Ее наследник – ВАЗ-2110 продержался на тольяттинском конвейере с 1996 по 2008 год, после чего «переехал» в Черкассы (завод «Богдан»). При чем и на «ЗАЗе», и на «Богдане» сборка мелкоузловая.

Выпускается ВАЗ-21099 с 1990 года, в 2004-м производство модели из Тольятти перевели в Запорожье. Ее наследник – ВАЗ-2110 продержался на тольяттинском конвейере с 1996 по 2008 год, после чего «переехал» в Черкассы (завод «Богдан»). При чем и на «ЗАЗе», и на «Богдане» сборка мелкоузловая.

«Лада-21099» и «Лада-2110» базируются на единой платформе, за счет украинской сборки разница в цене двух поколений невелика (порядка 8000 грн.). Протестированные нами машины оснащены одинаковыми силовыми агрегатами – 1,6-литровым 8-клапанным двигателем с механической 5-ступенчатой коробкой передач. Моторы несложные, в меру мощные (80 л. с.) и тяговитые (120 Нм). По теперешним меркам, двигатели могли быть более экономичными и долговечными, зато обслуживаются они практически на любой СТО. Кроме того, «десятка» может быть оборудована таким же 1,6-литровым мотором, но с 16-клапанной головкой блока цилиндров. Он несколько мощнее (89 л. с., 131 Нм) и веселее крутится «на верхах», хотя сложнее в обслуживании и ремонте.

Коробка передач – без вариантов, это одна-единственная на все переднеприводные тольяттинские конструкции механическая «пятиступка». На обоих экземплярах мы отметили затрудненное включение заднего хода (что характерно для многих необкатанных автомобилей отечественного производства), а на «девятке» еще и ничем не приглушенное трансмиссионное подвывание на пятой передаче.

У «десятки» обновленное полумягкое торпедо с приборами от «Приоры», у «девятки» – «европанель» осовремененной формы из жесткого пластика.

Снаружи и внутри

Чем существенно отличаются две «сестры», так это кузовом. У «десятки» он более современный и внешне, и по множеству мелочей, определяющих уровень и класс автомобиля: шумоизоляция, вентиляция, уплотнение дверей. Но массивные неокрашенные бамперы «девяносто девятой» более практичны: они не боятся царапин, выдерживают легкие удары. Разница в клиренсе, хоть и незначительная (0,5 см), также говорит о большей практичности «21099».

Более высокий дверной проем (+1,5 см) «Лада-2110» облегчает посадку за руль, низкий порог багажника (74 см против 87 см у «21099») – погрузочные операции. Капот «десятки» удерживают газовые амортизаторы, а не длинная спица-подпорка, как у «девятки». Крышка багажника «Лада-2110» открывается не только по-старинке – ключом, но и поднимается сама по команде с кнопки, а в полу по бокам от запаски мы нашли съемные пластиковые емкости для мелочей. У «девяносто девятой» грузовой отсек чуть меньше (-23 л), но для его увеличения у обеих машин складывается задний диван. А у «десятки» есть еще и подлокотник, за которым лючок в багажник.

Наклон руля регулируется у обоих авто. Передние кресла «Лада-2110» с лучшей боковой поддержкой, но из-за меньшего диапазона регулировки они теснее для высоких людей. Кроме того, «десятка» впереди более узкая «в плечах» (-3 см). Обзорность лучше у представительницы старшего поколения, поскольку у нее тоньше стойки крыши. В «базе» обеих машин – центральный замок и передние электростеклоподъемники. У «десятки», кроме того, есть иммобилайзер и термостат-автомат отопителя, «противотуманки» и литые диски, у «девятки» – бортовая система контроля.

Ходовая обеих моделей создана для наших дорог. Но лучшая шумоизоляция «Лада-2110» обеспечивает больший комфорт.

Дверные карты обновлены в обеих моделях. Тканевая обивка «десятки» скучная на вид, зато обеспечивает лучшую шумоизоляцию.
Комплектация «Лада-21099» без особых излишеств. «Лада-2110» как более современная модель укомплектована богаче.

Поехали!

Звук работы агрегатов «десятки» тише и мягче по тембру, нет таких вибраций на рычаге КП и ручника, не «фонят» им в тон крупные пластиковые детали. Кроме того, обтекаемая «Лада-2110» создает меньше аэродинамических шумов на высокой скорости.

А вот в динамике и работе ходовой разница практически незаметна. В начале разгона обе «Лады» тянут уверенно, но «без огонька», и лишь с раскруткой мотора ускорение нарастает. Менее жесткий в передней части кузов «десятки» валко кренится в крутых поворотах. От «девятки» ожидаешь более острых реакций. Но в отличие от ВАЗ-2109 с кузовом хэтчбек «девяносто девятая» с ее тяжелой кормой на змейке не выявляет значительных преимуществ перед «десяткой». Однако для бюджетных машин важнее то, что их поведение даже при экстремальных маневрах понятно и предсказуемо.

Энергоемкие подвески украинских ВАЗов не боятся колдобин даже на высоких скоростях. При этом мелкие неровности часто передаются на кузов, а крупные легко гасятся. В целом более комфортной при проезде бугров и ям показалась ходовая «десятки», но, скорее всего, дело в лучшей шумоизоляции.

Восьмиклапанные моторы обеих «Лад» одинаковые, но у «десятки» он накрыт пластиковой крышкой. Под ней, кстати, при желании может быть и 16-клапанный агрегат.
Багажник «2110» больше, его порог ниже, в спинке дивана – лючок. У «21099» крышка открывается только ключом, у «десятки» – еще и кнопкой из салона.

Считаем отличия

Отличия, которые мы зафиксировали, таковы, что записывать их в актив или в пассив каждой модели – дело конкретного покупателя. То, что покажется недостатком одному владельцу, может обернуться плюсом для другого. Но есть две однозначно существенные «разницы»: простота и примелькавшийся облик «девятки» и более высокая цена «десятки». По нашему мнению, вот эта тысяча «зеленых» доплаты как раз и расставляет все по своим местам.

Вариации

Обе «Лады», кроме версии седан, имеют и другие варианты кузовов, причем каждая – свои. Черкасский завод «Богдан», помимо «десятки», выпускает «Лада-2111» с кузовом универсал, а в Запорожье производится 5-дверный хэтчбек «Лада-2109», родственный «девяносто девятой» модели.

Резюме «Автоцентра»

«Лада-21099»

Плюсы	Минусы
Доступная цена Больше пространства на передних сиденьях Практичные бамперы	Худшая шумоизоляция салона Приевшийся имидж модели

«Лада-2110»

Плюсы	Минусы
Более современная стилистика внешности и интерьера Богаче базовая комплектация Лучшая шумоизоляция	Выше цена Дороже кузовные детали

	«Лада-21099»	«Лада-2110»
Общие данные
Тип кузова	седан	седан
Габариты, Д/Ш/В, мм	4205/1650/1402	4265/1676/1430
База, мм	2460	2492
Клиренс, мм	170	165
Масса снаряженная/полная,кг	970/1395	1020/1495
Объем багажника, л	427	450
Двигатель
Тип	бенз. с распр. впр.	бенз. с распр. впр.
Расп. и к-во цил./кл. на цил.	R4/2	R4/2
Объем, см куб.	1596	1596
Мощность, кВт(л. с.)/об/мин	59 (80)/5200	59 (80)/5200
Макс. кр. мом., Нм/об/мин	120/2700	120/2700
Трансмиссия
Тип привода	передний	передний
КП	5-ст. мех.	5-ст. мех.
Ходовая часть
Тормоза передние/задние	диск. вент./бараб.	диск. вент./бараб.
Подвеска передняя/задняя	независ./полузавис.	независ./полузавис.
Эксплуатационные показатели
Максимальная скорость, км/ч	165	170
Разгон 0–100 км/ч, с	14	13,5
Расх. трасса–город, л/100 км	5,7–9,1	6,0–10,0
Гарантия, лет/км	3/50 000	3/50 000
Мин. стоимость, грн.	58 600	66 500

Игорь Широкун
Фото Андрея Яцуляка

Редакция благодарит автосалон ­ «Автоцентр на Столичном» за предоставленные на тест автомобили

Модель, заменившая ВАЗ-2110, будет стоить около $10 тыс. :: Экономика :: РБК

Стоимость автомобиля «Лада-2170» составит от 8 до 10 тыс. долл., сообщили РБК в ОАО «АвтоВАЗ». По словам представителей предприятия, ОАО «АвтоВАЗ» в ближайшие годы намерено значительно упрочить свои позиции в данном ценовом сегменте, сохранив присутствие и в других рыночных сегментах.

«Лада-2170» является глубоко модернизированным вариантом автомобиля семейства 2110. Планируется, что на первом этапе данная модель будет выпускаться в счет «десятого» семейства, а затем должна будет полностью вытеснить «ВАЗ-2110» с конвейера. Промышленное производство «Лада-2170» планируется начать в 2005г.

Напомним, что вчера АвтоВАЗ объявил о прекращении производства модели «Лада-21093». Как сообщили в пресс-службе предприятия, последняя «девятка» сойдет с главного конвейера Волжского автозавода 31 марта 2004г.

Прекращение производства данной модели является очередным этапом реализации программы технического переоснащения производства и полной смены ныне выпускаемого модельного ряда, сообщил РБК представитель предприятия. Одновременно на заводе будет увеличен выпуск рестайлинговых вариантов хэтчбеков «Лада-114» и седанов «Лада-115» (семейство «Самара-2»). Это связано с тем, что покупатели все больше предпочитают автомобили семейства «Самара-2» их предшественникам.

Всего до конца года планируется произвести около 190 тыс. автомобилей «Лада-114» и «Лада-115». Отметим, что «Лада-21093» выпускается на Волжском автозаводе с 1987 года, и за 17 лет с конвейера сошло около 1,5 миллионов «девяток».

В дальнейшем сборка данной модели будет производиться только на украинском ЗАЗ, где организована сборка полного цикла, включая сварку и окраску. До конца этого года «АвтоВАЗ» планирует поставить на ЗАО «ЗАЗ» около 20 тыс. машинокомплектов «Лада-21093».

Слава в соцсетях: новой «Ладе» придумывали имя всем миром («Известия»)

«АвтоВАЗ» подвел итоги конкурса на название новой модели Lada, причем в каждой соцсети выбрали свой вариант. Как теперь назовут новинку и от чего это зависит. Кто придумывал название для «восьмерки» и как расшифровывается «Нива». В особенностях российского нейминга разбирались «Известия».

«АвтоВАЗ» выбрал победителя в каждой соцсети. «ВКонтакте» лучшим признали вариант Onega, в Faceebook – имя Slava, в Instagram – Alta, а в «Одноклассниках» – Lika. Это не первый раз, когда Волжский автозавод идет в народ.

Фиалка, я Сокол!

Имя для ВАЗ-2101 придумывали всем Союзом, читатели журнала «За рулем» прислали 50 тыс. вариантов на конкурс – «Сокол», «Фиалка», «Катюша», «Руслан», «Атаман», «Аргамак» и так далее. Встречались и странные имена – «Директивец», «Новорожец».

Было множество предложений назвать автомобиль «Лада», но в итоге на заводе склонились к варианту «Жигули», предложенным вазовским испытателем Алексеем Черным. И зря не послушали народное мнение – имя оказалось вычурным, а для некоторых зарубежных рынков еще и неблагозвучным.

«Можно себе представить, что получится, если выйдут в свет «Жигули»: «Наш завод приобрел пять «Жигулей»!» Или: «Я собираюсь купить «Жигулю»!» Или: «С невыразимым чувством радости сел я за руль своей «Жигули» (А может быть, «Жигулихи»), – писал возмущенный читатель журнала «За рулем».

В итоге для экспортных рынков ВАЗ-2101 переименовали в нейтральную Lada, а в народе машину прозвали «Единичкой», а позже «Копейкой».

Спутник, который не взлетел

Имя для первого переднеприводного автомобиля ВАЗ-2108 утвердил сам главный конструктор «АвтоВАЗа» Георгий Мирзоев.

«Дизайнеры дали на конструкторскую разработку графику с названием «Спутник». Мы разработали чертеж орнамента двери задка, принес я его на подпись к Мирзоеву и говорю ему: «Георгий Константинович, ведь название «Спутник» еще не утверждено». На что последовал ответ: «Пусть привыкают». И чертеж был подписан», – вспоминал конструктор Георгий Троицкий (цитируется по книге «Высокой мысли пламень»).

Современный на тот момент автомобиль, разработанный совместно с Porsche, вполне заслуживал такого названия.

«Для нашей страны это такой же повод для гордости, как первый спутник», – пишет Владимир Мельников из «Авторевю».

Однако имя «Спутник» не прижилось и в народе машину прозвали «восьмеркой» или «зубилом» – за странный «клюв» на решетке радиатора. Следующая модель – пятидверный хетчбэк-2109 получила новое название «Самара», которое затем распространили на всё семейство машин. Впрочем, параллельно машины продолжали неофициально именовать по индексу модели – «восьмеркой», «девяткой», а седан – «девяносто девятой».

В итоге следующее поколение вазовских машин осталось без дополнительного имени и называлось просто «десятым» семейством по индексу головной модели – седана 2110.

Нива и крокодил

Прототип внедорожника будущей «Нивы» испытатели прозвали «Крокодилом Геной» – за приземистый кузов зеленого цвета. Тем более что на заводе проходил испытания другой прототип «Чебурашка» – переднеприводная микролитражка.

Название «Нива» вообще появилось как аббревиатура из первых букв имен детей конструкторов Петра Прусова и Владимира Соловьева – Наташа, Ирина, Вадим, Андрей. Вазовцам даже пришлось обращаться за разрешением на завод «Ростсельмаш», который уже выпускал под именем «Нива» комбайн, но хлопоты того стоили. Название отлично подходило легковому внедорожнику и намекало на сельские просторы, основной регион его обитания. И оказалось очень успешным – «Нива» была единственной моделью Волжского автозавода, которую не именовали по индексу.

Концерн General Motors, заключая с «АвтоВАЗом» соглашение о совместном производстве внедорожника, приобрел и права на бренд «Нива». Таким образом, новая модель называлась Chevrolet Niva, а старую переименовали в Lada 4×4. Только в прошлом году «АвтоВАЗу» с выкупом американской доли в совместном предприятии удалось вернуть права на ставший легендарным бренд.

Надежда умирает первой

А вот минивэн «Надежда» –полноприводный однообъемник на базе «Нивы», в буквальном смысле не оправдал надежд. Силуэт машины стал развитием футуристических концептов ВАЗа, прозванных «бананами». Концепция полноприводного минивэна вообще была необычной для 1990-х, однако подвело исполнение.

Автомобиль готовили в крайней спешке и вместо первоначально задуманных узких фар наградили его четырьмя круглыми. За пучеглазость машину прозвали в народе «Надежда Константиновка», но рестайлинг ничего не изменил. Качество сборки хромало и перевешивало все связанные с практичностью машины плюсы. Кроме того, себестоимость минивэна оказалась очень высокой и в 2006-м ВАЗ свернул его производство, выпустив чуть больше 8 тыс. штук.

Изменить приоритет

 

В конце 2003 года все автомобили Волжского завода были переименованы из «ВАЗов» в «Лады». Появилось и новое имя – «Калина». Его придумал дизайнер машины Евгений Лобанов. Название звучало несколько наивно, но сочеталось с мягкими линиями кузова. С этого момента «АвтоВАЗ» снова почувствовал вкус к неймингу и поручил агентству BBDO Instinct придумать имя для рестайлинговой «десятки».

«Мало кто знает, что в 250 отобранных наименований для составления шорт-листа изначально не входило имя Priora. Но там был вариант Prioritet. Мне он показался неплохим, но длинноватым для написания на крышке багажника. Да и в сочетании с Lada Proiritet выглядел немного несбалансированным. Поэтому при составлении своего варианта шорт-листа я изменил Prioritet на Priora и направил коллегам из BBDO с соответствующими комментариями, – вспоминает бывший начальник управления по маркетингу «АвтоВАЗа» Александр Бредихин. Он отстоял свой вариант и Priora неожиданно для всех победила в фокус-группах.

 «Приора» создала стандарт для успешного имени «Лады» – слово с латинскими корнями из двух трех слогов и с окончанием на букву «а». Исключение из правил – модели, созданные на платформах Renault-Nissan, Xray и Largus.

Кроме того, название Priora без разночтений писалось латинским шрифтом, на который в к тому времени перешел ВАЗ.

Гранта, Веста и…

Неудивительно, что в очередном конкурсе «Народной машине – народное название» победил вариант Granta, предложенный Павлом Захаровым из Красноярска. Имя Vesta, за которое проголосовали несколько сотен участников конкурса, агентство BrandLab позже использует для следующей модели «АвтоВАЗа».

Как назовут новую модель Lada – «Слава», «Альта», «Лика» или «Онега». В пресс-службе «АвтоВАЗа» рассказали «Известиям», что передадут шорт-лист новых продуктовой группе, но будут ли они использоваться или нет, пока неизвестно.Кроме того, в мае российский автопроизводитель зарегистрировал в базе «Роспатента» три новых названия для своих моделей – Tensa, Forta и Kayna.

Может не понравится «Опелю»

Из выбранных в соцсетях имен разве что «Слава» вызовет вопросы, считает главный редактор «За рулем» Максим Кадаков. И действительно, непонятно, какая слава закрепится за новой моделью.

«Очень неплохо в таких случаях подходят географические названия. У людей меньше возможностей их коверкать. Например, Волга, Ока. Лада может быть «Онегой», – сказал Кадаков. По его словам, сейчас для названий автомобилей хорошо подходят и придуманные слова.

«Любое название нужно прокачивать через международные базы. Были случаи, когда что-то пришлось менять. Самый классический – с моделью Ижевского автозавода ИЖ «Орбита», который пришлось переименовывать в «Оду», потому что имя оказалось занятым, – рассказал «Известиям» автоэксперт Игорь Моржаретто.

Иногда проблемы случаются даже с отдаленно похожими названиями, как это было, например, с брендом Aurus. Так что имя Onega может не понравиться «Опелю», у которого есть в запасе Omega, а Alta – Suzuki с его Alto.

Максим Кадаков вспомнил недавнюю историю, когда Chery не дали зарегистрировать в России бренд Exeed, так как у Kia уже была модель Xceed. Пришлось писать название новой марки слитно: CheryExeed. Так что выбор имени для новой «Лады» теперь в руках юристов и маркетологов, считает Кадаков.

рассекречена первая информация о машинах, которые готовит АвтоВАЗ – Victory Key – АВТОПОРТАЛ

Поделись с друзьями

В настоящий момент компания «АвтоВАЗ» выпускает 6 моделей, одна из которых (Chevrolet Niva) перешла в полное владение тольяттинского автозавода только в конце прошлого года. Но в будущем этот перечень может расшириться на более чем 10 новых автомобилей. Об этом свидетельствуют опубликованные данные из закрытой базы Роспатента.

 

На протяжении с 2012 по 2016 годы компания «АвтоВАЗ» зарегистрировала несколько товарных знаков, которые могут быть использованы в качестве названий для будущих моделей Lada. Это не означает, что производитель действительно выпустит такие автомобили. Сами названия зарегистрированы про запас. Среди будущих моделей «АвтоВАЗа» могут появиться такие автомобили, как Quanta, Svoboda, Slavia, Ladoga и Fortuna. В 2015 году этот перечень пополнили товарные знаки Preosa, Intriga, X Path, Expira, XRave, Excide, XCite, Binar, Antiga. Чуть позднее в Роспатент поступила заявка на регистрацию названий Кам4атка, Onega и Kvest.

Если перечисленные товарные знаки ничего не говорят, то XRay X может указывать на то, что компания «АвтоВАЗ» рассматривает возможность расширения модельного ряда хэтчбека за счет некоей оригинальной модификации. Отметим, что и последнее предположение не указывает на вероятность появления нового автомобиля. Дело в том, что все названия зарегистрированы по широкому перечню продукции, одной из которых являются машины.

Патент на каждый товарный знак действует в течение 10 лет. То есть уже в 2022 году компании «АвтоВАЗ» придется подавать новую заявку на несколько ранее зарегистрированных названий. В прошлом году производитель запатентовал товарный знак New Horizons. Он используется компанией «АвтоВАЗ» в рекламных роликах. А для своих спортивных автомобилей производитель в том же году зарегистрировал название Lada Sport Line.

Что касается будущих новинок «АвтоВАЗа», то пока известно, что тольяттинский автозавод работает над глубокой модернизацией названной ранее Chevrolet Niva. Эта модель уже выпускается под маркой Lada. Чуть позднее российский рынок пополнит компактный минивэн Van, точные сроки выхода которого еще не озвучены. Продолжается работа и над текущими моделями Lada. В частности, уже в этом году на рынок должны поступить новые модификации Largus и Granta. Автор: Ф. Аверьев

Самые популярные модели Lada в 2019 году

В течение последних нескольких лет АвтоВАЗ практически полностью обновил свой ассортиментный ряд. Благодаря этому, российские автомобилисты получили возможность выбрать именно ту модель, которая соответствует их требованиям и доступному бюджету. Но стоит заметить, что вне зависимости от модели, все авто производства ВАЗа отличаются доступной стоимостью, стильным дизайном, надежностью, эргономичностью и безопасностью.

Если говорить о самых популярных моделях, то наибольшим спросом сегодня пользуются:

• Granta лифтбек;
• Vesta седан;
• XRAY кроссовер.

Granta лифтбек

Главным достоинством этой модели считается доступная стоимость. Благодаря своей цене, Granta лифтбек уже давно получила статус «народного автомобиля». Если говорить о других преимуществах, то стоит отметить высокий дорожный просвет (205 мм в ненагруженном состоянии). Такой показатель соответствует стандартам кроссоверов!

К положительным моментам также стоит отнести большой багажник и просторный салон. К слову, создатели этой модели, прежде всего, позаботились о комфорте водителя и пассажиров. Кроме просторного салона с мягкими сидениями, можно отметить наличие мощной климатической системы, мультимедийного центра с опцией HandsFrre, парктроника, а также удобных полочек и емкостей для различных мелочей.

Vesta седан

LADA Vesta седан является преемницей популярной «Приоры». Первая «Веста» сошла с конвейера в 2015 году и сразу же обрела статус одного из самых популярных российских автомобилей. К преимуществам этой модели, в первую очередь, стоит отнести элегантный и узнаваемый дизайн. При этом «Веста» великолепно подходит для российских дорог. Клиренс этого автомобиля равен 178 мм. Еще один большой плюс – это надежная подвеска.

XRAY кроссовер

Яркий и узнаваемый дизайн также характерен для модели XRAY кроссовер. Этот автомобиль создан для того, чтобы чувствовать себя максимально уверенно как на городских дорогах, так и на загородных скоростных трассах. К преимуществам этой модели также стоит отнести высокий уровень безопасности. Этому способствует функция ESC и интеллектуальная система управления. Благодаря этим качествам, LADA XRAY обеспечивает максимальную безопасность водителя и пассажиров даже в условиях заснеженной дороги.

Узнать подробнее об этих и других моделях из ассортиментного ряда АвтоВАЗа можно на сайте https://lada-forsage.ru/cars/.

Реально «Дикая»: В новом мистическом сериале играет модель, заживлявшая ожоги заклинаниями

Константин ГЛЫБА

Вчера 20:41

Лада Акимова — загадочная обладательница титула «Мисс Земля» и «Мисс Суперталант»

Фото канала «Суббота!»

Мало ли мы видели в эфире мистических и таинственных сериалов? «Гадалка», «Территория», «Игра на выживание», «По ту сторону смерти» и другие. Только вот играли в них обычно профессиональные актеры.

Фото канала «Суббота!»

Телеканал «Суббота!» пошел дальше в поисках правдоподобия. И снял в сериале «Дикая» про шувани (цыганскую ведьму) Раду потомственную знахарку и фотомодель Ладу Акимову из Казахстана.

Фотомодель Лада Акимова из КазахстанаФото: Instagram.com

Нет, девушка не зарабатывает тем, что читает заговоры и заклинает на денежные потоки. Но знакома с этой фольклорной техникой и даже применяла ее на практике во время учебы в Уральском государственном горном университете. А еще после бытовых травм.

— Об обрядах и магии я знаю от прабабушки и ее книг, — рассказывает Акимова. — Перед сдачей экзаменов в университете я обычно читала заговоры, чтобы все прошло успешно, а когда обжигалась — заговаривала ожоги, чтобы они быстрее заживали. Но, если знать, что делать, такой магией может пользоваться каждый из нас. Это не первый мой опыт работы в кино, но первая главная роль. Мне очень нравится процесс погружения в персонажа и сами съемки.

Кроме целебных навыков 23-летняя девушка, выросшая в Екатеринбурге, освоила и профессию модели — участвовала во многих конкурсах красоты и даже выигрывала титулы «Юная краса Екатеринбурга» (2016), «Краса России» (2016), огненную корону «Мисс Земля» (2017) и «Мисс Суперталант» (2019). Акимова снималась в горячих фотосессиях журнала Maxim, а сериал «Дикая» стал первой главной ролью девушки.

Лада Акимова участвовала во многих конкурсах красоты и даже выигрывала титулыФото: Instagram.com

По сюжету нового проекта главная героиня Рада, выросшая в мегаполисе переехала в лесную хижину, чтобы быть ближе к природе. Там она проводит мистические ритуалы, помогая тем, кто приходит к ней за помощью: умеет уберечь как от духов (ударение на первый слог) и от живых злодеев, желающих причинить вред.

«Дикая», «Суббота!», с 8 ноября по будням в 18.30, в выходные в 14.05

Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничением FRET

1

Страйер, Л. Передача энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Annu. Rev. Biochem. 47 , 819–846 (1978).

CAS Статья Google ученый

2

Ha, T. et al. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc. Natl. Акад. Sci. США 93 , 6264–6268 (1996).

CAS Статья Google ученый

3

Сакон, Дж. Дж. И Венингер, К. Определение конформации отдельных белков в живых клетках. Nat. Методы 7 , 203–205 (2010).

CAS Статья Google ученый

4

Торговец, К.А., Бест, Р. Б., Луис, Дж.М., Гопич И.В. & Eaton, W.A. Характеризация развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Proc. Natl. Акад. Sci. США 104 , 1528–1533 (2007).

CAS Статья Google ученый

5

Бест, Р. Б. и др. Эффект гибкости и цис- остатков в исследованиях одномолекулярного FRET полипролина. Proc. Natl. Акад. Sci. США 104 , 18964–18969 (2007).

CAS Статья Google ученый

6

WoŹź’niak, A.K., Schröder, G., Grubmüller, H., Seidel, C.A.M. & Oesterhelt, F. Одномолекулярный FRET измеряет изгибы и изгибы в ДНК. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105 , 18337–18342 (2008).

Артикул Google ученый

7

Hoefling, M. et al. Структурная неоднородность и количественное распределение эффективности FRET полипролинов с помощью гибридного атомистического моделирования и подхода Монте-Карло. PLoS ONE 6 , e19791 (2011).

CAS Статья Google ученый

8

Mekler, V. et al. Структурная организация холофермента бактериальной РНК-полимеразы и открытого комплекса РНК-полимераза-промотор. Cell 108 , 599–614 (2002).

CAS Статья Google ученый

9

Margittai, M. et al. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции обнаруживает динамическое равновесие между закрытой и открытой конформациями синтаксина 1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 , 15516–15521 (2003).

CAS Статья Google ученый

10

Andrecka, J. et al. Одномолекулярное отслеживание мРНК, выходящей из РНК-полимеразы II. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105 , 135–140 (2008).

CAS Статья Google ученый

11

Muschielok, A. et al. Система нанопозиционирования для структурного анализа макромолекул. Nat. Методы 5 , 965–971 (2008).

CAS Статья Google ученый

12

Чой, У. и другие. Одномолекулярная модель слитого комплекса синаптотагмин 1-SNARE, полученная из FRET. Nat. Struct. Мол. Биол. 17 , 318–324 (2010).

CAS Статья Google ученый

13

Brunger, A.T., Strop, P., Vrljic, M., Чу, С. и Венингер, К. Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J. Struct. Биол. 173 , 497–505 (2011).

CAS Статья Google ученый

14

Sabir, T., Schroder, G.F., Toulmin, A., McGlynn, P. & Magennis, S.W. Глобальная структура разветвленной ДНК в растворе, выявленная с помощью одномолекулярного FRET высокого разрешения. J. Am. Chem. Soc. 133 , 1188–1191 (2011).

CAS Статья Google ученый

15

McCann, J.J., Zheng, L.Q., Chiantia, S. & Bowen, M.E. Ориентация домена в N-концевом тандеме PDZ из PSD-95 сохраняется в полноразмерном белке. Структура 19 , 810–820 (2011).

CAS Статья Google ученый

16

Balci, H., Arslan, S., Myong, S., Lohman, T.M.& Ха, Т. Одномолекулярное нанопозиционирование: структурные переходы комплекса геликаза-ДНК во время гидролиза АТФ. Biophys. J. 101 , 976–984 (2011).

CAS Статья Google ученый

17

Boura, E. et al. Структура раствора комплекса ESCRT-I по данным малоуглового рентгеновского рассеяния, ЭПР и FRET-спектроскопии. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108 , 9437–9442 (2011).

CAS Статья Google ученый

18

Muschielok, A.И Михаэлис, Дж. Применение системы нано-позиционирования для анализа сетей флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Phys. Chem. В 115 , 11927–11937 (2011).

CAS Статья Google ученый

19

Олофссон, М., Калинин, С., Здунек, Дж., Оливеберг, М., Йоханссон, Л.Б.А. Триптофан-BODIPY: универсальная пара донор-акцептор для исследования общих изменений внутрибелковых расстояний. Phys. Chem. Chem. Phys. 8 , 3130–3140 (2006).

CAS Статья Google ученый

20

Knight, J.L., Mekler, V., Mukhopadhyay, J., Ebright, R.H. & Levy, R.M. Ограничиваемая расстоянием стыковка рифампицина и рифамицина SV с РНК-полимеразой с использованием систематических измерений FRET: разработка критериев качества и надежности модели. Biophys. J. 88 , 925–938 (2005).

CAS Статья Google ученый

21

Долгих, Э., Roitberg, A.E. & Krause, J.L. Флуоресцентный резонансный перенос энергии в ДНК, меченной красителем. J. Photochem. Photobiol. Chem. 190 , 321–327 (2007).

CAS Статья Google ученый

22

VanBeek, D.B., Zwier, M.C., Shorb, J.M. & Krueger, B.P. Беспокойство по поводу FRET: корреляция между каппа и R. Biophys. J. 92 , 4168–4178 (2007).

CAS Статья Google ученый

23

Синдберт, С.и другие. Точное определение расстояния между нуклеиновыми кислотами с помощью резонансной передачи энергии Ферстера: влияние длины и жесткости линкера красителя. J. Am. Chem. Soc. 133 , 2463–2480 (2011).

CAS Статья Google ученый

24

Cai, Q. et al. Измерение нанометрового расстояния в РНК с использованием сайт-направленного спинового мечения. Biophys. J. 93 , 2110–2117 (2007).

CAS Статья Google ученый

25

Гётте, М., Rausch, J.W., Marchand, B., Sarafianos, S. & Le Grice, S.F.J. Обратная транскриптаза в движении: конформационная динамика фермент-субстратных взаимодействий. Биохим. Биофиз. Acta 1804 , 1202–1212 (2010).

Артикул Google ученый

26

Пелецкая Е.Н., Когон А.А., Таске С., Арнольд Э. и Хьюз С. Связывание ненуклеозидного ингибитора влияет на взаимодействия субдомена пальцев обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека 1 типа с ДНК. J. Virol. 78 , 3387–3397 (2004).

CAS Статья Google ученый

27

Хуанг, Х., Чопра, Р., Вердин, Г.Л. и Харрисон, С.С. Структура ковалентно захваченного каталитического комплекса обратной транскриптазы ВИЧ-1: последствия для лекарственной устойчивости. Наука 282 , 1669–1675 (1998).

CAS Статья Google ученый

28

Ротвелл, П.J. et al. Многопараметрическая флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул выявляет гетерогенность комплексов обратной транскриптазы ВИЧ-1: праймер / матрица. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 , 1655–1660 (2003).

CAS Статья Google ученый

29

Patel, P.H. и другие. Понимание механизмов полимеризации ДНК на основе анализа структуры и функций обратной транскриптазы ВИЧ-1. Биохимия 34 , 5351–5363 (1995).

CAS Статья Google ученый

30

Упадхьяй А.К., Талеле Т.Т. и Пандей В.Н. Влияние выступающей на матрицу области связывания ОТ ВИЧ-1 на связывание и ориентацию дуплексной области матрицы-праймера. Мол. Клетка. Biochem. 338 , 19–33 (2010).

CAS Статья Google ученый

31

Лакович, Дж. Р. Принципы флуоресцентной спектроскопии 2-е изд.(Спрингер, 2006).

32

Ван Дер Меер, Б.В., Кокер, Г. III. И Чен, С.-Й.С. Резонансный перенос энергии: теория и данные. (Wiley, 1994).

33

Сисамакис, Э., Валери, А., Калинин, С., Ротвелл, П.Дж., Зайдель, К.А.М. Точные исследования FRET одиночных молекул с использованием многопараметрического детектирования флуоресценции. Methods Enzymol. 475 , 455–514 (2010).

CAS Статья Google ученый

34

Антоник, М., Фелекян, С., Гайдук, А., Зайдель, C.A.M. Отделение структурных неоднородностей от стохастических вариаций в распределении флуоресцентного резонансного переноса энергии с помощью анализа распределения фотонов. J. Phys. Chem. B 110 , 6970–6978 (2006).

CAS Статья Google ученый

35

Гопич И.В. & Сабо, А. Одномакромолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции и профили свободной энергии. J. Phys. Chem. В 107 , 5058–5063 (2003).

CAS Статья Google ученый

36

Калинин, С., Фелекян, С., Валери, А., Зайдель, К.А.М. Характеристика нескольких молекулярных состояний при детектировании многопараметрической флуоресценции одной молекулы с помощью анализа распределения вероятностей. J. Phys. Chem. В 112 , 8361–8374 (2008).

CAS Статья Google ученый

37

Дейл, Р.E., Eisinger, J. & Blumberg, W.E. Ориентационная свобода молекулярных зондов. Фактор ориентации при внутримолекулярном переносе энергии. Biophys. J. 26 , 161–193 (1979).

CAS Статья Google ученый

38

Лысков, С. и Грей, Дж. Дж. Сервер RosettaDock для локального белок-белкового стыковки. Nucleic Acids Res. 36 , W233 – W238 (2008).

CAS Статья Google ученый

39

ван Дейк, М.И Бонвин, А. Расширяя пределы того, что достижимо в стыковке ДНК-белок: сравнительный анализ производительности HADDOCK. Nucleic Acids Res. 38 , 5634–5647 (2010).

CAS Статья Google ученый

40

Эфрон, Б. Обсуждение: складной нож, бутстрап и другие методы повторной выборки в регрессионном анализе. Ann. Стат. 14 , 1301–1304 (1986).

Артикул Google ученый

41

Брюнгер, А.T. Free R value: новая статистическая величина для оценки точности кристаллических структур. Nature 355 , 472–475 (1992).

Артикул Google ученый

42

Дело, Д.А. и другие. Программы биомолекулярного моделирования Amber. J. Comput. Chem. 26 , 1668–1688 (2005).

CAS Статья Google ученый

43

Хенцлер-Вильдман, К.И Керн, Д. Динамические личности белков. Природа 450 , 964–972 (2007).

CAS PubMed Google ученый

44

Токурики, Н. и Тауфик, Д.С. Динамизм и эволюционируемость белков. Наука 324 , 203–207 (2009).

CAS Статья Google ученый

45

Фелекян, С., Калинин, С., Санабрия, Г., Валерий, А., Зайдель, C.A.M. Фильтрованная FCS: функции авто- и взаимной корреляции видов подчеркивают связывание и динамику биомолекул. ChemPhysChem 13 , 1036–1053 (2012).

CAS Статья Google ученый

46

Ротвелл, П.Дж. Структурные исследования ОТ ВИЧ-1 с использованием переноса энергии однопарной флуоресценции Кандидатская диссертация, Univ. Дортмунд (2002).

47

Яйцо, C.и другие. Регистрация данных и выборочный анализ отдельных молекул с использованием многопараметрического детектирования флуоресценции. J. Biotechnol. 86 , 163–180 (2001).

CAS Статья Google ученый

48

Nir, E. et al. Гистограммы FRET одиночных молекул, ограниченные дробовым шумом: сравнение теории и экспериментов. J. Phys. Chem. В 110 , 22103–22124 (2006).

CAS Статья Google ученый

49

Santoso, Y., Торелла, Дж. П., Капанидис, А. Характеристика динамики FRET одной молекулы с анализом распределения вероятностей. ChemPhysChem 11 , 2209–2219 (2010).

CAS Статья Google ученый

50

Мартина, Г.Дж., Тобиас, Д.Дж. И Кляйн, М. Алгоритмы молекулярной динамики постоянного давления. J. Chem. Phys. 101 , 4177–4189 (1994).

CAS Статья Google ученый

51

Сунг, Т.T. Основы вероятности и статистики для инженеров (Wiley, 2004).

52

Исакссон, М., Норлин, Н., Вестлунд, П.О. И Йоханссон, Л.Б.А. О количественном молекулярном анализе переноса электронной энергии в донорно-акцепторных парах. Phys. Chem. Chem. Phys. 9 , 1941–1951 (2007).

CAS Статья Google ученый

Практическое руководство по одиночным молекулам FRET

Nat.Авторская рукопись; доступно в PMC 2013, 10 сентября.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC3769523

NIHMSID: NIHMS495771

, ^{1, 2} , ³ и ^{905 1 , 4}

Рахул Рой

¹ Департамент физики, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и компьютерной биологии, Университет компьютерной биологии Illinois at Urbana-Champaign, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

Sungchul Hohng

³ Кафедра физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

¹ Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр исследований Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

¹ Департамент физики Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и вычислительной биологии, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

³ Кафедра физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-донг, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Автор, ответственный за переписку.Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Methods. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы: Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивирования поверхности полиэтиленгликоля (PEG) 9000

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Abstract

Несмотря на взрывной рост биологических применений методов одиночных молекул за последнее десятилетие методы до сих пор практиковались в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Частично это происходит из-за отсутствия коммерческих инструментов во многих случаях, а также из-за воспринимаемой крутой кривой обучения и необходимости в дорогостоящем оборудовании. Мы хотим предоставить практическое руководство по использованию резонансной передачи энергии (FRET) по Фёрстеру (или флуоресценции) на уровне отдельных молекул, уделяя особое внимание изучению иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакции отдельных молекул от 1 миллисекунды до многих минут. Инструмент может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно эксплуатироваться с использованием текущих хорошо зарекомендовавших себя протоколов и свободно доступного программного обеспечения.

Будущее открывает перспективы персонализированного секвенирования ДНК и высокопроизводительного скрининга на патогены по доступной цене и в разумное время. Эти обещания подкрепляются всплеском технологий на основе одиночных молекул, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. Используя этот подход, перед микроскопом предстает несколько важных биологических загадок, которые долгое время интересовали ученых. Как сказал Фейнман, «очень легко ответить на многие из этих фундаментальных биологических вопросов; вы просто посмотрите на вещь ! » ¹ .Одномолекулярные методы позволяют нам делать именно это ^{2, 3} . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любого биологического явления. В надежде способствовать достижению этой цели, мы предоставляем краткое, но практическое руководство для измерения одиночных молекул FRET ⁴ (smFRET) ^5-7 , одного из наиболее общих и адаптируемых методов измерения одиночных молекул. С момента своего скромного начала в неводных условиях в 1996 г. ⁸ smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, сворачивании и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, сворачивании белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния мембран, ионные каналы, трансдукция сигналов, и это лишь некоторые из них, и этот список продолжает расти быстрыми темпами.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в данной области и ссылкам в них ^{6, 9-13} .

В измерениях FRET степень безызлучательного переноса энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое можно оценить по отношению акцептора к общей интенсивности излучения () ^{4, 14, 15} . Эта эффективность передачи энергии, E , задается как E = [1 + ( R / R ₀ ) ⁶ ] ^-1 , где R — расстояние между красителями. и R ₀ — это радиус Ферстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET (). Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярном каркасе, а не в лабораторном, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (коммерческие решения также доступны, например, MicroTime200 от PicoQuant) и эффективно для выявления распределения популяций расстояний между красителями ^16-19 .Однако возможность отслеживать отдельные молекулы в течение длительного периода времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя можно использовать конфокальную микроскопию ^{20, 21} , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации поверхностных иммобилизованных молекул с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая позволяет осуществлять высокопроизводительный сбор данных ^{5, 22} . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговой инструкцией ⁷ с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 в Интернете; перечисленные элементы и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке пассивированной полимером поверхности и веб-ссылка на демонстрационные видеоролики включены в Дополнительный протокол в Интернете. Хотя мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET в этом обзоре, схемы FRET более высокого порядка могут также применяться для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (Box 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R ₀ = 50 Å. Донорный краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. При R = R ₀ , E = 0,5, а на меньших расстояниях> 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R ₀ .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых вычисляется кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный рибозим шпильки ⁹³ , который несет донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер донорного и акцепторного сигналов указывает на то, что эти изменения интенсивности происходят из-за передачи энергии.Молекулы красителя также показывают переходы в темное состояние, например. интенсивность акцептора временно падает до нуля (~ 9 с) или полностью фотообесцвечивается (~ 18,5 с).

Box 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () — мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то сворачивание белка или взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, постоянно возрастает интерес к расширению досягаемости FRET до трех измерений. Здесь мы обсуждаем некоторые схемы FRET на начальной стадии или стадии разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для увеличения эффективных значений R ₀ . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору более низкой энергии ().Эта схема может быть полезной при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркатная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости от любого из акцепторов донор гаснет с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбуждаемыми одной и той же длиной волны света), которые могут выборочно гасить в зависимости от того, какой из них находится рядом с единственным акцептором.

Общая трехцветная схема: в общем случае из двух вышеупомянутых может быть, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, необходимо провести подробные расчеты для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет явно определить однозначную эталонную плоскость в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут действовать как эффективные доноры одиночных молекул.

Схемы FRET одиночных молекул.

План эксперимента

Одномолекулярные флуоресцентные красители

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции, ε > 50000 M ⁻¹ см ⁻¹ ; квантовый выход, QY > 0,1 ), фотостабильный с минимальными фотофизическими / химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшой и водорастворимый с достаточным количеством химикатов биоконъюгации.Кроме того, отличная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET ²³ , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное мигание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET ²⁴ за счет химического подавления их мерцания ²⁵ , но большой размер (диаметр> 20 нм для коммерческих КТ) и отсутствие схемы одновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, самые популярные одномолекулярные флуорофоры — это небольшие (<1 нм) органические красители ²⁶ . Мы сравнили три пары FRET с оптической плотностью от 500 до 700 нм от разных производителей (цианиновые, Alexa- и Atto-красители) в. Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги кажутся сопоставимыми по своим соответствующим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например те, которые можно возбуждать при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для синтеза пользовательской РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Суа Мён, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию к спонтанному изменению своей интенсивности между тремя различными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители для ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат эффективными однокомолекулярными красителями и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждается позже).

Таблица 1

Сравнение однокомолекулярных красителей FRET

9070

Краситель	Возбуждение λ макс. (нм)	Излучение λ нм макс.	Фотостабильность (и) b (в Trolox / β ME)
Доноры
Cy67 567
Cy7	91/50
ATTO550	554	577	1,9	72/27 c
65 Alexa555	555	567 567	555	567 567
Приемники
Cy5	655	667	1,0	82/25	907 9073	62/31
Alexa647	650	667	1,2	58/20 c

Повышение фотостабильности

Молекулярный кислород является эффективным, но красителем также является источником высокореактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание ²⁷ . Хотя удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно увеличивает время пребывания в триплетном темном состоянии ²⁸ , вызывая миллисекундную или более длительную перемежаемость флуоресценции или раннее начало насыщения сигнала.Аналог витамина E под названием Trolox (2 мМ; 100 × исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является отличным гасителем триплетного состояния, который подавляет моргание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с ферментативная система поглощения кислорода ²⁸ . Trolox также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает наступление насыщения излучения с увеличением интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и вызывает долгоживущие темные состояния Cy5 ²⁸ , побочный эффект, который использовался для приложений визуализации с фотопереключением сверхвысокого разрешения ²⁹ .Существует множество других тушителей триплетного состояния или агентов против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей ³⁰ .

Самая популярная ферментативная система поглощения кислорода ³¹ представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 Ед / мл), каталазы (2170 Ед / мл) и β-D-глюкозы (0,4% масс.) (Или 0,8% моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавить непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы pH раствора не упал значительно из-за образования глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатеховая кислота / протокатехуат-3,4-диоксигеназа ³² , которая обеспечивает ~ 40% улучшение по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов коммерчески недоступны, необходимо позаботиться о том, чтобы гарантировать отсутствие загрязняющей активности, особенно рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места маркировки должны быть выбраны таким образом, чтобы расстояние между красителями изменилось от меньшего к большему, чем значение R ₀ (или наоборот ) для максимальной чувствительности.Существуют некоторые руководящие принципы для значений FRET ³³ , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот ^{34, 35} . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков кратко изложены в. Нуклеиновые кислоты лучше всего метить во время синтеза или с помощью оснований, модифицированных амином, которые можно отделить от немеченых молекул электрофорезом в полиакриламидном геле. Для взаимодействий нуклеиновая кислота-белок выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обращения, очистки и гибкости в нанесении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с основной цепью ДНК, красители следует конъюгировать изнутри с использованием линкерных групп для предотвращения разрушения основной цепи. Экономично распространять модификации на две или более цепочек ДНК (или РНК) и отжигать их для создания конечной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетонную группу ³⁶ , генетически кодируемую в геликазе Rep E.coli , используя Cy3 или Cy5-гидризид.

Таблица 2

Стратегии конъюгации для красителей или биотина

99 (ACE) синтез твердой подложки Даже

Химия / метод	Реактивная группа	Замечание
ДНК / ацетоспирт	ДНК / RNA		Прямое включение в основную цепь
Реакционноспособный с амином (-NH 2 )	сложный эфир сукцинимидил (NHS)	Амино C6- dT / dC (для внутренней мечения цепи без разрушения остова )
Тиолореактивный (-SH)	Малеимид	Тиоловый модификатор на 3′- или 5′-конце
Белки
Амино-реактивный 90cc637 2 -NH637 2 -NH932 (NHS) сложный эфир	N-конец или аминогруппа лизина a
Тиолореактивный (-SH) 9 0768	Малеимид	Цистеиновая тиоловая группа b
Кетонореактивный (= CO)	Гидразин	Неприродная аминокислота с кетонной группой c

выход белка с приемлемой флуоресценцией был беден.Чрезвычайно низкий выход мечения кетоновыми группами на белках, размер которых превышает 100 остатков, даже в денатурирующих условиях, кажется общим (Ричард Эбрайт, личное сообщение). Низкое количество остатков цистеина (cys) в большинстве белков по сравнению с лизинами делает их идеальными для специфической маркировки. Следовательно, мечение остатков цистеина (введенное посредством сайт-направленного мутагенеза ^{37, 38} ) реакциями на основе малеимида остается наиболее популярной схемой мечения, хотя недавно разработаны, но менее общие альтернативы ^{26, 39} .Хотя выбор маркировки имеет наибольшее влияние на успех или неудачу экспериментов с smFRET, также важен выбор оборудования, используемого для обнаружения smFRET.

Детектирование одиночных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В TIR-микроскопии ^{40, 41} создается исчезающее поле возбуждающего света, которое распространяется только на ~ 100-200 нм от поверхности, к которой привязан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Твердотельный лазер на 532 нм (~ 50 мВт) подходит для обсуждаемых здесь пар FRET, а для проверки присутствия акцептора можно добавить гелий-неоновый лазер на 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). Путем возбуждения большой площади (∼0,05 мм размером ² ) и использования детектирования на основе камеры параллельно отображаются сотни молекул. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ∼25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Этикетки — М, зеркальные; DM — дихроичное зеркало; L, линза; CCD, камера устройства с зарядовой связью; BE, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ), возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Привязанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину области изображения CCD. Коллимированное изображение разделяется на излучение донора и акцептора и отображается бок о бок на ПЗС-камере (см. Изображение камеры на вставке).( b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид коробки на (а)). В режиме PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ _c > 68 °) на призму, расположенную в верхней части образца, создает исчезающее поле (EF) на границе раздела кварц / вода на предметном стекле. Поочередно при возбуждении OTIR сфокусированный лазерный луч падает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе раздела стекло / вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трех цветовой схемы.Изображение кадрируется с помощью щели, так что конечный размер изображения покрывает одну треть кристалла ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца наверху канала для образца, а флуоресценция собирается с объектива под ^{40, 41} (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с длинным фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло для согласования показателя преломления и внутренне отражается на границе раздела кварц-вода (и дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирают с помощью иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60 ×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов по закачке жидкости, потому что его отображающая поверхность, состоящая из предметного стекла толщиной 1 мм, не изгибается при изменении давления во время потока. Дорогие (но пригодные для вторичной переработки) кварцевые предметные стекла необходимы для минимизации фона флуоресценции, и призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость перенастройки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефтяной цели с высоким NA для создания быстро исчезающего месторождения. Фокусировка луча в задней фокальной плоскости генерирует параллельный луч, выходящий из объектива, а затем, переводя его на периферию объектива, производит ПВО на границе раздела стекло / вода ^{40, 41} (). Флуоресценция молекул, привязанных к поверхности покровного стекла, собирается с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие возможности.Во многом благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100 ×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получить данные smFRET для пары Cy3 / Cy5 с отношением сигнал / шум и площадью изображения, сравнимыми с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

Микроскопия TIR приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых фотоаппаратов с электронно-умножающимися устройствами заряженной пары (EM-CCD) ^{3, 42} . В установках smFRET обычно используются EM-CCD, которые имеют высокую квантовую эффективность (85-95%) в диапазоне 450-700 нм, низкий эффективный шум считывания (<1 электрон, среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстрая скорость вертикального сдвига (≤ 1 мкс / строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отклоняется от флуоресценции, собираемой объективом, с использованием длиннопроходного фильтра. Вертикальная щель вводится в плоскости формирования изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения так, чтобы окончательное изображение, падающее на ПЗС-матрицу, было вдвое меньше размера ПЗС-кристалла (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроичного и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора может отображаться на ПЗС-камере рядом друг с другом (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения ∼75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Простое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети области ПЗС-матрицы, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров существует значительная перекрестная помеха между каналами обнаружения (например, 40% излучения Cy5 попадает в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго приемника), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходную интенсивность ⁴³ . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в исходной трехцветной схеме FRET с одной молекулой; фотостабильность и яркость Cy7 были сопоставимы с таковыми Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой спектральной области можно до некоторой степени уменьшить с помощью оптимизированных для инфракрасного излучения объективов и оптики.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

В то время как кварцевые слайды абсолютно необходимы для PTIR, тонкое покровное стекло формирует поверхность для визуализации OTIR, а обычные стеклянные покровные стекла обычно подходят для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не мешающей иммобилизации образца на предметном стекле или покровном стекле обычно используется связь биотин-стрепавидин ^{5, 22, 44} .В эффективном методе исследований с участием только нуклеиновых кислот используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотин БСА), который адсорбируется на поверхности стекла / кварца и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный стрептавидиновый белок (нейтравидин — менее дорогая альтернатива) (). При изучении белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (ПЭГ) ⁴⁵ . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируется и реагирует с ПЭГ, модифицированным сложным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () ⁴⁴ (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH <7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивирования поверхности сульфодисукцинимидилтартратом ⁴⁶ . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами ^{47, 48} . Белки, меченные гистидином, также могут быть прикреплены к поверхности с помощью хелатных групп Ni ²⁺ или Cu ^{2+ 49} , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидиновой метки и белок ().Некоторые из этих ПЭГилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгое отклонение неспецифического связывания может быть достигнуто путем повторения реакции ПЭГилирования два или три раза (Yuji Ishitsuka, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифически связываются с биотинилированными молекулами поверхностного связывания с помощью поливалентных белков авидина (например, нейтравидина).( b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно прикрепляется к аминосиланизированной поверхности предметного стекла. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированной с биотиновой составляющей, с помощью сэндвича с белком нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Поверхности, покрытые ПЭГ, могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni ²⁺ или Cu ²⁺ , хелатированные на иминодиуксусной кислоте (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоте (NTA)), которые эффективно связываются с 6x His-меченными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, можно использовать для захвата биомолекул. Фракция биотинилированного липида позволяет специфически прикреплять везикулы к поверхности биотин-ПЭГ. Этикетки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри фосфолипидных везикул, связанных с поверхностью ^50-52 имитирует клеточный захват, снижает возмущение в системе и не требует привязки к молекуле.С принятием полупроницаемых пузырьков ⁵³ , этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Герметичная камера для образцов создается путем прослоения двухсторонней ленты или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол в Интернете) и путем нанесения эпоксидной смолы по мере необходимости. Простое пипетирование или перекачивание через два отверстия, предварительно просверленных в предметном стекле, позволяет заменять раствор без сушки ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и / или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специфически связанных молекул (обычно специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятна / мкм ² ), препарат на слайде считается приемлемым. После стрептавидина добавляют биотиновые биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг / мл БСА для уменьшения потерь молекул на другие поверхности) для достижения иммобилизации при желаемой плотности одиночных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы с такими связанными молекулами приобретаются и сохраняются на жестком диске напрямую с помощью специальной программы, написанной на Visual C ++.

Камера для проб. ( a ) Камера для образцов изготавливается путем размещения предметного стекла микроскопа и покровного стекла двусторонней лентой и герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обмена раствора.( b ) Шприц подсоединен к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставлен во входное отверстие. Когда шприц вытягивается, раствор вводится в камеру. Воспроизведено с ^{исх. 7} с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать до оценки истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в акцепторный канал (ы) и прямое возбуждение акцептора (ов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума поглощения) мы определяем утечку излучения акцептора в канал обнаружения донора.

Картирование между изображениями донора и акцептора выполняется с изображением привязанных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительной эмиссией во всех каналах обнаружения. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции в изображении донора и соответствующие им пики в изображении акцептора, и автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, поворот, масштабирование и искажение.

Обработка и анализ данных

Алгоритмы обработки данных

Чтобы преобразовать файлы фильмов во временные траектории одиночных молекул, мы сначала идентифицируем изолированные пики одиночных молекул из составного изображения донорных и акцепторных каналов (среднее значение первых десяти кадров), построенного с использованием сгенерированное отображение ( см. выше ). Совместно локализующиеся донорные и акцепторные пятна отбираются для окончательного анализа с целью удаления частично меченых молекул. Затем локальный фон вычитается из пиков, и интенсивности из 7 × 7 пикселей (в зависимости от общего увеличения), окружающие пик (что соответствует площади ∼ 1 мкм ² ), интегрируются, чтобы восстановить интенсивности доноров и акцепторов для каждой отдельной молекулы для каждый кадр.В экспериментах, где ожидается только временное присутствие меченой донором молекулы ⁵⁴ , первый шаг может быть выполнен для каждого набора из десяти последовательных кадров.

Эффективность FRET

После корректировки перекрестных помех и фона (определяемых по следам интенсивности после фотообесцвечивания красителя) в обоих каналах, кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как E _{приложение} = I _A / ( I _A + I _D ), где I _A и I _D представляют интенсивности акцептора и донора, соответственно. E _app предоставляет только приблизительный индикатор расстояния между красителями из-за неопределенности в коэффициенте ориентации κ ² между двумя флуорофорами и необходимыми инструментальными поправками. Как показывает опыт, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ ² близка к 2/3 ^{34, 55} . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом случае, который мы тестировали, кажущееся FRET было монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент, γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности обнаружения между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменения интенсивности акцептора, ΔI _A к изменению интенсивности донора, ΔI _D при фотообесцвечивании акцептора ( γ = ΔI _A IΔI _Д ) ^{21, 56} .Затем рассчитывается скорректированная эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается около ^{57, 58} . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может тушить красители, и на это явление может влиять связывание с белками в районе ^59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. Тогда основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут сбивать с толку из-за потенциальных артефактов или двусмысленностей. Вот несколько советов о том, чего следует остерегаться.

1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (<5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировало аналогичным образом.

2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей доноров и акцепторов), I total, должен оставаться постоянным. Постоянные изменения в I _итого могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники интенсивного шума включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменения свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

3. Следует снимать длинные видеоролики, демонстрирующие одноэтапные события фотообесцвечивания, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от отдельных молекул.

4. Обратимое выключение (так называемое мигание) Cy5 (или аналогичных красителей) ⁶² — хорошо известный артефакт (см.), Который часто ошибочно интерпретируется как большое изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например макромолекулярное разворачивание. Эмпирическое правило заключается в том, что если FRET мгновенно падает до уровня только донора ( E _app = 0), считайте, что это мигает.Если очень низкое состояние FRET обнаруживается даже в присутствии подавителей мигания, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить мигание. Фотофизические явления, такие как мигание, также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения ²⁸ .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о свойствах равновесия лучше всего получить с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (~ 5 с) фильмов о различных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию системы через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающей стохастические переходы, скорости переходов определяются из экспоненциального спада, подходящего к распределению времени пребывания каждого состояния ⁶³ , или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстрые для надежных определение времени ожидания ⁶⁴ .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для несмещенной оценки количества заселенных состояний FRET, оценки скорости взаимного преобразования между ними и определения наиболее вероятной временной эволюции каждое состояние ⁶⁵ (доступно для загрузки на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности переходов от начальных к конечным значениям FRET для каждого перехода, полученный из HMM (или другого) анализа, обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных ^{57, 65-67} .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для данных о конфокальных одиночных молекулах, полученных фотон за фотоном ^68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции одного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный, визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом ⁷¹ .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения метода до того, как кто-то спроектирует первый эксперимент smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (молекулам), поскольку (полу) собственные хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одиночных молекул. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК ^{72, 73} и многих белков ^{74, 75} .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной маркировке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид только-донора обнаруживается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. Выше ). (3) FRET нечувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2-8 нм для R ₀ = 5 нм.Однако изменения расстояния всего лишь 0,3 нм могут быть обнаружены для одиночных молекул между 0,6 R ₀ и 1,5 R ₀ , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала: Отношение к шуму, необходимо зарегистрировать ∼100 полных фотонов. Учитывая, что до фотообесцвечивания можно собрать более 10 ⁵ фотонов из отдельных молекул красителя, можно получить более 10 ³ точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Абсолютная оценка расстояния является сложной задачей из-за зависимости флуоресцентных свойств и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не важна. Тем не менее, можно сделать разумные оценки факторов ориентации ⁷⁶ , и контрольные эксперименты с каждым красителем могут обеспечить хорошее приближение расстояний между красителями ^{77, 78} . Обеспокоенность по поводу этих проблем может быть дополнительно уменьшена путем использования избыточного количества ограничений расстояния в исследованиях триангуляции ^{79, 80} .

Усовершенствованные методы smFRET

Некоторые из новых интересных технических разработок, все еще находящихся на стадии проверки принципа работы, кратко излагаются ниже.

По мере усложнения исследуемой системы требуется дополнительная информация для устранения двусмысленностей. Для этой цели был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех отдельных флуорофоров, оптимизации конфокальной оптики обнаружения и разработки новой схемы анализа данных ⁴³ .Используя эту технику, были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего соединения ДНК (Холлидея). Трехцветный smFRET также работает на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения взаимодействий между тремя разными молекулами ^{81, 82} . Многоцветная схема возбуждения для дальнейшего различения различных молекулярных частиц ^{83, 84} недавно была расширена до трехцветной FRET ⁸⁵ .Также были показаны перспективы дальнейшего расширения FRET с помощью нескольких флуорофоров на отдельных молекулах ДНК ⁸⁶ .

По мере признания важности механических факторов в биологии, к smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции как функции силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптические пинцеты были объединены с функцией расщепления флуоресценции одной молекулы ⁸⁷ и FRET ⁸⁸ , чтобы сообщить о принудительном распаковке шпильки ДНК.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой FRET в зависимости от силы для энтропийной пружины, изготовленной из однонитевой ДНК ⁸⁹ . Совсем недавно отклик одиночных узлов Холлидея при низкой силе отслеживался с помощью гибридного инструмента, объединяющего FRET и оптический пинцет, чтобы составить карту 2D складывающегося ландшафта ⁹⁰ . smFRET был также объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина ^{91, 92} .

Заключительные примечания

Мы обсудили практические вопросы хорошо зарекомендовавшего себя smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Двумя областями, которые все еще не разработаны, являются измерения в живой клетке, что, вероятно, требует существенных улучшений зондов, и анализ динамики мембранных белков, что уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET является одним из мощных инструментов для «изучения» динамики и взаимодействия отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, — это открыть глаза «одной молекулы» на широкий спектр биомолекулярных взаимодействий, требующих тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассирования поверхности полиэтиленгликоля (ПЭГ)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

Благодарности

Мы благодарим И. Расника, С. Маккинни, К.Джу, Р. Клегг, С. Мион и члены группы Ха в Университете Иллинойса и К. Дрексхаге из Университета Зигена за экспертные консультации и обсуждение, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннеру и Л. Суприя за внимательное чтение рукописи. К. Джу подготовил видеоинструкцию по приготовлению слайдов с ПЭГ. Авторская работа по FRET с одной молекулой финансировалась Национальными институтами здравоохранения, карьерной премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом научно-исследовательских работ для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Список литературы

1. Фейнман Р.П. Внизу много места. J Microelectromech Syst. 1992; 1: 60–66. [Google Scholar] 2. Бустаманте С., Брайант З., Смит С.Б. Десять лет напряженности: механика одномолекулярной ДНК. Природа. 2003. 421: 423–427.[PubMed] [Google Scholar] 3. Моернер В.Е., Фромм Д.П. Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул. Rev Sci Inst. 2003. 74: 3597–3619. [Google Scholar] 4. Форстер Т. Экспериментальное и теоретическое исследование межмолекулярного переноса энергии электронного возбуждения. Zeitschrift Naturforsch A. 1949; 4: 321–327. [Google Scholar] 5. Ха Т. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции. Методы. 2001; 25: 78–86. [PubMed] [Google Scholar] 6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул.Наука. 1999; 283: 1676–1683. [PubMed] [Google Scholar] 7. Joo C, Ha T. In: Методы одиночных молекул: лабораторное руководство. Селвин П., Ха Т, редакторы. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; NY: 2007. С. 3–36. [Google Scholar] 8. Ha T, et al. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1996; 93: 6264–6268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Капанидис А.Н. и др.Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005; 38: 523–533. [PubMed] [Google Scholar] 10. Michalet X, Weiss S, Jager M. Одномолекулярные флуоресцентные исследования сворачивания белка и конформационной динамики. Chem Rev.2006; 106: 1785–1813. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Зайдель Р., Деккер С. Исследования одномолекулярных двигателей нуклеиновых кислот. Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 80–86. [PubMed] [Google Scholar] 12. Смайли Р.Д., Хаммес Г.Г. Одномолекулярные исследования ферментативных механизмов.Chem Rev.2006; 106: 3080–3094. [PubMed] [Google Scholar] 13. Zhuang XW. Одномолекулярная РНК-наука. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2005. 34: 399–414. [PubMed] [Google Scholar] 14. Форстер Т. // Современная квантовая химия. О С, редактор. Академическая пресса; Нью-Йорк: 1967. С. 93–137. [Google Scholar] 16. Дениз А.А. и др. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Форстера от расстояния и субпопуляций. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1999; 96: 3670–3675.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Best RB, et al. Эффект гибкости и цис-остатков в исследованиях одномолекулярного FRET полипролина. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 18964–18969. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Торговец KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, Eaton WA. Характеристика развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 1528–1533. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20.Ha T, Chemla DS, Enderle T, Weiss S. Спектроскопия одиночных молекул с автоматическим позиционированием. App Phys Lett. 1997; 70: 782–784. [Google Scholar] 21. Sabanayagam CR, Eid JS, Meller A. Высокопроизводительный сканирующий конфокальный микроскоп для анализа отдельных молекул. App Phys Lett. 2004. 84: 1216–1218. [Google Scholar] 22. Zhuang X и др. Одномолекулярное исследование катализа и сворачивания РНК. Наука. 2000; 288: 2048–2051. [PubMed] [Google Scholar] 23. Brasselet S, Peterman EJG, Miyawaki A, Moerner WE. Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул у камелеона, зависимого от концентрации кальция.J. Phys Chem B. 2000; 104: 3676–3682. [Google Scholar] 24. Hohng S, Ha T. Одномолекулярный квантово-точечный флуоресцентный резонансный перенос энергии. Chemphyschem. 2005; 6: 956–960. [PubMed] [Google Scholar] 25. Hohng S, Ha T. Почти полное подавление мерцания квантовых точек в условиях окружающей среды. J Am Chem Soc. 2004; 126: 1324–1325. [PubMed] [Google Scholar] 26. Капанидис А.Н., Вайс С. Флуоресцентные зонды и химия биоконъюгации для анализа флуоресценции одиночных молекул биомолекул. J Chem Phys. 2002; 117: 10953–10964.[Google Scholar] 27. Hubner CG, Renn A, Renge I, Wild UP. Прямое наблюдение тушения триплетного времени жизни одиночных молекул красителя молекулярным кислородом. J Chem Phys. 2001; 115: 9619–9622. [Google Scholar] 28. Расник И., МакКинни С.А., Ха Т. Немигающая и долговременная флуоресцентная визуализация одиночных молекул. Nat Meth. 2006; 3: 891–893. [PubMed] [Google Scholar] 29. Руст MJ, Bates M, Zhuang X. Получение изображений с субдифракционным пределом с помощью микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM) Nat Meth. 2006; 3: 793–795. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30.Виденгрен Дж., Чмыров А., Эггелинг С., Лофдаль П.А., Зайдель С. Стратегии повышения фотостабильности в сверхчувствительной флуоресцентной спектроскопии. J. Phys Chem A. 2007; 111: 429–440. [PubMed] [Google Scholar] 31. Бенеш Р.Е., Бенеш Р. Ферментативное удаление кислорода для полярографии и связанных с ней методов. Наука. 1953; 118: 447–448. [PubMed] [Google Scholar] 32. Aitken CE, Marshall RA, Puglisi J. Система поглощения кислорода для улучшения стабильности красителя в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул. Биофиз Дж.2007; 107: 117689. biophysj. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Ву П.Г., Брэнд Л. Резонансная передача энергии — методы и приложения. Анальная биохимия. 1994; 218: 1–13. [PubMed] [Google Scholar] 34. Clegg RM. Флуоресцентный резонансный перенос энергии и нуклеиновые кислоты. Методы Энзимол. 1992; 211: 353–388. [PubMed] [Google Scholar] 35. Murphy MC, Rasnik I, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Исследование конформационной гибкости одноцепочечной ДНК с использованием флуоресцентной спектроскопии. Биофиз Дж. 2004; 86: 2530–2537. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36.Рю Й.Х., Шульц П.Г. Эффективное включение неприродных аминокислот в белки Escherichia coli. Nat Meth. 2006; 3: 263–265. [PubMed] [Google Scholar] 37. Хигучи Р., Круммель Б., Сайки РК. Общий метод подготовки in vitro и специфический мутагенез фрагментов ДНК: изучение взаимодействия белков и ДНК. Nucleic Acids Res. 1988; 16: 7351–7367. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Браман Дж. Протоколы мутагенеза in vitro. 2-й. Vol. 182. Humana Press; Тотова, Нью-Джерси: 2001. [Google Scholar] 39.Pennington MW. Процедуры химической модификации для конкретных участков. Методы Мол биол. 1994; 35: 171–185. [PubMed] [Google Scholar] 40. Аксельрод Д. Неинвазивные методы в клеточной биологии. Вили-Лисс; Нью-Йорк: 1990. [Google Scholar] 41. Аксельрод Д. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии. Методы Энзимол. 2003; 361: 1–33. [PubMed] [Google Scholar] 44. Ha T, et al. Инициирование и повторное инициирование раскручивания ДНК реп-геликазой Escherichia coli. Природа. 2002; 419: 638–641. [PubMed] [Google Scholar] 45.София С.Дж., Премнат В.В., Меррилл Е.В. Поли (этиленоксид), привитый к поверхности кремния: плотность прививки и адсорбция белка. Макромолекулы. 1998. 31: 5059–5070. [PubMed] [Google Scholar] 46. Шредер С.М., Блейни П.С., Ким С., Се XS. В: Методы одиночных молекул: лабораторное руководство. Селвин П., Ха Т, редакторы. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; NY: 2007. С. 461–492. [Google Scholar] 47. Heyes CD, Кобицкий А.Ю., Амиргулова Е.В., Ниенхаус ГУ. Биосовместимые поверхности для специфического связывания отдельных белковых молекул.J. Phys Chem B. 2004; 108: 13387–13394. [Google Scholar] 48. Heyes CD, Groll J, Moller M, Nienhaus GU. Синтез, формирование рисунка и применение звездообразных биофункциональных поверхностей из полиэтиленгликоля. Mol BioSyst. 2007; 3: 419–430. [PubMed] [Google Scholar] 49. Ча Т, Го А, Чжу XY. Ферментативная активность на чипе: критическая роль ориентации белков. Протеомика. 2005; 5: 416–419. [PubMed] [Google Scholar] 51. Okumus B, Wilson TJ, Lilley DM, Ha T. Исследования инкапсуляции везикул показывают, что гетерогенность одиночных молекул рибозима является внутренней.Биофиз Дж. 2004; 87: 2798–2806. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 52. Бенитес Дж. Дж. И др. Исследование временных взаимодействий медных шаперонов и белков болезни Вильсона на уровне одной молекулы с захватом нанопузырьков. J Am Chem Soc. 2008; 130: 2446–2447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 54. Myong S, Rasnik I., Joo C, Lohman TM, Ha T. Повторяющееся перемещение моторного белка на ДНК. Природа. 2005; 437: 1321–1325. [PubMed] [Google Scholar] 55. Ван дер Меер Б.В. Резонансная передача энергии.Wiley; Чичестер: 1999. [Google Scholar] 56. Ha T, et al. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики и механизма расщепления ферментов. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1999; 96: 893–898. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57. Джу С. и др. Наблюдение в реальном времени за динамикой волокна RecA с разрешением по одному мономеру. Клетка. 2006; 126: 515–527. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ло Г, Ван М, Кенигсберг WH, Се XS. Одномолекулярные и ансамблевые флуоресцентные анализы функционально важных конформационных изменений в ДНК-полимеразе Т7.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 12610–12615. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 59. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Зечел А., Лилли Д.М. Наблюдение спиральной геометрии двухцепочечной ДНК в растворе с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1993; 90: 2994–2998. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 60. Купер Дж. П., Хагерман П. Дж. Анализ переноса энергии флуоресценции в дуплексных и разветвленных молекулах ДНК. Биохимия. 1990; 29: 9261–9268. [PubMed] [Google Scholar] 61.Ли С.П., Портер Д., Чирикджян Дж. Г., Кнутсон Дж. Р., Хан М.К. Флуорометрический анализ реакций расщепления ДНК, характеризуемых эндонуклеазой рестрикции BamHI. Анальная биохимия. 1994; 220: 377–383. [PubMed] [Google Scholar] 62. Ha TJ, et al. Временные колебания резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя красителями, конъюгированными с одним белком. Chem Phys. 1999; 247: 107–118. [Google Scholar] 63. Colquhoun D, ​​Hawkes AG. В: Одноканальная запись. Сакманн Б., Нехер Э., редакторы. Пленум Пресс; Нью-Йорк: 1995.С. 397–482. [Google Scholar] 64. Ким HD и др. Mg2 + -зависимые конформационные изменения РНК изучали с помощью корреляции флуоресценции и FRET на иммобилизованных одиночных молекулах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99: 4284–4289. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 65. McKinney SA, Joo C, Ha T. Анализ траекторий FRET одиночных молекул с использованием скрытого марковского моделирования. Biophys J. 2006; 91: 1941–1951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 66. Манро Дж. Б., Альтман Р. Б., О’Коннор Н., Бланшар, Южная Каролина. Идентификация двух различных промежуточных продуктов гибридного состояния на рибосоме.Mol Cell. 2007. 25: 505–517. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 67. Myong S, Bruno MM, Pyle AM, Ha T. Пружинный механизм раскручивания ДНК с помощью геликазы NS3 вируса гепатита C. Наука. 2007; 317: 513–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 68. Ян Х, Се XS. Зондирование фотона динамики одной молекулы фотоном. J Chem Phys. 2002; 117: 10965–10979. [Google Scholar] 69. Андрек М, Леви Р.М., Талага Д.С. Прямое определение кинетических скоростей по траекториям прихода фотонов одной молекулы с использованием скрытых марковских моделей.J. Phys Chem A. 2003; 107: 7454–7464. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 70. Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. Траектории максимального правдоподобия из экспериментов по резонансному переносу энергии флуоресценции одиночных молекул. J Chem Phys. 2003; 119: 9920–9924. [Google Scholar] 71. Бланшар СК, Гонсалес Р.Л., Ким Х.Д., Чу С., Пуглиси ДжейДи. Отбор тРНК и кинетическая корректура при переводе. Nat Struct Mol Biol. 2004. 11: 1008–1014. [PubMed] [Google Scholar] 72. Смит Г.Дж., Сосник Т.Р., Шерер Н.Ф., Пан Т. Эффективное флуоресцентное мечение большой РНК посредством гибридизации олигонуклеотидов.РНК. 2005; 11: 234–239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 73. Dorywalska M, et al. Сайт-специфическая маркировка рибосомы для спектроскопии одиночных молекул. Nucleic Acids Res. 2005. 33: 182–189. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 74. Дениз А.А. и др. Сворачивание одномолекулярного белка: исследования диффузионного флуоресцентного резонансного переноса энергии денатурации ингибитора химотрипсина 2. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97: 5179-5184. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 75. Ягер М, Нир Э, Вайс С.Сайт-специфическая маркировка белков для одномолекулярного FRET путем комбинирования химической и ферментативной модификации. Protein Sci. 2006. 15: 640–646. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 76. Дейл Р.Э., Эйзингер Дж., Блумберг В.Е. Ориентационная свобода молекулярных зондов — фактор ориентации во внутримолекулярной передаче энергии. Биофиз Дж. 1979; 26: 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 77. Schuler B, Lipman EA, Steinbach PJ, Kumke M, Eaton WA. Полипролин и «спектроскопическая линейка» заново с флуоресценцией одиночных молекул.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2005; 102: 2754–2759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 78. Ротвелл П.Дж. и др. Многопараметрическая флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул выявляет гетерогенность комплексов обратной транскриптазы ВИЧ-1: праймер / матрица. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 1655–1660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 79. Rasnik I, Myong S, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера реп-геликазы E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением: исследования одной молекулы флуоресцентно меченых ферментов.J Mol Biol. 2004; 336: 395–408. [PubMed] [Google Scholar] 81. Кламм Дж. П., Дениз А. А.. Трехцветный резонансный перенос энергии флуоресценции одной молекулы. Chemphyschem. 2005; 6: 74–77. [PubMed] [Google Scholar] 82. Хайнце К.Г., Янц М., Швилле П. Анализ совпадений трех цветов: еще один шаг в изучении образования молекулярных комплексов более высокого порядка. Биофиз Дж. 2004; 86: 506–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 83. Капанидис А.Н. и др. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий с помощью переменного лазерного возбуждения отдельных молекул.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101: 8936–8941. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 85. Ли Н.К. и др. Трехцветное переменное лазерное возбуждение отдельных молекул: мониторинг множественных взаимодействий и расстояний. Биофиз Дж. 2007; 92: 303–312. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 86. Heilemann M, et al. Многоступенчатая передача энергии в одиночных молекулярных фотонных проволоках. J Am Chem Soc. 2004; 126: 6514–6515. [PubMed] [Google Scholar] 87. Ланг М., Фордайс П., Энг А., Нойман К., Блок С. Комбинированная флуоресцентная и силовая микроскопия.Biophys J. 2003; 84: 301a – 301a. [Google Scholar] 88. Tarsa PB, et al. Обнаружение индуцированных силой молекулярных переходов с резонансным переносом энергии флуоресценции. Angew Chem Int Ed. 2007; 46: 1999–2001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 89. Шрофф Х. и др. Биосовместимый датчик силы с оптическим считыванием и размерами 6 нм (3) Nano Lett. 2005; 5: 1509–1514. [PubMed] [Google Scholar] 90. Hohng S, et al. Флуоресцентно-силовая спектроскопия отображает двумерный ландшафт реакций холлидея.Наука. 2007. 318: 279–283. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 92. Harms GS, et al. Зондирование конформационных изменений ионных каналов грамицидина с помощью флуоресцентной микроскопии с фиксацией одиночных молекул. Биофиз Дж. 2003; 85: 1826–1838. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 93. Tan E, et al. Четырехстороннее соединение ускоряет складывание шпилечного рибозима через дискретное промежуточное соединение. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 9308–9313. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 94. Хогланд Р. Справочник по флуоресцентным датчикам и исследовательским продуктам.9-е. Молекулярные зонды; Юджин, штат Орегон: 2002. [Google Scholar] 95. Jager M, Michalet X, Weiss S. Взаимодействие белков с белками как инструмент для сайт-специфической маркировки белков. Protein Sci. 2005. 14: 2059–2068. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 96. Ратнер В., Кахана Е., Эйхлер М., Хаас Э. Общая стратегия сайт-специфичного двойного мечения глобулярных белков для кинетических исследований FRET. Bioconjug Chem. 2002; 13: 1163–1170. [PubMed] [Google Scholar]

Одномолекулярный FRET поддерживает модель с двумя состояниями действия Argonaute

DOI: 10.4161 / rna.27446. Epub 2013 20 декабря.

Принадлежности Расширять

Принадлежности

• ¹ Physikalische und Theoretische Chemie — NanoBioSciences; Технический университет Брауншвейга; Hans-Sommer-Strasse 10; Брауншвейг, Германия.
• ² Физический факультет; Оснабрюкский университет; Barbarastrasse 7; Оснабрюк, Германия.

Бесплатная статья PMC

Элемент в буфере обмена

Адриан Зандер и др. RNA Biol. 2014 г.

Бесплатная статья PMC Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

DOI: 10.4161 / rna.27446. Epub 2013 20 декабря.

Принадлежности

• ¹ Physikalische und Theoretische Chemie — NanoBioSciences; Технический университет Брауншвейга; Hans-Sommer-Strasse 10; Брауншвейг, Германия.
• ² Физический факультет; Оснабрюкский университет; Barbarastrasse 7; Оснабрюк, Германия.

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplay

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Argonaute можно найти во всех трех сферах жизни и является функциональным ядром эукариотического механизма подавления РНК.Чтобы пролить свет на конформационные изменения, которые управляют действием Argonaute, мы провели измерения FRET одной молекулы, используя пока не охарактеризованного члена семейства Argonaute, а именно Argonaute из архейного организма Methanocaldococcus jannaschii (MjAgo). Мы показываем, что MjAgo является каталитически активным вариантом Argonaute, гидролизующим исключительно целевые цепи ДНК из гибрида ДНК / ДНК. Мы изучили взаимодействие между Argonaute и нуклеиновыми кислотами, используя флуоресцентные красители, ковалентно прикрепленные в разных положениях ДНК-проводника в качестве стерических репортеров.Это позволило нам определить структурно ограниченные части белкового каркаса и гибкие области ДНК-проводника. Измерения FRET одной молекулы демонстрируют, что 3′-конец ДНК-направляющей высвобождается из домена PAZ при загрузке цепи-мишени. Это конформационное изменение требует не расщепления целевой цепи, а полностью комплементарной целевой цепи. Таким образом, наши данные поддерживают модель с двумя состояниями для действия Argonaute.

Ключевые слова: Археи; Аргонавт; FRET; стратегия подавления янтаря; биофизика; динамика; флуоресценция; флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул.

Цифры

Рисунок 1. Гомологическая модель Argonaute из…

Рис. 1. Гомологическая модель Argonaute из Methanocaldococcus jannaschii .( A ) Белок…

Рис. 1. Гомологическая модель Argonaute из Methanocaldococcus jannaschii . ( A ) Белок состоит из N-концевого домена (синий), домена Piwi-Argonaute-Zwille (PAZ) (лосось), домена MID (оранжевый) и домена PIWI (зеленый). ( B ) Гомологическая модель M. jannaschii Argonaute с использованием Argonaute из P. furiosus (PDB: 1Z25) в качестве структуры шаблона.Сайты модификации флуорофора в положении аспарагина 76, серина 221 и изолейцина 410 выделены красным. ( C ) Структурное совмещение модели M. jannaschii (окрашено в голубой цвет) со структурой P. furiosus Argonaute (окраска домена согласно панели A ). Среднеквадратичное отклонение Cα мишени-матрицы составляет 1,45 Å. Координированный ион металла выделен розовой сферой. Стрелка указывает на движение наружу PAZ и N-концевого домена Argonaute при загрузке целевой цепи.См. Также рисунки S2 и S3 и таблицу S2.

Рисунок 2. Взаимодействие M. jannaschii Argonaute…

Рисунок 2. Взаимодействие M. jannaschii Argonaute с одноцепочечной и двухцепочечной ДНК.( А )…

Рисунок 2. Взаимодействие M. jannaschii Argonaute с одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. ( A ) Образование комплекса между MjAgo (0, 1, 3, 5 мкМ) и направляющими цепями (333 нМ), которые различаются по положению прикрепления красителя (нуклеотид 13, 14, 18). ( B ) Количественная оценка фракции связанной ДНК как функции положения красителя и концентрации MjAgo. Цифры отражают количество связанной ДНК по сравнению с количеством ДНК, связанной 5 мкМ MjAgo, с использованием маркированного указателя ДНК в положении 18 (установлено на 1).Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение не менее трех независимых экспериментов. См. Также рисунки S4 и S5. ( C ) EMSA, демонстрирующая образование комплекса между MjAgo (2,8 мкМ) и цепью ДНК _{, направляющей} , направляющей ДНК _, / РНК _{, мишенью} и ДНК _{, направляющей} / ДНК _{, мишенью} , меченной флуоресцентным красителем Atto550 в разных положениях направляющей (13 и 18). Кроме того, в эксперимент была включена дцДНК, несущая несовпадение в положениях 10-11 (обозначена как m18).( D ) EMSA, демонстрирующая образование комплекса между MjAgo (2,8 мкМ) и ДНК-_{-направляющей} / РНК-_{-мишенью} и ДНК-_{-направляющей} / ДНК-_{-мишенью} , меченной флуоресцентным красителем Atto550 на 3′-конце направляющая прядь. Все нуклеиновые кислоты были использованы в концентрации 333 нМ. Для сравнения загружают образование комплекса с дцДНК, меченной в положении 13, и одноцепочечной ДНК. ( E ) EMSA, показывающая образование комплекса между MjAgo (2,8 мкМ) и оцДНК _{, направляющая} , оцДНК _{, мишень} или дцДНК с двойной меткой (направляющая: модификация Atto550 в положении 18, цель: модификация Alexa647 в положении 17).Флуоресценция Atto550 показана зеленым цветом, флуоресценция Alexa647 — красным, а совместная локализация флуоресценции Atto550 и Alexa647 — желтым цветом. Все нуклеиновые кислоты были использованы в концентрации 333 нМ в EMSA, показанных на этом рисунке.

Рисунок 3. Каталитическая активность M. jannaschii…

Рисунок 3. Каталитическая активность M. jannaschii Argonaute. ( A ) Направляющая и мишень…

Рисунок 3. Каталитическая активность M. jannaschii Argonaute. ( A ) Последовательности направляющей и целевой цепи получены из miRNA let-7 человека и для справки показаны как дуплекс ДНК, который эффективно расщепляется MjAgo. Сайт модификации Alexa647 (AF647) в целевой цепи выделен красным цветом, а сайты расщепления указаны стрелками.( B ) Реакции расщепления проводили с использованием 0,6 мкМ MjAgo, 1,7 мкМ DNA _guide и 0,72 мкМ DNA _target при 85 ° C. Реакции прекращались в указанные моменты времени. Дорожка, обозначенная «Т», относится к контрольной реакции в отсутствие MjAgo, проводимой в идентичных условиях. Продукты расщепления разделяли на 12% денатурирующем полиакриламидном геле. MjAgo эффективно расщепляет ДНК из дуплекса ДНК / ДНК, но расщепления не происходит, если направляющей цепью или цепью-мишенью является РНК.Целевая цепь также не будет расщепляться, если дуплексная ДНК несет несоответствие в положениях 10 и 11 («несовпадение» целевой ДНК, T ^m ). ( C ) Температурная зависимость реакции расщепления. MjAgo эффективно расщепляет ДНК из дуплекса ДНК / ДНК при температурах выше 75 ° C (реакции останавливались через 10 мин). ( D ) Расщепление не происходит, если направляющая цепь ДНК исключена из реакции или в реакцию добавлен EDTA (конечная концентрация 50 мМ).

Рисунок 4. Изменения конформации между положением 18…

Рис. 4. Конформационные изменения между положением 18 в направляющей нити и доменами MjAgo…

Рисунок 4. Конформационные изменения между положением 18 в направляющей цепи и доменами MjAgo при переходе от бинарного комплекса к тройному.Показаны гистограммы эффективности E FRET для свободно диффундирующих бинарных и тройных комплексов MjAgo, и каждая гистограмма была получена из сотен всплесков флуоресценции, обнаруженных от меченых комплексов через конфокальное пятно (см. Также рис. S10). Донорный краситель Atto550 расположен на нуклеотиде 18 направляющей цепи, и были образованы комплексы с MjAgo, модифицированным акцепторным красителем DyLight650 либо в N-концевом домене (N76AzF, правый столбец), либо в домене PAZ (S221AzF, средний столбец) или домен MID (N76AzF, левый столбец).Гистограммы были подогнаны к модели с одним или двумя гауссами для определения средней эффективности FRET (красная линия: сумма гауссианов). Первый ряд: MjAgo, загруженный ДНК _{, направляющая} (бинарный комплекс). Второй ряд: MjAgo, загруженный направляющей и целевой нитью (тройной комплекс). Третий ряд: MjAgo, загруженный направляющей и целевой цепью, несущей несоответствие в сайте расщепления (нуклеотид 10–11), формируя пузырек в дуплексе ДНК.

Рисунок 5. Изменения конформации между положением 13…

Рисунок 5. Конформационные изменения между положением 13 в направляющей нити и доменами MjAgo…

Рисунок 5. Конформационные изменения между положением 13 в направляющей цепи и доменами MjAgo при переходе от бинарного комплекса к тройному.Гистограммы эффективности FRET для бинарных (первая строка) и тройных комплексов (вторая строка), содержащих направляющую цепь, меченную на нуклеотиде 13 с помощью Atto550 и MjAgo, модифицированную акцепторным красителем DyLight650 либо в домене PAZ (S221AzF, правый столбец), либо в домене MID ( N76AzF, левая колонка). Гистограммы были подогнаны к модели с одним или двумя гауссами для определения средней эффективности FRET (красная линия: сумма гауссианов). Анализ данных, как на рисунке 5.

Рисунок 6. Модель, изображающая предлагаемую конформационную…

Рисунок 6. Модель, изображающая предполагаемые конформационные изменения в MjAgo при загрузке целевой цепи. The…

Рисунок 6. Модель, изображающая предполагаемые конформационные изменения в MjAgo при загрузке целевой цепи. Модель основана на имеющихся структурных данных и данных FRET одиночных молекул, представленных в этой работе.5 ‘конец 3′ конец направляющей нити (синий) прочно закреплен в доменах MID и PAZ MjAgo (домены имеют цветовую кодировку, как на рис. 1). Введение объемных фрагментов в положения 13 и 14 не прерывает образование комплекса, но стерически сложные зонды лучше переносятся на нуклеотиде 18, что указывает на то, что сеть взаимодействия ДНК-белок в этой области менее выражена. Изогнутая одноцепочечная ДНК в бинарном комплексе размещается в каньоне связывания нуклеиновой кислоты белка, но образование жесткой спирали ДНК при загрузке цепи-мишени вызывает высвобождение 3′-конца направляющей ДНК из домена PAZ.Согласно нашим данным по одной молекуле, 3’-конец направляющей цепи наиболее вероятно расположен между N-концевым и PIWI-доменом, когда комплекс эволюционирует до своего тройного состояния, а N-концевой и PAZ-домены принимают свое полностью открытое состояние. Это конформационное изменение не требует расщепления цепи-мишени, но комплекс является компетентным для расщепления, поскольку нуклеотиды 10 и 11 (выделены оранжевым) все еще находятся в непосредственной близости от каталитической тетрады и двух каталитических ионов магния (показаны темно-серыми сферами).

Похожие статьи

• Механистические взгляды на свойства связывания и расщепления субстрата аргонавтов архей и человека.

  Willkomm S, Zander A, Grohmann D, Restle T. Willkomm S, et al. PLoS One. 2016 14 октября; 11 (10): e0164695. DOI: 10.1371 / journal.pone.0164695. eCollection 2016. PLoS One.2016 г. PMID: 27741323 Бесплатная статья PMC.

• Независимое от гидов расщепление ДНК архейным Argonaute из Methanocaldococcus jannaschii.

  Zander A, Willkomm S, Ofer S, van Wolferen M, Egert L, Buchmeier S, Stöckl S, Tinnefeld P, Schneider S, Klingl A, Albers SV, Werner F, Grohmann D. Зандер А. и др. Nat Microbiol. 2017 20 марта; 2: 17034. DOI: 10,1038 / нмикробиол.2017.34. Nat Microbiol. 2017 г. PMID: 28319081

• Флуоресцентное маркирование сайт-специфичного аргонавта для биоанализов на основе FRET.

  Willkomm S, Zander A, Grohmann D. Willkomm S, et al. Методы Мол биол. 2017; 1517: 291-304. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-6563-2_20. Методы Мол биол. 2017 г. PMID: 27

  0

• Эволюционное путешествие белков Argonaute.

  Свартс, Д.К., Макарова К., Ван И, Наканиши К., Кеттинг Р.Ф., Кунин Е.В., Патель Д.Д., ван дер Ост Дж. Swarts DC и др. Nat Struct Mol Biol. 2014 сентябрь; 21 (9): 743-53. DOI: 10.1038 / nsmb.2879. Nat Struct Mol Biol. 2014 г. PMID: 251

  Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.

• Конформационная динамика Ago-опосредованных процессов молчания.

  Willkomm S, Рестле Т.Willkomm S, et al. Int J Mol Sci. 2015 г., 1 июля; 16 (7): 14769-85. DOI: 10.3390 / ijms160714769. Int J Mol Sci. 2015 г. PMID: 26140373 Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.

Процитировано

31 статей

• Молекулярная и спектроскопическая характеристика зеленых и красных цианиновых флуорофоров из серии Alexa Fluor и AF *.

  Гебхардт К., Леманн М., Рейф М.М., Захариас М., Геммекер Г., Кордес Т. Gebhardt C, et al. Chemphyschem. 2021 4 августа; 22 (15): 1566-1583. DOI: 10.1002 / cphc.202000935. Epub 2021 29 июня. Chemphyschem. 2021 г. PMID: 34185946 Бесплатная статья PMC.

• Белки-аргонавты: структуры и их эндонуклеазная активность.

  Цзинь С., Чжан Дж., Чжоу Ю.Джин С. и др. Mol Biol Rep.2021 Май; 48 (5): 4837-4849. DOI: 10.1007 / s11033-021-06476-w. Epub 2021 11 июня. Мол Биол Реп.2021. PMID: 34117606 Рассмотрение.

• Экспрессия и функциональный анализ белка Argonaute Thermus thermophilus (TtAgo) в E. coli BL21 (DE3).

  Xing J, Ma L, Cheng X, Ma J, Wang R, Xu K, Mymryk JS, Zhang Z.Xing J, et al. Биомолекулы. 2021 31 марта; 11 (4): 524. DOI: 10.3390 / biom11040524. Биомолекулы. 2021 г. PMID: 33807395 Бесплатная статья PMC.

• Программируемая нуклеаза pAgo с универсальным проводником и целевой специфичностью из мезофильной бактерии Kurthia massiliensis.

  Кропочева Е., Кузьменко А., Аравин А.А., Есюнина Д., Кульбачинский А. Кропочева Е, и др.Nucleic Acids Res. 2021, 19 апреля; 49 (7): 4054-4065. DOI: 10.1093 / нар / gkab182. Nucleic Acids Res. 2021 г. PMID: 33744962 Бесплатная статья PMC.

• Ключевые механистические принципы и соображения относительно интерференции РНК.

  Свобода П. Свобода П. Фронтальный завод им. 2020 13 августа; 11: 1237. DOI: 10.3389 / fpls.2020.01237. Электронная коллекция 2020. Фронтальный завод им. 2020.PMID: 32

  2 Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.

Типы публикаций

• Поддержка исследований, за пределами США. Правительство

Условия MeSH

• Белки аргонавта / химия *
• Белки аргонавта / метаболизм *
• Передача энергии резонанса флуоресценции / методы *
• Метанокальдококк / энзимология *
• Метанокалдококк / генетика
• Структура белка, третичная
• Гомология последовательностей, аминокислота

LinkOut — дополнительные ресурсы

• Полнотекстовые источники

• Прочие источники литературы

• Исследовательские материалы

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Понимание того, как биомолекулы соединяют структурную динамику с функцией, лежит в основе нескольких дисциплин и остается выдающейся целью биологии.Связывание конформационных состояний и их переходов с биохимической функцией требует способности точно определять структуру и динамику биологической системы, которая часто изменяется при связывании лиганда или находится под влиянием химических и физических свойств окружающей среды. Наиболее хорошо зарекомендовавшие себя инструменты структурной биологии предоставили с высоким разрешением «снимки» состояний в кристаллизованной или замороженной форме (например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия одиночных частиц, криоЭМ) или усредненное по ансамблю всех конформаций. (е.g., ядерный магнитный резонанс, ЯМР; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, МУРР; малоугловое рассеяние нейтронов, МУРН; двойной электронно-электронный резонанс, DEER; поперечно-сшивающая масс-спектрометрия, XL-MS; ансамбль-FRET). В последние годы дальнейшие разработки позволили этим традиционным структурным инструментам обнаруживать конформационную динамику и промежуточные продукты реакции. Например, методы ЯМР (Anthis and Clore, 2015; Clore and Iwahara, 2009; Palmer, 2004; Ravera et al., 2014; Sekhar and Kay, 2019) и методы электронного парамагнитного резонанса (Jeschke, 2018; Jeschke, 2012; Krstić). и другие., 2011) были продвинуты для изучения конформационной динамики и захвата временных промежуточных соединений. Кристаллографические исследования с временным разрешением использовались для определения функционально релевантных структурных смещений, связанных с биологической функцией (Kupitz et al., 2014; Moffat, 2001; Schlichting et al., 1990; Schlichting and Chu, 2000; Schotte et al., 2003). ). Достижения в микрожидкостных устройствах для смешивания и распыления позволили использовать криоЭМ с временным разрешением (Feng et al., 2017; Kaledhonkar et al., 2018) и масс-спектрометрию с поперечными связями (XL-MS или CL-MS) (Braitbard et al., 2019; Brodie et al., 2019; Чен и др., 2020; Якобуччи и др., 2019; Мураками и др., 2013; Славин, Калисман, 2018). Прогресс в вычислительных методах также предоставил новые инструменты для изучения биомолекулярной структуры и динамики. Каждое из этих достижений подчеркивает возросшее понимание того, что необходимо напрямую и непрерывно отслеживать динамические свойства отдельных биомолекул, чтобы понять их функции и регуляцию.

В этом контексте FRET (называемый резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера [Braslavsky et al., 2008]) исследования на ансамблевом и одномолекулярном уровнях стали важными инструментами для измерения структурной динамики по крайней мере на 12 порядков во времени и картирования конформационных и функциональных неоднородностей биомолекул в условиях окружающей среды. Исследования FRET, исследующие затухание флуоресценции на уровне ансамбля (Grinvald et al., 1972; Haas et al., 1975; Haas, Steinberg, 1984; Hochstrasser et al., 1992) (FRET с временным разрешением) позволили уже в начале 1970-х годов исследование структурных неоднородностей на временах, превышающих время жизни флуоресценции (несколько нс).Этот подход используется до сих пор (Becker, 2019; Orevi et al., 2014; Peulen et al., 2017) и перенесен в исследования одиночных молекул. Возможность измерения FRET в отдельных молекулах (Deniz et al., 1999; Ha et al., 1996; Lerner et al., 2018a) сделала этот метод еще более привлекательным. Одномолекулярный FRET (smFRET) широко используется для изучения конформационной динамики и биомолекулярных взаимодействий в стационарных условиях (Dupuis et al., 2014; Larsen et al., 2019; Lerner et al., 2018а; Lipman et al., 2003; Маргиттай и др., 2003; Мазаль и Аран, 2019; Michalet et al., 2006; Ореви и др., 2014; Ray et al., 2019; Sasmal et al., 2016; Schuler et al., 2005; Schuler et al., 2002; Steiner et al., 2008; Zhuang et al., 2000). Примечательно, что во многих механистических исследованиях достаточно использовать FRET для различения различных конформаций и определения кинетических скоростей, так что абсолютные эффективности FRET и, следовательно, расстояния не нужно определять. Однако возможность точного измерения расстояний и кинетики с помощью smFRET привела к его появлению в качестве важного инструмента в эту новую эру « динамической структурной биологии » для картирования биомолекулярных неоднородностей и измерения структурной динамики в широком диапазоне временных масштабов (Lerner и другие., 2018а; Мазаль и Аран, 2019; Санабрия и др., 2020; Шулер и Хофманн, 2013; Weiss, 1999).

Одномолекулярные методы FRET (smFRET) имеют много преимуществ в качестве метода структурной биологии, в том числе:

• чувствительность к макромолекулярным расстояниям (2,5–10 нм),

• способность разрешать структурные и динамические неоднородности,

• высококачественных измерений с низким потреблением образцов интересующих молекул (низкие концентрации и низкие объемы), поскольку образец анализируется по одной молекуле за раз,

• определение структурных переходов в равновесии, следовательно, без необходимости синхронизации,

• возможность обнаружения (очень) редких событий.Действительно, в биологии наиболее интересными молекулами для изучения часто являются редкие, функционально активные молекулы среди моря неактивных молекул,

• высокая чувствительность и специфичность для меченых молекул. Поскольку только меченая молекула вносит уникальный вклад в детектируемый сигнал, эти индикаторы также могут применяться в качестве FRET-репортеров в тесноте (Dupuis et al., 2014; Soranno et al., 2014; Zosel et al., 2020b) (отсюда smFRET может использоваться для проверки результатов, полученных изолированно, или обнаружения модуляции конформационных предпочтений и / или структурной динамики посредством так называемых пяти взаимодействий [Guin and Gruebele, 2019]), и

• высокая специфичность для остатков / доменов за счет специфической маркировки.Биомолекулы могут быть специально помечены уникальной парой красителей, что позволяет проводить измерения smFRET для всех размеров молекул, включая большие сложные сборки (см. Рисунок 1 [Kilic et al., 2018]), активные биологические машины (например, рибосомы) ( Dunkle et al., 2011) и даже на целых нативных вирионах (Lu et al., 2019; Munro et al., 2014).

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

( A ) Интеграционное моделирование требует структурной и динамической информации. Предварительная информация из традиционных подходов (рентген, ЯМР, криоЭМ) вместе с вычислительными инструментами определяет пространство возможных решений для структурного моделирования с помощью FRET. Комбинация структурной (расстояния между красителями) и динамической информации (кинетическая связь и обменные курсы) позволяет идентифицировать непротиворечивую модель. ( B ) Изучение структуры и динамики хроматиновых волокон.Комбинированное TIRF и конфокальное FRET исследование структуры и динамики хроматиновых волокон с использованием трех позиций маркировки FRET (DA1-3) для двух пар красителей с различными расстояниями Ферстера. Расстояния Фёрстера (определены в разделе Расстояния между красителями, уравнение 6). Предварительная структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (вверху слева) (Song et al., 2014) и рентгеновской кристаллографии (вверху, справа PDB ID: 1ZBB Schalch et al., 2005), объединена со структурной и динамической информацией. полученные в результате экспериментов FRET на иммобилизованных молекулах, измеренных с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), и на свободно диффундирующих молекулах с помощью конфокальной микроскопии (Kilic et al., 2018). На основе объединенной информации получается согласованная модель конформаций хроматиновых волокон со смещенными регистрами, которые связаны медленными (> 100 мс) и быстрыми процессами декомпакции (150 мкс), которые не протекают напрямую, а скорее через открытое волокно. конформация. Рисунок 1B был воспроизведен с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, Nature Communications с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /).

© 2018, Kilic et al. Панель B была воспроизведена с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

Несколько методов были использованы для определения структурных ансамблей, таких как ЯМР, одночастичная криоЭМ или XL-MS, а недавно также smFRET в интегративном / гибридном (I / H) подходе с компьютерным моделированием для преодоления разреженности экспериментальных данных. относительно атомистического описания (Берман и др., 2019; де Соуза и Пикотти, 2020; Димура и др., 2020; Gauto et al., 2019; Кукос и Бонвин, 2020; На и Пэк, 2020; Тан и Гонг, 2020; Webb et al., 2018). Структурные модели I / H, полученные из экспериментов smFRET с использованием расстояний между красителями в качестве ограничений, были описаны для гибких свернутых белков (Brunger et al., 2011; Hellenkamp et al., 2017; Margittai et al., 2003; McCann et al., 2012). ), конформационные ансамбли неупорядоченных / неструктурированных и развернутых белков (Borgia et al., 2018; Holmstrom et al., 2018; Schuler et al., 2020), нуклеиновые кислоты и комплексы белок-нуклеиновая кислота (Craggs et al., 2019; Craggs, Kapanidis, 2012; Kalinin et al., 2012; Lerner et al., 2018b; Muschielok et al., 2008). ; Возняк и др., 2008).

Еще одним уникальным аспектом исследований smFRET является то, что структурная, кинетическая и спектроскопическая информация о больших и сложных системах может быть записана одновременно в одном измерении. Это облегчает объединение динамической и структурной информации в интегративный подход к (рис. 1A) (Hellenkamp et al., 2017; Килич и др., 2018; Ли и др., 2020b; Санабрия и др., 2020; Вассерман и др., 2016; Янез Ороско и др., 2018):

.

• определяют количество возможных структур, согласующихся с данными,

• потенциально снижает неоднозначность между различными структурными моделями, совместимыми с экспериментальными данными, а

• раскрывают структурно разрешенные динамические пути обмена.

В качестве примера на рисунке 1B показан результат мультимодального исследования smFRET конформационного ландшафта 12-мерного массива хроматина (~ 2.5 MDa) (Kilic et al., 2018) с динамикой, происходящей во временных масштабах от наносекунд до часов. SmFRET эксперименты могут обнаруживать гибкие конформации хроматина (рис. 1B, средняя панель), показывая их динамическую структурную неоднородность (рис. 1B, нижняя панель), в отличие от хорошо упорядоченных статических структур хроматиновых волокон (рис. 1B, верхняя панель). Эти гибкие, частично открытые и открытые конформации, которые довольно многочисленны в растворе (популяция> 70%; рис. 1B, нижняя панель), не были разрешены ранее, хотя они необходимы для правильной организации и функции гена.Они представляют собой центральный узел взаимопревращений для отдельных регистров стэкинга хроматина и их трудно обнаружить с помощью других структурных методов. Такой подход к визуализации биомолекул в действии в условиях окружающей среды подчеркивает важность их динамической природы, разрешая переходы между различными конформационными состояниями, что во многих случаях способствует их функции (Aviram et al., 2018; Henzler-Wildman et al., 2007; Iljina et al., 2020; Lerner et al., 2018b; Sanabria et al., 2020; Tassis et al., 2020).

Измерения

SmFRET обычно выполняются с использованием двух подходов: с использованием иммобилизованных на поверхности молекул с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) и обнаружения на основе камеры или со свободно диффундирующими молекулами в растворе с использованием конфокальной микроскопии и точечных детекторов. Экспериментальные системы доступны в продаже, но, как правило, их изготавливают самостоятельно. Образцы подготавливаются, а данные собираются с использованием протоколов для конкретных лабораторий, где данные хранятся в различных форматах файлов и анализируются с использованием набора все более мощного программного обеспечения.Для полевых исследований в целом и для структурных исследований в частности важно продемонстрировать, что smFRET как метод воспроизводим и надежен независимо от того, где и как измеряется образец. С этой целью под руководством Торстена Хугеля двадцать лабораторий объединились для измерения smFRET на нескольких конструкциях дцДНК (Hellenkamp et al., 2018a). Изучая шесть различных образцов с разными красителями и различными расстояниями между красителями, средняя эффективность FRET, полученная участвующими лабораториями, показала удивительно высокую степень согласия (ΔE между 0.02 и 0,05 в зависимости от деталей образца). Количественная оценка и воспроизводимость измерений smFRET на основе интенсивности и обсуждение анализа данных стали важной вехой. Эти стандарты дцДНК FRET теперь доступны для ежедневной калибровки и особенно полезны для новых групп, присоединяющихся к сообществу.

Вдохновленный идеями, полученными в ходе вышеупомянутой попытки FRET (Hellenkamp et al., 2018a), были начаты новые многолабораторные слепые исследования.Следующее сравнительное исследование FRET, проведенное Thorben Cordes, исследует надежность и надежность экспериментов smFRET на белках, претерпевающих индуцированные лигандом конформационные изменения (Gebhardt et al., В стадии подготовки). В этом исследовании используются два различных модельных белка для оценки воспроизводимости и точности smFRET на основе белков для измерения расстояния между красителями. Белковые системы ставят новые задачи, включая статистическую маркировку красителей, специфические для сайта свойства красителей, стабильность белков, транспортировку, хранение и конформационную динамику.Следовательно, в исследовании также оценивается способность smFRET обнаруживать и количественно оценивать динамику в различных временных масштабах от микросекунд до секунд. Еще одна задача FRET, инициированная Соней Шмид, — это программа kinSoftChallenge (http://www.kinsoftchallenge.com, Götz et al., В стадии подготовки), которая оценивает существующие инструменты для извлечения кинетической информации из временных траекторий одиночных молекул. Эта задача направлена ​​на: (1) продемонстрировать способность кинетического анализа на основе smFRET точно выводить динамическую информацию и (2) предоставить сообществу средства оценки различных доступных программных инструментов.

Одним из важных результатов различных исследований FRET в нескольких лабораториях было то, что, хотя согласие было хорошим, его можно было улучшить еще больше. В частности, анализ данных и, в частности, исправления могут повлиять на определенную эффективность FRET и результирующие расстояния. Следовательно, открытое обсуждение того, какие подходы работают наиболее надежно, при каких условиях необходимо. Доступ к первичным данным и возможность их обработки с помощью различных подходов к анализу были и останутся наиболее прозрачным способом продвижения вперед в этой области.В настоящее время это сложно, учитывая множество вариантов используемых методов, их документации, форматов файлов и экспериментальных процедур, применяемых в разных лабораториях, для установления оптимальных условий, рабочего процесса и передовых практик даже для существующих, хорошо протестированных методов, поскольку сравнение этих методов затруднительно. требует много времени, а необходимая информация во многих случаях недоступна. С расширением открытых научных практик и представлением опубликованных данных в репозитории необходим консенсус относительно того, какие данные и метаданные следует хранить и в каких возможных форматах, чтобы их могло легко использовать сообщество.

В связи с этими соображениями и многочисленными возможностями для роста сообщества smFRET, несколько лабораторий, обладающих опытом в FRET, без претензии на исчерпывающий или исключительный характер, собрались, чтобы поддержать эти усилия и предложить шаги по организации сообщества вокруг последовательной и открытой науки. практики. Это действие переводится в общие методологические рекомендации или предложения, которые мы представляем после типичного рабочего процесса эксперимента smFRET, включая подготовку и определение характеристик образцов, описание установки, сбор и сохранение данных, а также анализ данных.Эти рекомендации о том, как «практиковать» smFRET, являются , а не попыткой упорядочить сообщество, а скорее первоначальным предложением, которое направлено на поощрение открытого диалога о существующих практиках в нашей области и приводит к более высокой воспроизводимости результатов экспериментов smFRET. Затем мы обсуждаем практику открытой науки, а также первые шаги, которые были предприняты для формирования международного сообщества FRET. В завершение мы выделим несколько областей, в которых smFRET окажет большое влияние в различных областях науки в ближайшем будущем.

Гибкий инструмент

для понимания FRET в сложных геометрических формах

1.

Введение

Флуоресцентная спектроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — важный инструмент для исследования структуры и функций биологических систем. FRET основан на спонтанной безызлучательной передаче энергии от возбужденного донора к подходящему акцептору. Вероятность этой передачи энергии, известная как эффективность FRET, показывает зависимость в 6-й степени от разделения донора и акцептора. ¹ FRET полезен для определения близости молекул и измерения межмолекулярных и внутримолекулярных расстояний в диапазоне от 10 до 100 Å. Среди множества других приложений FRET использовался для исследования структуры и динамики биомолекул, ^{2 — 4} изучал агрегационное поведение белков и липидов в мембранной среде, ^{5 — 8} и характеризуют полимерные материалы. ^{9 , 10}

Количественные измерения FRET часто стремятся связать эффективность FRET и разделение донор-акцептор.Это соотношение хорошо определено для одной пары донор-акцептор. Однако многие современные приложения FRET включают в себя несколько доноров и акцепторов, и в результате исходное выражение единственного расстояния не может использоваться. Один из способов решения этой проблемы — разработать аналитическое выражение, описывающее FRET для конкретного расположения доноров и акцепторов, уникальных для интересующей системы. Целью этого подхода является получение функции, которая связывает эффективность FRET с интересующей величиной, такой как радиус тетрамерного массива флуорофоров или плотность флуорофоров внутри мембраны.Аналитические методы использовались для обнаружения и характеристики микродоменов в мембранах, ^{11 — 13} для мониторинга липидных и белковых взаимодействий, ^{14 , 15} и для исследования белков, которые образуют олигомерные комплексы. ^{16 — 19} Одно из преимуществ аналитических выражений состоит в том, что они однозначно описывают эффективность FRET для определенного распределения флуорофора. Тем не менее, это преимущество также становится ограничением, поскольку эти модели часто плохо переносятся на другие системы.Кроме того, аналитические выражения часто бывают сложными даже для относительно простых систем, и может потребоваться подгонка необходимых параметров, чтобы сделать их пригодными для анализа. Другой недостаток заключается в том, что большинство аналитических методов не подходят для моделирования неравномерного распределения флуорофоров.

Численные методы, такие как моделирование методом Монте-Карло (MCS), хорошо подходят для моделирования даже сложной конфигурации флуорофоров и, таким образом, представляют собой альтернативу аналитическим выражениям.Серия исследований продемонстрировала, что численные методы полезны для анализа и интерпретации данных экспериментов FRET. Wolber et al. ²⁰ и Towles et al. ¹³ использовал результаты MCS для проверки аналитических выражений. Сингх и Райку ²¹ исследовали FRET в однородных и гетерогенных распределениях флуорофоров и использовали MCS для сравнения различных методов анализа данных FRET. Berney and Danuser ²² сравнили различные методы измерения и количественной оценки эффективности FRET и использовали MCS для получения независимых эталонных значений.Frederix et al. ²³ показали, что MCS может помочь в интерпретации данных микроскопических экспериментов, моделируя FRET между флуорофорами на актиновых филаментах, включая эффект фотообесцвечивания. Численные методы оказались особенно полезными при моделировании неоднородного распределения липидов и белков в мембранном окружении. Frazier et al. ²⁴ использовали MCS для интерпретации результатов экспериментов FRET и исследования фазового разделения липидной смеси. Zimet et al. ²⁵ смоделировал FRET между донорами, связанными с мембранными белками, и акцепторами, связанными с липидами, чтобы изучить влияние краудинга на квантовый выход донора. Снайдер и Фрейре ²⁶ разработали численный метод для описания донорного тушения флуорофоров в мембранах. Кишковски и Кенуорти ²⁷ использовали MCS, чтобы продемонстрировать, что FRET можно использовать для обнаружения и характеристики микродоменов в мембранах, изучая влияние кластеризации на эффективность FRET.

В отличие от аналитических выражений, численные методы не определяют FRET как функцию определенного свойства или уникального расположения флуорофоров.Скорее, они моделируют FRET, генерируя набор координат донора и акцептора, которые имитируют реальное распределение флуорофоров, обнаруженное в эксперименте. Эффективность FRET тогда просто вычисляется как функция донорно-акцепторного разделения всех возможных пар. При реализации с использованием модульного подхода численные методы являются гибкими и могут использоваться для исследования FRET в системах с различной геометрией или распределением флуорофоров без необходимости повторной разработки метода.

В предыдущей статье, ²⁸ мы представили простую и гибкую схему расчета Монте-Карло, которая была реализована с помощью программы FORTRAN под названием ExiFRET.Эта программа может использоваться для моделирования FRET для заданного распределения флуорофоров, представленных координатами, которые определяют их местоположение в пространстве. Система состоит из отдельных флуорофоров, которые случайным образом распределены в двух или трех измерениях, или флуорофоров, которые расположены в правильной геометрии, например, когда они связаны в пары или пентамеры. В этой статье мы представляем удобную веб-версию этой программы, которая включает множество расширений из предыдущей программы. Целью этих расширений было повышение гибкости программы, что позволило ей генерировать координаты флуорофора для имитации большого диапазона экспериментов.Кроме того, это также позволяет нам предлагать эксперименты, которые могут быть полезны для получения структурной информации из сложных систем.

В дополнение к существующей функциональности, расширения программы включают следующие возможности:

• • генерировать координаты флуорофора, которые могут моделировать хосты, содержащие только доноры или акцепторы. Это полезно для моделирования экспериментов, в которых флуорофоры прикреплены к отдельным молекулам. Например, для мониторинга самоассоциации белков и липидов или сообщения о близости лиганда и его целевого белка.

• • обеспечить фиксированную стехиометрию доноров и акцепторов в каждом хосте. Это полезно для моделирования гетеромерных белков с известной стехиометрией субъединиц.

• • смоделируйте снижение эффективности этикетирования, чтобы количественно оценить его влияние на эффективность FRET.

• • модель FRET для флуорофоров, которые расположены в кластеры (т. Е. Агрегированы в круглые микродомены). Это может помочь в анализе экспериментов FRET, направленных на мониторинг поведения агрегации липидов и белков в мембранной среде.

• • рассчитать FRET для набора предоставленных пользователем координат флуорофора. Это позволяет использовать программу для моделирования FRET для любой конфигурации флуорофоров.

• • для моделирования FRET между флуорофорами с ограниченными ориентациями, учитывая положение флуорофора в пространстве, ориентацию и подвижность диполей перехода.

ExiFRET доступен в виде веб-версии, которая позволяет выполнять программу в режиме онлайн.Результат можно получить с веб-сайта в виде простых текстовых файлов. Веб-сайт (www.exifret.com) также содержит документацию по всем входным параметрам и примеры входных файлов для данных, представленных в этом документе.

Остальная часть статьи организована следующим образом: Раздел «Методы» содержит краткое изложение схемы моделирования Монте-Карло и описывает, как новые параметры были реализованы в существующей программе. В разделе «Результаты» приведены некоторые примеры того, как эти новые входные параметры могут использоваться для исследования ряда различных экспериментов FRET.

2.

Методы

Схема моделирования Монте-Карло, представленная в этой статье, является расширением ранее описанной ExiFRET. ²⁸ В следующем разделе представлен только краткий обзор шагов, необходимых для получения координат флуорофоров и расчета эффективности FRET, а также перечислены основные теоретические допущения. Для более подробного описания отдельных шагов и теоретических оснований читатель отсылается к предыдущей публикации. ²⁸

2.1.

Схема моделирования Монте-Карло

Целью схемы моделирования является расчет эффективности FRET для различных расположений флуорофоров в двух или трех измерениях. Система моделирования определяется набором параметров, которые предоставляются пользователем как входной файл. В таблице 1 дано краткое описание основных входных параметров. Процесс FRET моделируется путем моделирования входящего излучения как серии дискретных фотонов, которые «проигрываются» в соответствии с заранее определенным графиком.Поступающие фотоны, которые поглощаются, вызывают возбуждение доступного донора. Релаксация донора может происходить за счет флуоресценции или передачи энергии доступному акцептору. Время релаксации выбирается исходя из константы скорости этих процессов. Общая эффективность FRET рассчитывается путем подсчета количества событий флуоресценции и передачи энергии.

Таблица 1

Значения и значения входных параметров для программы ExiFRET. Примеры входных файлов можно найти на сайте ExiFRET (www.exifret.com).

Параметр	Допустимые значения	Значение
Координаты пользователя	Верно или неверно	Верно: координаты флуорофора предоставляются пользователем как входной файл. Неверно: координаты флуорофора генерируются программой.
Размер системы	2 или 3	Флуорофоры расположены в 2-D или 3-D
Гексагональных олигомерах	Истинно или ложно	Используется для моделирования системы с n-мегаугольником .Верно: образует гексагонально упакованные олигомеры. Ложь: создает n-мерки, в которых флуорофоры распределены по кругу (2-D) или сфере (3-D).
Размер n-мер	≥1	При n = 1 отдельные флуорофоры распределяются случайным образом. При n = 2 флуорофоры связаны попарно с определенным разделением. При n≥3 флуорофоры распределяются по радиусу круга (2-D или 3-D системы) или сферы (только 3-D системы).
Радиус	≥0	Определяет размер числа.Радиус можно рассматривать как радиус белка-хозяина, к которому прикреплены зонды.
Плотность	> 0	Плотность, при которой n-меры распределяются по системе, в н-мерах на Å2 (2-D) или n-мерах на Å3 (3-D).
da стехиометрия	Верно или неверно	Верно: применяется фиксированная стехиометрия доноров и акцепторов в каждом н-мере, что определяется количеством акцепторов на каждый и доноров на каждый номер. мер.Неверно: дает n-мерные смешанные стехиометрии.
da отдельный	Верно или неверно	Верно: каждый n-мер содержит только доноров или только акцепторов. Неверно: флуорофоры случайным образом назначаются в качестве доноров или акцепторов и, следовательно, производят n-меры, содержащие как доноры, так и акцепторы
Второй радиус	Верно или неверно	Верно: используются два разных радиуса, чтобы избежать перекрытия хозяев и для определения разделения флуорофоров для расчета эффективности FRET.
Избегать перекрытия	Верно или неверно	Верно: флуорофоры расположены так, что никакие n-меры не перекрываются за счет использования исключенного объема вокруг каждого n-мера. Неверно: исключенный объем не используется, и n-мерные числа могут перекрываться.
Плоские числа	Верно или неверно	Активно, только если размерность системы равна 3. Верно: числа распределены в плоскости (т. Е. В кольце). Ложь: распределено в сфере.
Кластеры	Верно или неверно	Верно: n-меры расположены в кластеры.Система определяется размером кластера и количеством кластеров. Неверно: n-меры расположены в случайном и однородном распределении.
R0	≥1	Характерное расстояние донорно-акцепторной пары, в Å
Конфигурации	≥1	Количество конфигураций, используемых для расчета средней эффективности FRET данной системы.
Вероятность донора (Pdonor)	0	Вероятность того, что какой-либо флуорофор является донором (в зависимости от отношения d∶a).
Эффективность маркировки (l)	0	Определяет долю сайтов, которые помечены как донор или акцептор.
Частицы	≥1	Число n-мер.
Фотоны	≥1	Количество поглощенных фотонов, используемых для каждой конфигурации.
Энергия излучения	> 0	Энергия освещающего лазера, Вт / мкм2.
Длина волны	> 0	Длина волны освещающего лазера в нм.
Коэффициент экстинкции	> 0	Коэффициент экстинкции донора, см-1M-1.
Время жизни донора	> 0	Время жизни флуоресценции донора в отсутствие акцептора в нс.
Время жизни акцептора	> 0	Время жизни флуоресценции акцептора в нс.

На рисунке 1 схематично показаны этапы расчета эффективности FRET.На шаге 1 создается набор координат флуорофора в двух или трех измерениях на основе входных параметров. Координаты генерируются процедурой отжига, которая предотвращает перекрытие флуорофоров. Моделирование позволяет получить частицы регулярной геометрии путем отнесения флуорофоров к так называемым n-мерам, которые состоят из n флуорофоров, связанных в фиксированной относительной ориентации. Для n = 1 отдельные флуорофоры распределяются случайным образом; в то время как для n = 2 флуорофоры связаны парами.Для n ≥ 3 флуорофоры равномерно распределены либо по кругу, либо по сфере (только 3-D) с заданным радиусом, либо гексагонально упакованы в плотные олигомеры (2-D). На этапе 2 флуорофорам случайным образом назначается тип (донор или акцептор), при этом обеспечивается соотношение донор-акцептор (Pdonor) и стехиометрия (дастохиометрия, дасепарат), как определено во входном файле. Вероятность переноса каждой возможной пары донор-акцептор на основе разделения флуорофоров и предоставленного значения R0 рассчитывается на этапе 3.График возбуждения подготовлен для моделирования потока фотонов, генерируемых лазером (шаг 4). Скорость, с которой фотоны попадают в систему, зависит от интенсивности света, которая моделируется путем расчета потока фотонов на основе освещенности и длины волны лазера. Количество фотонов, поглощаемых флуорофором, зависит от количества доноров в системе и коэффициента экстинкции. Хотя предыдущие расчеты ²⁸ показывают, что типичные значения лазерной освещенности не оказывают существенного влияния на эффективность FRET, следует соблюдать осторожность при использовании ярких лазеров или акцепторов с длительным сроком службы.На шаге 5 передача энергии моделируется воспроизведением фотонов по заранее заданному расписанию. Для каждого фотона алгоритм случайным образом выбирает донора из ранее сгенерированного списка. В этот список не входят доноры, которые ранее были взволнованы и не расслабились. Донор выделяет свою энергию посредством флуоресценции или передачи энергии акцептору в зависимости от относительной вероятности каждого процесса. Процесс проигрывания фотонов повторяется для всего графика возбуждения. Общий подсчет флуоресценции и событий FRET сохраняется и впоследствии используется для расчета эффективности FRET для этой конкретной конфигурации флуорофоров (этап 6).Вся процедура, шаги с 1 по 6, повторяется для большого количества конфигураций (мы обычно используем> 1000), чтобы вычислить среднюю эффективность FRET для заданного набора входных параметров.

Рис. 1

Схематическое изображение шагов, задействованных в схеме моделирования Монте-Карло для расчета эффективности FRET для любого расположения флуорофоров.

Все расширения, описанные в разд. 2.3, помимо случая ограниченной ориентации, касается расположения флуорофоров.Следовательно, описанные расширения включали только изменения в модули, которые генерируют координаты флуорофора и назначают типы флуорофора (этапы 1 и 2). Общая схема моделирования входящих фотонов и расчета эффективности FRET для данной конфигурации остается неизменной. Примеры входных файлов можно найти на сайте ExiFRET (www.exifret.com).

2.2.

Допущения

Расчеты в ExiFRET основаны на серии предположений, которые могут повлиять на достоверность и применимость прогнозируемой эффективности FRET:

• • Алгоритм не моделирует передачу между 2 донорами или 2 акцепторами (гомо-FRET ) или множественные события передачи для одиночных пакетов энергии.

• • Каждый фотон, поглощенный донором, имеет одну из двух судьб: он высвобождается посредством флуоресценции или передает энергию доступному акцептору. Хотя в действительности возбужденное состояние донора может распадаться другими механизмами, они не моделируются в ExiFRET. Это предположение не влияет на результаты наших расчетов, поскольку эффективность FRET рассчитывается из отношения количества фотонов, высвобождаемых в результате флуоресценции, и количества фотонов, которые претерпевают передачу энергии, и это останется неизменным, если некоторые фотоны потеряны из донора. другими механизмами распада.Точно так же механизм снятия возбуждения акцептора не влияет на режим релаксации донора и, следовательно, не меняет соотношение событий FRET и флуоресценции.

• • В расчетах предполагается, что при наличии нескольких акцепторов FRET квант энергии либо высвобождается от донора, либо передается в сумме только одному из присутствующих акцепторов. Более того, путь переноса каждого донора независим, и, таким образом, общая скорость переноса для данного донора является суммой индивидуальных путей переноса (называемая «кинетической моделью» ²⁹ ).Общая эффективность FRET суммируется по всем донорам. Эти предположения были хорошо подтверждены для случаев нескольких флуорофоров, в частности, путем измерения FRET в растворе, ^{28 , 30} или случаев с одним донором и несколькими акцепторами, ³¹ , хотя недавнее исследование ставит под сомнение их достоверность. в конкретных ситуациях. ²⁹

• • Величина R0 зависит, помимо прочего, от относительной ориентации диполей донорного и акцепторного переходов, определяемой коэффициентом ориентации κ2.Алгоритм ExiFRET не предполагает какого-либо конкретного значения для κ2, а вместо этого оставляет его на усмотрение пользователя через значение R0 во входном файле.

• • Процедура отжига, которая присваивает координаты флуорофора, гарантирует, что никакие n-меры не перекрываются за счет использования исключенного объема вокруг каждого n-мера, где не может находиться другой флуорофор. При желании эту опцию можно отключить.

• • После возбуждения донора в момент времени Te он остается возбужденным в течение периода Td.Донор недоступен до времени Te + Td. Td зависит от скорости высвобождения энергии от донора, которая определяется временем жизни незатушенного донора, количеством доступных акцепторов и вероятностями передачи всех донорно-акцепторных пар.

• • Аналогично, если акцептор становится возбужденным, он остается возбужденным в течение периода Ta, который зависит от времени жизни акцептора. Хотя на самом деле акцептор будет возбужден только через промежуток времени после снятия возбуждения донора; здесь мы предполагаем, что акцептор недоступен в интервале времени Te + Ta.

2.3.

Новые входные параметры

2.3.1.

Кластеризация флуорофоров

Мы расширили процедуру отжига, чтобы обеспечить генерацию координат для флуорофоров, расположенных в круглые кластеры (только для 2-D). Рисунок 2 иллюстрирует разницу между случайным расположением и флуорофорами, которые собраны в кластеры. Эти микродомены моделируются как ряд независимых кольцевых областей с высокой концентрацией флуорофора, что определяется количеством кластеров и их размером (определяемым их радиусом).Процедура отжига случайным образом распределяет кластеры в системе, избегая перекрывающихся областей. Каждый флуорофор случайным образом назначается кластеру, который создает области с разной локальной плотностью, в то же время обеспечивая общесистемную плотность флуорофора, определенную во входном файле. Та же процедура отжига повторно используется для случайного распределения флуорофоров в каждом кластере, тем самым создавая окончательный набор координат флуорофоров, которые используются для расчета эффективности FRET.

Фиг.2

ExiFRET можно использовать для моделирования FRET для флуорофоров с однородным распределением (b) или сгруппированными в кластеры (a).

2.3.2.

Присвоение типа флуорофора

В исходной схеме моделирования флуорофоры случайным образом назначаются как доноры или акцепторы, так что общесистемное соотношение донор-акцептор соответствует входному параметру Pdonor. Новый ввод, daseparate, позволяет пользователю генерировать n-меры, содержащие только доноры или акцепторы (см. Раздел 3.1 и рис.4). Новый параметр, дастохиометрия, позволяет пользователю контролировать стехиометрию доноров и акцепторов в каждом n-мере. Хотя эта процедура обеспечивает фиксированное соотношение доноров и акцепторов, их точное положение в каждом n-мере по-прежнему выбирается случайным образом.

2.3.3.

Размер n-мер

Флуорофоры, которые расположены в правильной геометрии, очень полезны для моделирования FRET в мультимерных белках, где флуорофоры присоединены к индивидуальным субъединицам.В расчетной схеме размер n-мер определяется радиусом круга или сферы, на которой флуорофоры распределены в фиксированной относительной ориентации. Этот радиус используется в двух шагах алгоритма. Во-первых, он используется в процедуре отжига, чтобы избежать перекрытия молекул-хозяев. Во-вторых, радиус используется для размещения самих флуорофоров вокруг хозяина. Фактически, теперь для этих двух задач можно определить два разных радиуса: 1. Радиус, описывающий размер молекулы-хозяина, чтобы избежать перекрытия n-меров; 2.радиус, который определяет n-мер, образованный флуорофорами, который определяет положения флуорофоров (см. рис. 8, вставка). Чтобы использовать два разных радиуса, логический входной параметр (второй радиус) устанавливается в значение true; в противном случае используется только больший радиус.

2.3.4.

Эффективность маркировки

Снижение эффективности маркировки может значительно снизить наблюдаемую эффективность FRET. Новый входной параметр позволяет пользователю указать эффективность маркировки для моделирования влияния немаркированных сайтов на конечную эффективность FRET.Вместо простого масштабирования конечного результата расчета по эффективности маркировки входной параметр используется при назначении типов флуорофора. В дополнение к донорам и акцепторам был создан новый тип частиц, известный как «пустые». Назначение этих пустых сайтов является случайным, так что каждый флуорофор в системе с равной вероятностью является немеченым сайтом. Эффективность маркировки (le) эффективно снижает общее количество флуорофоров, так что nempty = ntotal- (1 * le), nacceptor = ntotal * le * (1-Pdonor) и ndonor = ntotal * le * Pdonor

2.3.5.

Координаты, предоставляемые пользователем

Расширенная версия ExiFRET позволяет пользователю предоставить текстовый файл с положениями и типами набора координат флуорофора для описания любой желаемой системы. В этом случае шаги 1 и 2 в алгоритме (рис. 1) пропускаются, а координаты x, y и z, а также тип флуорофора считываются из текстового файла. Другие параметры расчета, такие как донорно-акцепторное соотношение и плотность флуорофора, рассчитываются на основе входных данных.Затем схема расчета переходит к этапам с 3 по 5. Единственное отличие состоит в том, что в этом случае эффективность FRET рассчитывается для одной конфигурации, предоставляемой пользователем, и, следовательно, окончательный результат не усредняется по многим конфигурациям.

3.

Результаты

3.1.

Фоновая концентрация

Одним из способов использования FRET является определение расстояния между двумя конкретными сайтами в молекуле на основе измерения эффективности FRET между донором и акцептором, которые прикреплены к одному и тому же хозяину (внутримолекулярный FRET).Любое возникновение FRET между молекулами-хозяевами (межмолекулярный FRET) может мешать этим внутримолекулярным событиям. Вероятность межмолекулярного FRET увеличивается с увеличением плотности хозяина, например, в образцах с высокой концентрацией молекул хозяина, или из-за увеличения локальной концентрации, вызванной скоплением молекул хозяина. Это увеличение межмолекулярного FRET вызовет систематическую ошибку и нарушит любые попытки использовать эффективность FRET донорно-акцепторной пары одного и того же хозяина.Обычно невозможно экспериментально определить относительные вклады межмолекулярного и внутримолекулярного FRET в общую наблюдаемую эффективность FRET, поэтому наличие межмолекулярного FRET вносит неопределенность. ExiFRET можно использовать для построения графика зависимости эффективности FRET от разделения флуорофоров (для данной плотности флуорофоров), который включает FRET как из меж-, так и внутримолекулярного FRET и позволяет правильно определять внутримолекулярные расстояния. На рисунке 3 (а) показана взаимосвязь между эффективностью FRET и донорно-акцепторным разделением одного хозяина для различных средних плотностей молекул хозяина, распределенных в 2-D.Эффективность FRET сильно различается при разных концентрациях хозяина, даже при фиксированном разделении донор-акцептор для каждого хозяина.

Рис. 3

(a) Эффективность FRET в зависимости от разделения флуорофора для хозяев, распределенных в двумерной среде, содержащей одну пару донор-акцептор для серии различных поверхностных плотностей n-мер (отмеченных рядом с каждой кривой в единицах × 10-3 Å2). (b) ExiFRET можно использовать для количественной оценки вклада меж- и внутримолекулярного FRET в общую эффективность FRET, как показано для белков-хозяев (n-меров), распределенных в среде, содержащей одну донорно-акцепторную пару.Общая эффективность FRET увеличивается с увеличением поверхностной плотности из-за увеличения вероятности межмолекулярного FRET. Значения основных параметров показаны на рисунке. Полный и репрезентативный входной файл для этого и последующих цифр представлен на веб-сайте (www.exifret.com).

Также можно использовать ExiFRET для количественной оценки вкладов меж- и внутримолекулярного FRET в общую наблюдаемую эффективность FRET как функцию от поверхностной плотности. На рис. 3 (б) это показано для хозяев, содержащих одну донорно-акцепторную пару.

В качестве альтернативы, оценка меж- и внутримолекулярного FRET также может быть получена путем сравнения графиков эффективности FRET в зависимости от поверхностной плотности систем с различными комбинациями смешанных и отдельных донорно-акцепторных хозяев [Рис. 4 (а)]. Новые входные параметры, daseparate и dastoichiometry, были использованы для определения трех случаев одинаково расположенных флуорофоров, которые показывают различные комбинации меж- и внутримолекулярного FRET. В случае 1 стехиометрия доноров и акцепторов в каждом n-мере не фиксирована, и присутствуют как смешанные, так и отдельные хозяева (dastoichiometry = false, daseparate = false).Следовательно, возможны как меж-, так и внутримолекулярный FRET. В случае 2 каждый n-мер состоит из пары донор-акцептор, обеспечивая фиксированную стехиометрию (dastoichiometry = true, daseparate = false). Это увеличивает вероятность внутримолекулярного FRET, что приводит к увеличению общей эффективности FRET. Случай 3 описывает n-меры, которые содержат либо только доноры, либо только акцепторы, и, следовательно, исключает возможность внутримолекулярного FRET (dastoichiometry = false, daseparate = true). Это снижает общую эффективность FRET.При условии, что уровень межмолекулярного FRET одинаков во всех случаях, вклад внутримолекулярного FRET в случаях 1 и 2 может быть определен путем вычитания эффективности FRET для случая 1 из эффективности FRET для случая 2 или 3. Мы подтвердили это, вычислив относительную вклады меж- и внутримолекулярной FRET для каждого случая [Рис. 4 (b)] и обнаружил, что все три случая показывают очень похожие уровни межмолекулярной эффективности FRET. Следовательно, этот подход может быть полезен для оценки относительного вклада меж- и внутримолекулярного FRET в диапазоне концентраций флуорофора.Другой интересный результат моделирования этих трех случаев заключается в том, что внутримолекулярный FRET уменьшается с увеличением поверхностной плотности. Это означает, что вклад внутримолекулярного FRET в общую эффективность FRET уменьшается, поскольку межмолекулярный FRET начинает конкурировать с внутримолекулярным FRET.

Рис. 4

Эффективность FRET в зависимости от плотности флуорофора для трех различных протоколов мечения хозяев с двумя флуорофорами, распределенными в 2-D. Сравнение эффективности FRET в трех случаях может быть использовано для количественной оценки вклада меж- и внутримолекулярного FRET.(а) Общая эффективность FRET для каждого случая. (б) Меж- и внутримолекулярный FRET для каждого случая. Обратите внимание, что внутримолекулярный FRET всегда равен 0 для случая 3. Случай 1: каждый сайт имеет равную вероятность быть донором или акцептором (сплошные линии). Случай 1 моделируется с использованием dastoichiometry = false, daseparate = false. Случай 2: у каждого хозяина есть один донор и один акцептор (пунктирные линии). Случай 2 моделируется с использованием dastoichiometry = true, daseparate = false. Случай 3: у каждого хоста есть два донора или два акцептора (пунктирные линии).Случай 2 моделируется с использованием dastoichiometry = false, daseparate = true.

3.2.

Мультимерные белки и олигомеры

Еще одно возможное использование FRET — изучение физических размеров олигомерных белков. В предыдущих исследованиях использовались аналитические выражения или численные методы для определения взаимосвязи между эффективностью FRET и радиусом олигомера ^{28 , 32 , 33} или количеством задействованных субъединиц.Adair и Engelman ³⁴ показали, что FRET можно использовать для различения димеров и более крупных олигомеров. Более поздние исследования показали, что можно количественно оценить количество субъединиц в более крупных олигомерных белках и оценить долю белков, которые остаются в виде мономеров. ^{16 — 19 , 35} Преимущество использования численных методов, как описано здесь, состоит в том, что они могут учитывать межмолекулярный FRET (см.3.1) и может моделировать кластеры олигомеров (см. Раздел 3.3).

На рис. 5 мы показываем, как эффективность FRET зависит от физического размера олигомеров для олигомеров, содержащих от двух до восьми субъединиц с флуорофором на каждом мономере, который случайным образом назначается донором или акцептором. Этот график подчеркивает тот факт, что ни одна из этих линий не соответствует соотношению 1 / R6, которое можно было бы ожидать для донорно-акцепторных пар. Наличие такого графика имеет решающее значение при использовании FRET для количественного исследования структурных изменений, которые происходят в мультимерных белках, таких как ионные каналы. ^{32 , 33}

Фиг.5

FRET в мультимерных белках. Эффективность FRET показана в зависимости от радиуса мультимера в 2-D для ситуации, в которой каждая субъединица имеет равную вероятность удержания донора или акцептора. Цифры рядом с каждой кривой относятся к количеству субъединиц в мультимере (размер n-мер). Справа показаны различные мультимеры.

ExiFRET также показывает, как количество субъединиц в олигомере может быть определено из соответствующих экспериментов FRET.На рисунке 6 показаны графики зависимости эффективности FRET от вероятности донора (т. Е. Отношения донора к акцептору) для ряда кольцевых олигомеров с увеличивающимся числом субъединиц. Хотя все графики имеют схожую форму, максимальная эффективность FRET показывает систематический сдвиг влево с увеличением количества субъединиц.

Рис. 6

Эффективность FRET показана в зависимости от вероятности донора для серии олигомеров увеличивающегося размера n-мер (указаны рядом с каждой кривой), распределенных в 2-D.Радиус мультимера в каждом случае выбирается таким, чтобы эффективность FRET составляла 0,5 при вероятности донора = 0,5.

Графики зависимости эффективности FRET от радиуса мультимера также могут быть использованы для исследования влияния фиксированной стехиометрии различных субъединиц в гетеромерных белках на эффективность FRET. На рис. 7 показаны графики зависимости эффективности FRET от мультимерного радиуса для серии пентамеров с различной стехиометрией доноров и акцепторов по сравнению с пентамерами со случайной стехиометрией.Прогнозирование влияния стехиометрии субъединиц на эффективность FRET может быть полезно для исследования мультимерных белков неизвестной стехиометрии.

Рис. 7

Эффективность FRET в зависимости от радиуса мультимера для набора пентамерных белков с различной стехиометрией доноров и акцепторов.

При использовании FRET для определения радиуса мультимерного белка может потребоваться учитывать размер флуоресцентного зонда относительно размера молекулы хозяина.Наблюдаемая эффективность FRET основана на положениях флуорофора, которые не обязательно равны положениям субъединиц хозяина, к которым прикреплены зонды. Если размер флуоресцентного зонда мал по сравнению с размером хозяина, эта разница в положениях может не иметь значения. Однако при использовании больших флуоресцентных зондов или длинных линкеров могут возникнуть значительные различия (см. Рис. 8, вставка). На рисунке 8 показан график зависимости эффективности FRET от плотности флуорофора, который был рассчитан с учетом и без учета размера флуоресцентного зонда для пентамеров размером 50 Å с зондами с длиной линкера 12 Å.Результаты показывают, что отклонения в эффективности FRET могут достигать 10%.

Рис. 8

График зависимости эффективности FRET от вероятности донора для флуорофоров, расположенных в пентамеры, которые равномерно распределены в 2-D. Сплошная линия: радиус r1 (38 Å) использовался, чтобы избежать перекрытия пентамеров, а r2 (50 Å) использовался для генерации координат флуорофора и расчета эффективности FRET с учетом размера флуорофоров. Пунктирная линия: единственный радиус (r2) используется для определения положений пентамеров, координат флуорофора и расчета эффективности FRET.

3.3.

Эффективность маркировки

Неспособность пометить каждый целевой сайт на белке-хозяине снизит наблюдаемую эффективность FRET, что приведет к неопределенности при использовании данных для количественного анализа. ExiFRET можно использовать для количественной оценки влияния снижения эффективности маркировки на эффективность FRET. На рис. 9 мы изображаем зависимость эффективности FRET от разделения флуорофора в тетрамерных структурах флуорофоров для ряда эффективностей мечения. Как и ожидалось, уменьшение процента помеченных сайтов снижает итоговую эффективность FRET.Если оценки вероятной эффективности маркировки можно определить экспериментально, такие графики можно использовать для учета неэффективной маркировки или для получения оценок неопределенности, которая вносится в эффективность FRET.

Рис. 9

Графики зависимости эффективности FRET от разделения флуорофоров для серии тетрамеров, распределенных в 2-D с различной эффективностью мечения, как показано рядом с каждой кривой.

3.4.

Присутствие кластеров или микродоменов

Образование микродоменов в мембранной среде было связано с рядом физиологических процессов; следовательно, важно понимать распределение и агрегацию липидов и белков в мембранной среде.Использование анизотропии флуоресценции и экспериментов FRET для изучения пространственной организации и совместной локализации белков в мембранах было впервые продемонстрировано Варма и Майор ³⁶ и Кенуорти. ³⁷ Ряд последующих исследований ^{7 , 8 , 38} подтвердили использование FRET для индикации агрегации и обнаружения микродоменов (обзоры см. В ссылках 5 и 6). Этот метод использует тот факт, что агрегация доноров и акцепторов в микродоменах вызывает локальное увеличение концентрации флуорофора, что приводит к увеличению эффективности FRET по сравнению с системами со случайным и однородным распределением флуорофоров. ^{7 , 25 , 39} Однако, как отметили Кишковски и Кенуорти, ²⁷ наличие увеличенного FRET не является достаточным доказательством, чтобы продемонстрировать существование кластеров; но зависимость FRET от свойств, таких как плотность флуорофора, должна использоваться для различения микродоменов и однородных случайных распределений частиц. Для кластерного распределения можно ожидать, что эффективность FRET будет меньше зависеть от общей концентрации флуорофора (т.е.е., поверхностная плотность) в отличие от линейной зависимости при случайном и однородном распределении. ^{7 , 39} Zacharias et al. ⁴⁰ использовали тот же аргумент в экспериментах FRET для исследования кластеризации модифицированных липидами зеленых флуоресцентных белков. Чтобы продемонстрировать это, мы использовали ExiFRET для подготовки графиков зависимости эффективности FRET от поверхностной плотности флуорофора для случайных и кластерных распределений. Результаты на рис. 10 (а) подтверждают, что отсутствие изменения FRET с увеличением поверхностной плотности сигнализирует о наличии кластеров.

Рис. 10

(a) Графики зависимости эффективности FRET от поверхностной плотности флуорофора для произвольно расположенных флуорофоров (некластеризованных) и флуорофоров, расположенных в кластеры с низкой и высокой плотностью. Отсутствие изменений в эффективности FRET может использоваться для обнаружения кластеров, в то время как величина эффективности FRET определяет локальную концентрацию в кластере. (b) Эффективность FRET показана в зависимости от поверхностной плотности флуорофора, когда либо размер кластера такой же, но внутренняя плотность варьируется (нижняя линия), либо внутренняя плотность фиксирована, но размер кластера изменяется (верхняя линия).

Помимо простого обнаружения наличия кластеров, FRET также может быть полезен для извлечения информации о внутридоменной плотности флуорофоров и размере кластера. Рисунок 10 (b) показывает, что эффективность FRET зависит от поверхностной плотности флуорофора внутри домена, а также от физического размера домена. Аналогичные результаты были получены в исследовании FRET методом Монте-Карло для дисковых доменов. ²⁷ Они показали, что внутридоменный FRET полностью описывается локальной акцепторной плотностью.Однако вывести размер кластеров из эффективности FRET — гораздо более сложная задача, поскольку часто не существует единственного решения. Различные комбинации размера кластера и плотности внутри домена могут привести к одинаковой эффективности FRET. Кишковски и Кенуорти ²⁷ обнаружили, что моделирование, в котором доноры и акцепторы совместно локализованы внутри микродоменов, не может быть использовано для извлечения размера кластера. Наше собственное моделирование совместно локализованных донорно-акцепторных кластеров подтвердило это, поскольку мы обнаружили, что эффективность FRET показывает очень небольшие изменения в большом диапазоне размеров кластеров (для постоянной плотности внутри доменов).Тем не менее, Кишковски и Кенуорти показали, что можно определить радиус домена независимо от плотности внутри домена, выполнив моделирование, в котором доноры и акцепторы не колокализованы, а где доноры агрегированы в домены, окруженные равномерно распределенными акцепторами. ²⁷ Аналогичным образом Towles et al. ¹³ представил метод, который использует аналитическую модель в сочетании с симуляциями Монте-Карло для извлечения размера домена наноразмерных липидных рафтов из данных FRET с временным разрешением, хотя этот метод требует априорных знаний фазовой диаграммы мембранной системы. ведется расследование.Sharma et al. ³⁸ использовали гомо-FRET и теоретический анализ, основанный на аналитических выражениях, для изучения размера и поверхностной организации гликозилфосфатидилинозитол (GPI) -якоренных белков в мембранах живых клеток.

Результаты на Рисунке 10 и ранее опубликованные результаты ^{7 , 27} демонстрируют, что численные методы, такие как ExiFRET, могут быть очень полезны для разработки методов использования FRET для исследования микродоменов и поведения агрегации липидов и липидов. белки.Гибкость таких методов означает, что кластеры, образованные отдельными флуорофорами или мультимерными белками и олигомерами, можно изучать без необходимости корректировки метода расчета FRET.

3.5.

Флуорофоры с ограниченной ориентацией

Все примеры, обсужденные до сих пор, не рассматривают напрямую относительную ориентацию флуорофоров. Скорее, для этих расчетов используется общесистемное значение R0. На практике значение R0 включает информацию об относительной ориентации флуорофоров через так называемый фактор ориентации κ2.Хотя использование общесистемного значения R0 не обязательно подразумевает конкретное значение κ2, оно не позволяет значению R0 зависеть от конкретного направления, в котором разделяются флуорофоры, и того, как это соотносится с ориентацией флуорофора. переходные диполи.

Чтобы включить ориентацию флуорофора непосредственно в схему расчета Монте-Карло, мы написали вторую программу под названием thetaFRET. Это имеет меньшую функциональность для генерации координат флуорофоров, но может использоваться для расчета вероятной эффективности FRET набора флуорофоров, когда известна как информация об их положениях, так и некоторая информация об их ориентации.В этом случае положения флуорофоров выгружаются из файла координат аналогично параметру координат, создаваемому пользователем в ExiFRET. Кроме того, ориентации флуорофоров моделируются на основе случайного движения внутри конуса, которое описывается средней ориентацией диполя перехода и углом конуса в качестве дополнительных столбцов в файле координат. Эффективность FRET может быть рассчитана либо в режиме динамического ориентационного усреднения, в котором движение флуорофора предполагается быстрее, чем время передачи энергии (таким образом, κ2 усредняется по множеству возможных ориентаций флуорофора), либо в статическом режиме усреднения ориентации, в котором эффективность FRET рассчитывается для каждого мгновенного набора ориентаций флуорофора.

В качестве примера этой программы на рис. 11 (a) мы рассматриваем эффективность FRET пары флуорофоров, разделенных расстоянием, эквивалентным R0, при вычислении с учетом κ2 = 2/3. Здесь мы строим график эффективности FRET как функции свободы ориентации флуорофоров, как описано размером угла конуса, в котором они могут двигаться. При угле конуса θ = 90 градусов красители обладают полной ориентационной свободой, а в случае режима динамического усреднения κ2 = 2/3 и, таким образом, эффективность FRET равна 0.5. Однако по мере уменьшения ориентационной свободы флуорофоров эффективность FRET резко меняется. κ2 зависит от взаимной ориентации средних диполей перехода. В этом случае его значение возрастает до 4, когда диполи выровнены параллельно друг другу и направлению их разделения (E∼0,86), и до 1, когда диполи параллельны друг другу, но перпендикулярны направлению разделения (E = 0,6). Примечательно, что эффективность FRET всегда ниже в статическом режиме ориентационного усреднения, чем в эквивалентном динамическом случае.

Рис. 11

Эффективность FRET для флуорофоров с ограниченной ориентацией. (а) Эффективность FRET показана для пары флуорофоров в зависимости от их ориентационной свободы (измеряется углом конуса θ). Во всех случаях ориентации диполей перехода параллельны, но в верхних линиях они также параллельны направлению разделения флуорофоров, а в нижних линиях они перпендикулярны этому направлению. Сплошные и пунктирные линии показывают результаты, которые предполагают динамический режим ориентационного усреднения, а пунктирные линии показывают эквивалентные результаты, которые предполагают статические средние значения.(b) Эффективность FRET представлена ​​как функция угла между средней ориентацией диполей перехода донора и акцептора (ϕ), где диполи перпендикулярны направлению их разделения. Результаты показаны в предположении, что диполь перехода может перемещаться в пределах конуса под углом 0, 30, 60 и 90 градусов. Во всех случаях угол конуса θ донора и акцептора равен.

Рис. 12

Примеры входных файлов для Рис. 3 (a). Индивидуальные графики создаются путем изменения параметров density_min и density_max.

Рис. 13

Примеры входных файлов для Рис. 3 (b). (внутримолекулярный FRET). Меж- и внутримолекулярный FRET может быть рассчитан с использованием параметров da_stoichiometry и da_separate (см. Также рис. 4).

Рис. 14

Примеры входных файлов для Рис. 4. Случай 1.

Рис. 15

Примеры входных файлов для Рис. 4. Случай 2.

Рис. Случай 3.

Рис. 17

Примеры входных файлов для Рис.Индивидуальные графики создаются путем изменения параметра nmer_size.

Рис. 18

Примеры входных файлов для Рис. 6. Отдельные графики создаются путем изменения параметров nmer_size и P_donor, radius_min и radius_max были изменены таким образом, что эффективность FRET = 0,5 при P_donor = 0,5.

Рис. 19

Примеры входных файлов для Рис. 7. Отдельные графики создаются путем изменения параметров da_stoichiometry, d_per_nmer и a_per_nmer.

Фиг.20

Примеры входных файлов для рис. 8. Отдельные графики создаются путем изменения параметров nmer_size и P_donor.

Рис. 21

Примеры входных файлов для Рис. 9. Отдельные графики создаются путем изменения параметра labeling_efficiency.

Рис. 22

Примеры входных файлов для Рис. 10 (a). Индивидуальные графики создаются путем изменения параметров cluster, n_cluster и radius_cluster.

Рис. 23

Примеры входных файлов для Рис.10 (б). Индивидуальные графики создаются путем изменения параметров n_clusters и radius_cluster.

Чтобы дать пример того, когда эта программа может быть полезной, мы указываем на рис. 11 (b), как ее можно использовать для получения структурной информации. Здесь мы вычисляем эффективность FRET как функцию угла между диполями перехода донора и акцептора (ϕ), предполагая, что они оба лежат в плоскости, перпендикулярной направлению их разделения. Это может быть полезно, например, если мы пытаемся определить скручивание или изгиб нити ДНК с помощью флуорофоров, которые были плотно встроены в молекулу (тем самым ограничивая ориентацию молекулы), как в случае с флуорофорами, которые являются нуклеиновыми. базовые аналоги. ⁴¹ Если флуорофоры не имеют свободы ориентации (т. Е. Θ = 0), то эффективность FRET изменяется от 0,6, когда флуорофоры параллельны, до 0,0, когда они перпендикулярны. По мере того как флуорофоры становятся более подвижными (с увеличением угла конуса θ), изменение FRET с углом поворота ϕ уменьшается. В случае аналогов нуклеиновых кислот угол конуса очень мал, ⁴¹ , и, таким образом, подобный график можно использовать для соотнесения измеренной эффективности FRET непосредственно с закручиванием нити ДНК.

4.

Заключительные замечания

Примеры, представленные в этой статье, и упомянутые исследования демонстрируют универсальность и возможности FRET для получения структурной информации о биомолекулах и для исследования агрегации белков и липидов в мембранной среде. Однако это исследование также подчеркивает важность учета наличия более чем одной пары флуорофоров при анализе данных. Результаты показали, что взаимосвязь между эффективностью FRET и разделением флуорофоров может сильно отклоняться от обычно используемого отношения 1 / R6 для флуорофоров, расположенных в правильной геометрии, например, в мультимерных белках или олигомерах.Мы разработали схему моделирования Монте-Карло и реализовали ее в гибкой и удобной программе под названием ExiFRET, которая позволяет пользователю моделировать FRET для отдельных флуорофоров, которые случайным образом распределены в двух или трех измерениях, и флуорофоров, связанных попарно или расположенных в правильной геометрии. Мы продемонстрировали, как ExiFRET можно использовать для оценки неопределенности эффективности FRET, вызванной снижением эффективности мечения, моделировать FRET в мультимерных белках и олигомерах и исследовать флуорофоры, расположенные в микродоменах.Влияние ограниченной ориентации флуорофоров на эффективность FRET было продемонстрировано с помощью второго инструмента, называемого thetaFRET. В более общем плане, это исследование демонстрирует, как численные методы очень хорошо подходят для помощи в разработке и анализе данных экспериментов FRET.

Благодарности

Эта работа финансировалась Австралийским исследовательским советом. Э. Деплазес благодарит Университет Западной Австралии за стипендию Джин Роджерсон для аспирантов.

Список литературы

5.

L. Loura et al., «FRET-анализ формирования и свойств доменов в сложных мембранных системах», Биохим. Биофиз. Acta — Biomembr., 1788 г. (1, Сп. Вып. SI), 209 –224 (2009). 0005-2736 Google Scholar

8.

H. Wallrabeet al., «Конфокальная микроскопия FRET для измерения кластеризации комплексов лиганд-рецептор в мембранах эндоцитов», Биофиз. J., 85 (1), 559 –571 BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

9.

J. FarinhaJ. Мартиньо, «Резонансный перенос энергии в полимерных нанодоменах», J. Phys. Chem. С, 112 (29), 10591 –10601 (2008). JPCCCK 1932-7447 Google Scholar

10.

J. Yanget al., «Исследование переноса энергии симметричных диблок-сополимеров полиизопрен-поли (метилметакрилат), содержащих красители на стыках: ориентация красителя», Макромолекулы, 38 (4), 1256 –1263 (2005). MAMOBX 0024-9297 Google Scholar

14.

Г. Горбенко и др., «Исследование резонансного переноса энергии лизоцим-липидных взаимодействий», Биохим. Биофиз. Acta-Biomembr., 1778 г. (5), 1213 –1221 (2008). 0005-2736 Google Scholar

16.

L. Pisterziet al., «Олигомерный размер мускаринового рецептора M-2 в живых клетках, определяемый количественным переносом энергии резонанса флуоресценции», J. Biol. Chem., 285 (22), 16723 –16738 (2010). http://dx.doi.org/10.1074 / jbc.M109.069443 JBCHA3 0021-9258 Google Scholar

17.

В. Райку и др., «Взаимодействие с белками количественно оценивается in vivo с помощью спектрально разрешенного резонансного переноса энергии флуоресценции», Biochem. J., 385 (1), 265 –277 (2005). BIJOAK 0264-6021 Google Scholar

19.

M. Liet al., «Метод переноса энергии флуоресценции для анализа олигомерной структуры белка: приложение к фосфоламбану», Биофиз. J., 76 (5), 2587 –2599 (1999).BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

21.

Д. Сингх В. Райку, «Сравнение подходов, основанных на полном распределении и средних значениях, для определения эффективности резонансного переноса энергии флуоресценции в ансамблях белков в живых клетках», Биофиз. J., 98 (10), 2127 –2135 (2010). http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2010.01.048 BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

23.

P. Frederix et al., «Динамическое моделирование методом Монте-Карло для моделирования FRET и фотообесцвечивания в системах с множественными донорно-акцепторными взаимодействиями», Дж.Phys. Chem. В, 106 (26), 6793 –6801 (2002). http://dx.doi.org/10.1021/jp014549b JPCBFK 1520-6106 Google Scholar

24.

M. Frazieret al., «Исследование образования доменов в смесях сфингомиелин / холестерин / POPC с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии и моделирования Монте-Карло», Биофиз. J., 92 (7), 2422 –2433 (2007). http://dx.doi.org/10.1529/biophysj.106.100107 BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

28.

B. CorryD. JayatilakaP. Ригби, «Гибкий подход к расчету эффективности резонансной передачи энергии между несколькими донорами и акцепторами в сложной геометрии», Биофиз. J., 89 (6), 3822 –3836 (2005). http://dx.doi.org/10.1529/biophysj.105.069351 BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

30.

Дж. Лакович, Принципы флуоресцентной спектроскопии, Google Scholar

31.

Z. GryczynskiJ. LubkowskiE. Буччи, Флуоресцентная спектроскопия, Том 278 методов в энзимологии, 538 –569 (1997).NPPBDP 0275-9292 Google Scholar

33.

B. Corryet al., «Улучшенная структура открытого канала MscL, определенная с помощью конфокальной микроскопии FRET и моделирования», J. Gen. Physiol., 136 (4), 483 –494 (2010). JGPLAD 0022-1295 Google Scholar

34.

B. AdairD. Энгельман, «Спиральные трансмембранные домены Glcyophorin-A димеризуются в фосфолипидных бислоях, исследование резонансного переноса энергии», Биохимия, 33 (18), 5539 –5544 (1994).0006-2960 Google Scholar

36.

Р. ВармаС. Мэр, «GPI-заякоренные белки организованы в субмикронные домены на поверхности клетки», Природа, 394 (6695), 798 –801 (1998). 0028-0836 Google Scholar

37.

А. Кенуорти М. Едидин, «Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK исследовано с разрешением <100 ангстрем с использованием визуализации резонансного переноса энергии флуоресценции», Дж.Cell Biol., 142 (1), 69 –84 (1998). http://dx.doi.org/10.1083/jcb.142.1.69 JCLBA3 0021-9525 Google Scholar

39.

A. KenworthyN. Петранова М. Едидин, «FRET-микроскопия с высоким разрешением B-субъединицы холерного токсина и GPI-заякоренных белков в плазматических мембранах клеток», Мол. Биол. Ячейка, 11 (5), 1645 г. –1655 (2000). MBCEEV 1059-1524 Google Scholar

41.

K. Börjesson et al., «Пара FRET аналогов нуклеиновых оснований, облегчающая подробные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты», Дж.Являюсь. Chem. Soc., 131 4288 –4293 (2009). 0002-7863 Google Scholar

границ | FRET в биофизике мембран: обзор

Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это фотофизический процесс, с помощью которого первоначально электронно возбужденный флуорофор, называемый донором (D), передает свою энергию возбуждения (и, таким образом, гасится) другому хромофору, называемому акцептором (A), электронный спектр поглощения которого перекрывает эмиссию D.Последний, первоначально находящийся в основном электронном состоянии, возбуждается при переносе и может (а может и не) флуоресцировать. FRET не включает ни эмиссию фотонов, ни молекулярный контакт между двумя видами, но сильно зависит от расстояния между ними. Для изолированной донорно-акцепторной пары коэффициент скорости (первого порядка) для взаимодействия FRET пропорционален обратной шестой степени этого расстояния (Förster, 1949). Характерная длина для FRET — это радиус Ферстера, R ₀ , определяемый как расстояние донор / акцептор, для которого FRET в данной паре D / A эффективен на 50% (то есть так же вероятен, как и другие процессы D затухание возбуждения).На практике диапазон расстояний, для которого чувствителен FRET, составляет от 0,5 R ₀ до 2 R ₀ , поскольку эффективность FRET в этом интервале варьируется от 98,5 до 1,5%. Значение R ₀ характерно для каждой пары ЦАП в данной среде, но обычно находится в диапазоне от 1,5 до 6 нм. Это означает, что FRET в основном чувствителен к расстояниям в масштабе от 1 до 10 нм, что недостижимо для традиционных методов оптической микроскопии, но полностью соответствует изучению важных вопросов биофизики мембран, таких как обнаружение и определение характеристик. нанодоменов / рафтов и взаимодействия липид-белок или белок-белок (Рисунок 1).

Рис. 1. Схематическое изображение применения FRET в биофизике мембран . Изображена только одна двухслойная листовка. (A) неоднородность мембраны; (B) определение поперечного расположения флуоресцентного остатка / метки; (C) селективность белок / липид; (D) олигомеризация белка.

Могут быть предусмотрены различные подходы, начиная от качественных исследований изменения эффективности FRET в установившемся режиме, без учета лежащей в основе кинетики, до анализа данных флуоресценции с временным разрешением с соответствующими формализмами, позволяющими количественно восстанавливать топологическую информацию о системе под учиться.До недавнего времени эти последние сложные приложения в основном ограничивались простыми системами (обычно одно- или двухкомпонентными модельными мембранами), в то время как FRET изучает сложные системы, такие как мембраны живых клеток (для которых получение качественных данных флуоресценции с временным разрешением было технически невыполнимо) полагались на более качественные обработки. В настоящее время, с огромным развитием методов, основанных на флуоресцентной микроскопии, пространственное и временное разрешение могут быть эффективно объединены с изучением реальных биологических мембран.В этом обзоре описываются основные формализмы FRET в мембранах и указываются важные иллюстративные приложения FRET к множеству проблем в мембранных системах (Таблица 1).

Таблица 1 . Избранные примеры исследований мембран FRET .

Феноменологические применения FRET в мембранах

Даже если FRET используется в качестве качественного индикатора близости хромофора, без учета его реальной кинетики, все еще существует широкий спектр приложений в биофизике мембран.Кроме того, сложность некоторых систем является серьезным препятствием для применения сложных формализмов, и более феноменологический подход может быть единственным доступным вариантом.

Классическим применением FRET является мониторинг липидного обмена или смешивания и слияния мембран, как описано Struck et al. (1981). Эти авторы проследили слияние везикул фосфатидилсерина (PS), вызванное ионом кальция. Смешивали две популяции везикул, одна из которых содержала зонды D и A, а другая — только немеченый фосфолипид.Выбранная пара FRET состояла из меченых фосфолипидов N — (7-нитро-2,2,3-бензоксадиазол-4-ил) фосфатидилэтаноламин (NBD-PE, D) и N — (лиссамин Родамин B сульфонил ) -диолеоилфосфатидилтаноламин (Rh-PE, A), и с тех пор стала, вероятно, наиболее часто используемой парой в исследованиях мембран FRET. При добавлении иона кальция слияние вызывает смешивание меченых и немеченых везикул. После перераспределения липидов за счет боковой диффузии поверхностная концентрация акцепторных зондов, окружающих каждого донора, уменьшается.Это приводит к уменьшению степени тушения донора с помощью FRET, эффективность передачи энергии снижается и, следовательно, увеличивается интенсивность излучения донора. Другая возможность состоит в том, чтобы отслеживать повышение эффективности FRET (уменьшение флуоресценции D) при смешивании популяции везикул, меченных только D, с другими, только меченными A, как показано в недавнем исследовании SNARE-опосредованного слияния (van den Bogaart et al. ., 2010).

При изучении латерального распределения липидов FRET между зондами с идентичными характеристиками распределения станет более эффективным вследствие разделения фаз (и, наоборот, для зондов, демонстрирующих предпочтение комплементарной фазы).Однако разделение зонда — не единственное явление, которое может повлиять на эффективность FRET. При изменении состава мембраны могут происходить вариации площади / липида и фотофизических параметров зонда (и, следовательно, R ₀ ), что потенциально может привести либо к ошибочной идентификации, либо к маскировке образования домена. С этой целью могут быть разработаны оригинальные схемы для более точного обнаружения начала образования домена, такие как предложенная Сильвиусом (2003), в которой эффективность FRET достигается с акцептором, имеющим сродство к одной из липидных фаз и двум различным донорам. которые распределяются по разным мембранным доменам.Пока мембрана является гомогенной, вариации липидного состава будут одинаково влиять на эффективность FRET обеих пар D / A. Однако, если домены образуются, два донора разделяются на разные фазы, и эффективность тушения для каждой из них будет затронута противоположным образом.

Как упомянуто ниже, разделение D или A можно количественно оценить по параметрам разрешенной во времени флуоресценции D в присутствии A (анализируется глобально вместе с флуоресценцией в отсутствие A).FRET также можно использовать более простым способом в качестве индикатора предпочтения домена, как это продемонстрировано недавно предложенным «FRET анализом ассоциации рафтов» (Nelson et al., 2010). Эффективность FRET между исследуемым белком (D) и одним из двух акцепторов, пирен-ДОФЭ (предпочитает фазу ld) и LcTMADPH (предпочитает фазу lo), измеряется и сравнивается с использованием других доноров, пептида LW (тип трансмембранной спирали). пептид с высоким сродством к доменам ld) и холерный токсин-B (белок, который связывается с ганглиозидом GM1, ассоциированным с рафтом, и имеет очень высокое сродство к доменам lo) в смеси липидов, сосуществующих в фазах ld / lo.Таким образом, в примерах этих авторов показано, что перфринголизин O имеет промежуточное сродство к рафту между пептидом LW и холерным токсином-B в везикулах, содержащих упорядоченные домены, богатые сфингомиелином головного мозга или 1,2-дистеароил- sn -3-глицерофосфохолином ( DSPC).

При исследовании липид / белкового взаимодействия FRET между, например, мембранным пептидом или белком D и липидными акцепторами различных классов / ацильных цепей может указывать на предпочтительную ассоциацию или селективность для конкретного типа липида, а FRET между D-несущим и А-несущие мембранные белки можно использовать для обнаружения образования гетеро- или гомоолигомеров белка.В этом случае количественные модели необходимы для дальнейшей характеристики этих взаимодействий (см. Формализмы для взаимодействия липид-белок или белок-белок ниже).

Внутримолекулярный FRET: «спектроскопическая линейка»

Резонансный перенос энергии Ферстера между парами D / A, для которых расстояние D – A одинаково, например, подтвержденный в растворе двух хромофорных частиц, часто называют «внутримолекулярным» FRET. Количественную оценку степени FRET дает эффективность FRET, E , которая рассчитывается как

в этом уравнении, i _D ( t ) и i _DA ( t ) — распады D в отсутствие и в присутствии A (соответственно).Эффект FRET на флуоресценцию D заключается в уменьшении его времени жизни и квантового выхода. В этом простом случае закон затухания D остается экспоненциальным, хотя и быстрее, чем в отсутствие акцептора. Связь между временем жизни D в отсутствие и в присутствии A (τ ₀ и τ соответственно) определяется выражением

, где R — расстояние D – A. Выражение, идентичное формуле. 2 можно записать для квантового выхода флуоресценции или для стационарной интенсивности флуоресценции. R ₀ рассчитывается независимо от спектроскопических данных,

, где κ ² — фактор ориентации (подробное обсуждение см. В Van Der Meer et al., 1994), Φ _D — квантовый выход D в отсутствие A, n — показатель преломления, λ — длина волны (в нм), I (λ) — это нормализованный спектр излучения D, а ε (λ) — молярный спектр поглощения. -решенные данные.Это основа использования внутримолекулярного FRET в качестве «спектроскопической линейки» (Страйер, 1978).

В контексте мембранной биофизики внутримолекулярный FRET все еще используется для получения структурной и динамической информации о мембранных белках. Это особенно важно, учитывая, что структуры с высоким разрешением многих мембранных белков (традиционно получаемых с помощью рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии или ЯМР-спектроскопии) все еще отсутствуют. Сайт-направленное мечение позволяет включать подходящие донорные и акцепторные группы FRET, и, исходя из измерения эффективности FRET, можно изучать белковое картирование и / или кинетику конформационных изменений.Последние приложения перечислены и кратко описаны в таблице 1.

Равномерное распределение флуорофоров в мембранах

В мембранах каждая молекула D обычно окружена распределением молекул A. Следовательно, измерение одиночных расстояний D / A не имеет смысла и неосуществимо. Затухание излучения D становится сложным и зависит от топологии исследуемой системы, а также от концентрации A. Аналитические растворы все еще могут быть получены для равномерного распределения хромофоров.Для плоских распределений D и A распад D в присутствии A дан Фангом и Страйером (1978), Волбером и Хадсоном (1979):

.

В этом уравнении γ — неполная гамма-функция, R _e — минимальное расстояние D / A (расстояние исключения), а n — числовая концентрация A (молекул на единицу площади). Хотя он был первоначально получен для плоскости акцепторов, содержащей донор ( цис перенос), он также действителен, если молекула D отделена от плоскости A расстоянием R _e , что является обычным для мембран, поскольку D и A часто расположены на разной глубине бислоя.

При получении липидных везикул молекулы D и A часто с равной вероятностью вставляются в любой из двухслойных листочков. В этом случае необходимо рассматривать две плоскости A для данного D, одна из которых соответствует акцепторам, лежащим в той же двухслойной листке, что и донор, а другая — тем, которые расположены в противоположной листке. Закон распада в этом случае получается простым умножением собственного D-распада на члены FRET, соответствующие каждой плоскости A.

Еще одно обычное явление в мембранных системах — сложный распад D даже в отсутствие A, при этом для правильного описания требуется сумма двух или трех экспонент.В этом случае приведенные выше уравнения все еще могут быть использованы при условии, что экспоненциальный член собственного распада D заменен этой функцией, а τ ₀ заменено средним по интенсивности (Lakowicz, 2006) временем распада. Это так, потому что каждый компонент срока службы характеризуется различным значением R ₀ , пропорциональным обратной шестой степени соответствующего квантового выхода флуоресценции Φ _D (уравнение 3). Если все эти компоненты имеют одинаковые константы радиационного распада (обычно хорошее приближение), их значения Φ _D , в свою очередь, пропорциональны значениям τ ₀ .Это означает, что скорости FRET для данного A, расположенного на расстоянии R [заданного как (1 / τ ₀ ) ( R ₀ / R ) ⁶ ], одинаковы независимо от D Компонент времени жизни учитывается, потому что он инвариантен (Loura et al., 1996, 2000b). Из-за этого постоянства уравнение. 4 можно использовать со средними значениями R ₀ и τ ₀ . Здесь можно использовать спектроскопический R ₀ (рассчитанный с экспериментальным усредненным значением Φ _D ) и истинное статистическое среднее τ ₀ , которое является средним по интенсивности.

Для стационарных приложений уравнение. 4 можно интегрировать численно (в программе или электронной таблице) для получения кривых эффективности FRET E (рассчитанных с использованием уравнения 1) как функции концентрации акцепторов n с R _e в качестве параметра. В качестве альтернативы фиксируется R _e и экспериментальные спады / эффективности FRET сравниваются с теоретическими ожиданиями. Возможная неспособность проанализировать кинетику FRET с помощью формализма равномерного распределения зондов может иметь значение (например,g., добавление нового компонента к данной однофазной двухслойной системе липидов может вызвать компартментализацию и / или разделение фаз и, следовательно, отклонения от теоретического ожидаемого однородного распределения).

Неравномерное распределение флуорофоров содержит топологическую информацию

Неравномерное распределение компонентов и разделение фаз — обычное явление в липидных смесях. Молекулы, несущие флуорофоры D и A в эксперименте FRET в такой системе, естественно, будут иметь неоднородное распределение после их разделения между сосуществующими фазовыми доменами.Будем считать, что присутствуют только две фазы или типы доменов (наиболее частая экспериментальная ситуация). Если они достаточно велики, чтобы быть бесконечным в масштабе FRET (т. Е. Осложнения, возникающие из-за FRET с участием молекул в разных доменах или граничных эффектов, пренебрежимо малы; это имеет место, если размер доменов превышает ~ 5–10 R ₀ ), то закон распада донора представляет собой просто линейную комбинацию гипотетических законов распада в каждой фазе i _DA , _{фазе i} (задается уравнением.4), взвешенное по относительному количеству D в каждой фазе A _i (Loura et al., 2000a, 2001):

Обратите внимание, что времена жизни D обычно различаются в двух фазах, как и поверхностные концентрации A (и, возможно, также расстояния исключения D – A). Это вводит большое количество подгоночных параметров в уравнение. 5. Чтобы гарантировать значимое восстановление этих параметров, распад D в присутствии A анализируется глобально вместе с распадом в отсутствие A,

, где τ ₁ и τ ₂ — время жизни D в каждой фазе.Восстановленные параметры обычно равны τ ₁ , τ ₂ , A ₂ / A ₁ (из которого получается коэффициент распределения D K _pD ), а концентрации A в две фазы: C ₁ и C ₂ (из которых получается коэффициент распределения A K _pA ; Loura et al., 2000a). Частным случаем этого формализма является ситуация так называемых «изолированных доноров», которая соответствует C ₂ = 0.

Будучи строго верной для бесконечного разделения фаз, эта модель может быть применена к образованию наноразмерных доменов; в этом случае восстановленный коэффициент распределения A («FRET» K _pA ) не будет равен истинному коэффициенту, полученному из независимых (интенсивность флуоресценции, анизотропия или время жизни A) измерений («без FRET» K _pA ), и на него влияет (ближе к единице, чем значение «без FRET») тот факт, что доноры в одной фазе чувствительны к акцепторам в другой.Степень этого отклонения отражает размер нанодоменов. В пределе очень малого размера домена (< R ₀ ) «FRET» K _pA по существу равно единице. Следовательно, этот вид анализа может дать представление о размере доменов и в случае бесконечного разделения фаз (что может быть подтверждено, если значения «FRET» и «non-FRET» K _pA неразличимы) было показано, что фазовая диаграмма бинарной смеси может быть получена из параметров распада (Loura et al., 2001). Бубольц (2007) предложил экспериментальный метод характеристики фазового разделения в липидных мембранах (и определение бинарных и тройных фазовых диаграмм в пределе бесконечной фазы), основанный на этом формализме, но опирающийся исключительно на акцепторную стационарную сенсибилизированную эмиссию. кто назвал это «FRET с постоянным разделением зонда» или SP-FRET. Применения этих методологий перечислены в Таблице 1.

Численное и упрощенное аналитическое рассмотрение FRET в неоднородных системах

Не было получено точного решения скорости или эффективности FRET для случая неполного разделения фаз с доменами нанометрового размера данного типа, диспергированными в непрерывной фазе.Это происходит из-за очевидной потери симметрии, вызванной наличием доменов. Один из способов справиться с этой сложностью — рассчитать D-распад с помощью численного моделирования. По сути, процесс начинается с построения топологии липидной матрицы (т. Е. Определения размера моделируемой системы, формы домена, среднего размера и распределения размеров, а затем размещения доменов на матрице, гарантируя, что общая доля каждой фазы равна как предполагалось) и размещение молекул D и A с учетом их предпочтения в домене.Затем выбирается данный D и вычисляется его взаимодействие со всеми акцепторами (или теми, которые находятся в пределах отсечения нескольких длин R ₀ ). Затем этот шаг повторяется для всех доноров, чтобы получить среднее значение по ансамблю для всей системы. Можно получить средний распад D, и, используя уравнение. 1 — значение КПД FRET.

Этот вид численного моделирования уже был описан Wolber и Hudson (1979) для равномерного распределения в плоской геометрии для проверки их аналитической теории.Первое численное решение FRET для неравномерного распределения мембранных зондов было дано Снайдером и Фрейре (1982). В этой работе неоднородность распределения зондов была введена путем включения эвристической потенциальной функции в случайное размещение зондов. Таким образом, домены фактически не моделируются, и хотя уравнения авторов подходят для анализа агрегации зондов в однофазной системе, они бесполезны в отношении разделения фаз. Моделирование, в котором неоднородность распределения зонда вводится путем построения двухфазной системы и с учетом разделения зонда, было представлено авторами для проверки их аналитических формализмов (Loura and Prieto, 2000; Loura et al., 2001; Тоулз и Дэн, 2007; Towles et al., 2007).

Другой подход к моделированию состоит в воссоздании процессов возбуждения и снятия возбуждения каждой молекулы D или A путем выполнения стохастического моделирования. Эти расчеты учитывают вероятности возбуждения донора, распада донора не-FRET процессами, FRET на данный акцептор и девозбуждение акцептора. Эффективность FRET просто рассчитывается как отношение общего числа передач к общему числу D-возбуждений.Этот тип моделирования был применен к случаю FRET в плоской геометрии с дисковыми доменами (Kiskowski and Kenworthy, 2007).

Все предыдущие работы характеризуются предварительной фиксацией лежащей в основе липидной матрицы, включая размер и форму домена, а моделирование касается исключительно расчета скоростей и вероятностей FRET. Другой подход был недавно предпринят Frazier et al. (2007), которые объединили моделирование статистической механической решетки методом Монте-Карло (для описания липидной матрицы и генерации в ней положений хромофоров) с упрощенной ступенчатой ​​зависимостью FRET от расстояния (FRET считался возникающим тогда и только тогда, когда расстояние D – A в данной паре были менее R ( ₀ ) для анализа экспериментальных данных FRET в тройной смеси плот-модель.Эта работа демонстрирует, что FRET и вычислительные методы могут быть объединены для создания мощной комбинации, подходящей для изучения разделения липидных фаз.

В глобальном масштабе численное моделирование имеет то преимущество, что позволяет рассчитывать FRET в системах, точное решение которых невозможно из-за их сложности. Однако до сих пор они не позволяют напрямую анализировать экспериментальные данные, поскольку в реальном эксперименте ожидается много степеней свободы. Для каждого моделирования необходимо фиксировать значения для R ₀ , времени жизни D, расстояния исключения D / A (все они могут быть разными в каждой сосуществующей фазе), формы и размера домена, а также коэффициентов разделения D и A.Такое множество переменных исключает возможность подбора простых эмпирических функций, которые могли бы описать, например, изменение эффективности FRET в зависимости от концентрации A в общем виде, что было бы удобно для большинства исследователей. Изучение конкретной системы требует индивидуальной настройки и процедур моделирования.

Альтернативой численному моделированию FRET в наногетерогенных бислоях является использование упрощенных аналитических методов, которые, в отличие от первого, потенциально могут быть пригодны для прямого анализа экспериментальных данных, позволяющих восстановить интересующие параметры.Однако этот вид формализмов характеризовался либо жесткими упрощающими приближениями (Gutierrez-Merino, 1981; Brown et al., 2007a, b), либо в некоторой степени полагающимися на численные результаты (Towles et al., 2007; см. Loura et al. ., 2010а для подробного обсуждения), что исключает их широкое использование.

Формализмы для взаимодействия липид-белок или белок-белок

Относительно простым применением FRET в мембранных системах, содержащих пептиды / белки, несущие флуоресцентные остатки (триптофан и тирозин), является определение их поперечного расположения.Триптофан и тирозин действуют как доноры передачи энергии, поскольку они поглощают на коротких длинах волн, поэтому следует использовать подходящие акцепторы с известным положением в мембране (см. Таблицу 1). Поскольку эффективность передачи зависит от расстояния исключения D – A, значение R _e (и, следовательно, поперечное расположение) может быть получено путем подгонки уравнений 1 и 4 к экспериментальным данным. Доступен ряд стеариновых кислот, дериватизированных антроилхромофором, которые подробно описаны в литературе (см. E.г., Blatt et al., 1984). Поскольку существует почти неизменность спектров поглощения различных акцепторов, радиус Ферстера постоянен для всех из них, а для триптофана как D он близок к R ₀ = 25 Å. Можно показать, что, когда R _e > приблизительно 1,7 R ₀ , получается зависимость типа Штерна-Фольмера (Shaklai et al., 1977; Dewey and Hammes, 1980), выраженная очень простое уравнение

, где I _DA и I _D обозначают интенсивность стационарного излучения D в присутствии и отсутствии A, соответственно.Принимая во внимание, что уравнения 4 и 7 предполагают осевое распределение хромофоров A вокруг остатка D, Yguerabide (1994) обобщил теорию, включив в нее случай, когда D не находится на оси симметрии меченого белка, и распространил ее применимость на случаи, когда R _e < R ₀ , что неизбежно с некоторой дополнительной сложностью.

Белки, включенные в модельные мембраны, содержащие липиды с разными электростатическими свойствами или гидрофобной длиной, могут проявлять селективность к одному липидному компоненту на границе раздела белок-липид, что традиционно рассматривалось с помощью спектроскопии электронного спинового резонанса (Marsh and Horváth, 1998).Однако практически идентичную информацию можно получить с помощью FRET. Качественную информацию легко получить, сравнивая степень FRET от белка к флуоресцентно меченным липидам различных классов / ацильных цепей, как упомянуто выше. Было предложено несколько количественных моделей, которые недавно подверглись критическому анализу (Loura et al., 2010b). В таблице 1 перечислены применения этих формализмов к экспериментальным данным FRET.

Характеристика межбелкового взаимодействия с использованием FRET с участием двух различных меченых производных белков или пептидов была описана более 30 лет назад.В уже исторической статье, используя простой формализм, в котором не учитывается межмолекулярный FRET, но учитываются различные схемы олигомеризации (димеры / тримеры / тетрамеры), Вич и Страйер (1977) подтвердили, что гипотеза образования димеров грамицидина (D: дансил-грамицидин) C; A: 4- (диэтиламино) -фенилазобензол-4-сульфонилхлоридное производное грамицидина C) привело к лучшему соответствию модели, чем сценарии образования как тримеров, так и тетрамеров. Агрегация белков мембраны хромаффинных гранул, меченных малеимид-йодоаминонафтилсульфонатом (D) и флуоресцеин-ацетатом ртути или флуоресцеин-5-малеимидом (A), была качественно подтверждена Morris et al.(1982) при добавлении иона кальция. После этих ранних исследований FRET стал важным инструментом в характеристике агрегации белков / пептидов. Необходимо тщательно выбирать формализм, который будет использоваться для анализа данных, поскольку ранние модели фокусируются на внутриагрегатном переносе энергии, игнорируя межмолекулярный FRET «стороннего наблюдателя» (например, Adair and Engelman, 1994; Li et al., 1999). Это приближение обычно справедливо только в пределе очень разбавленного меченого белка и обычно используется в недавних работах по применению FRET или биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET, см.g., James et al., 2006) к изучению олигомеризации мембранных белков, перечисленных в Таблице 1. Другие методы лечения стремятся вычислить чистый внутриагрегированный член (см. Raicu, 2007 для недавнего примера). Следует отметить, что сочетание внутриагрегатных и межмолекулярных терминов следует проводить осторожно. В частности, неточно вычитать чистую межмолекулярную эффективность из комбинированной межагрегатной и межмолекулярной FRET (You et al., 2005). Если популяция доноров подвергается тушению двумя разными типами акцепторов (например,g., связанных и несвязанных с данным донором), правильный способ расчета эффективности FRET состоит в умножении членов FRET, соответствующих всем вкладам в тушение, для получения i _DA ( t ) и интегрирования в конец (уравнение 1). Это подтверждается недавним исследованием, в котором сделан вывод, что N-концевой домен N-BAR образует антипараллельные димеры в 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3- [фосфорац- (1-глицерин)] (POPG) везикулы (Fernandes et al., 2008).

FRET с улучшенной диффузией

В предыдущих разделах предполагалось, что поступательная диффузия как D, так и A была незначительной в течение времени существования возбужденного состояния D, то есть при условии D _DA τ ₀ / s ² ≪ 1 (где D _DA — это сумма коэффициентов боковой диффузии D и A, а с — среднее расстояние D – A).В противном случае быстрая диффузия хромофора приводит к увеличению скорости FRET, что может быть интуитивно понятно, если учесть, что пара D / A, изначально разделенная большим расстоянием, которое препятствовало бы FRET, может стать достаточно близкой для того, чтобы FRET возник с высоким вероятность в течение жизни возбужденного состояния D как следствие диффузии.

Общая теория усиленного диффузией FRET была установлена ​​Стейнбергом и Качальски (1968) и экспериментально подтверждена Томасом и др.(1978). Особый интерес представляет так называемый предел быстрой диффузии, характеризуемый величиной D _DA τ ₀ / с ² ≪ 1, что приводит к чрезвычайно упрощенным уравнениям для скорости FRET. Это условие требует времени жизни D в диапазоне от микросекунды до миллисекунды, что обычно достижимо с использованием подходящих хелатов лантаноидов в качестве D-частиц. Для равномерного двумерного распределения незаряженных сферических хромофоров можно показать, что получается экспоненциальный D-распад со временем жизни

где

Последнее уравнение (которое, что довольно любопытно, формально идентично уравнению7, который является приблизительным решением совсем другой проблемы) показывает, что скорость FRET в этом режиме сильно зависит от R _e . Это причина того, почему предел быстрой диффузии FRET нашел применение при измерении расстояния ближайшего подхода D – A (где обычно разновидностью A является белок) в 1980-х годах (см. Примеры в таблице 1). Кроме того, усиленная FRET диффузия заряженных частиц D / A чувствительна к электростатическому потенциалу и поэтому может использоваться для определения мембранных потенциалов (Meltzer et al., 2006). Удивительно, но недавних применений в мембранах было очень мало, что привело к оживленному комментарию: «С середины 1980-х годов метод [FRET, усиленный диффузией], кажется, бездействовал, ожидая подходящей возможности вернуться к жизни» (Fairclough, 2006 г.).

Homo-FRET против Hetero-FRET

В предыдущих разделах предполагалось, что хромофоры D и A различны (гетеро-FRET). Это подразумевало необратимость процесса переноса, который можно было контролировать, измеряя либо степень тушения D, либо сенсибилизированную флуоресценцию A.Напротив, FRET между идентичными флуорофорами (гомо-FRET) не приводит к снижению интенсивности или времени жизни донорной флуоресценции, поскольку популяция возбужденного состояния донора не уменьшается во время акта переноса. На практике единственной наблюдаемой, которая отражает это явление, является анизотропия флуоресценции (Lakowicz, 2006), которая уменьшается в результате гомотрансфера. Для измерения анизотропии флуоресценции требуются поляризаторы, и, поскольку они приводят к значительному снижению детектируемого излучения, часто требуется большее количество флуорофора (по сравнению с тем, которое использовалось бы при измерении интенсивности) для заданной точности.В случае, если приборы не представляют проблемы, уменьшение анизотропии совершенно очевидно: если две молекулы разделены расстоянием R = R ₀ , измеренная анизотропия будет составлять только ~ 2/3 от анизотропии. мономера, что является значительным уменьшением.

Несмотря на очевидное преимущество, заключающееся в том, что требуется только один флуорофор, использование гомо-FRET более ограничено, чем гетеро-FRET. Рационализация степени деполяризации из-за гомо-FRET более сложна, чем тушение из-за гетеро-FRET, потому что: (i) существует возможность обратного переноса на непосредственно возбужденный донор или передачи любому донору, в конечном итоге включает в себя большое количество этапов переноса и (ii) из-за анизотропии флуоресценции, соответствующей наблюдаемой, в дополнение к RET, другим источником деполяризации является вращение флуорофора.Если вращение и RET происходят в одном и том же масштабе времени, эти два явления взаимосвязаны, что является основным препятствием для количественного анализа данных гомотрансфера. К теоретическим описаниям, которые не учитывают эти особенности должным образом (например, Yeow and Clayton, 2007), следует относиться с осторожностью. Несмотря на эту сложность, гомо-FRET по-прежнему регулярно используется в исследованиях мембран, в последнее время в сочетании с флуоресцентной микроскопией (см. Раздел ниже и таблицу 1; Bader et al., 2011) для обнаружения и характеристики хромофора (например,g., меченый белок) удержание или агрегация. В этой связи следует отметить, что использование объективов с высокой числовой апертурой приводит к уменьшению наблюдаемой анизотропии (Axelrod, 1979). Этот артефакт можно минимизировать, используя более низкую числовую апертуру (≤0,8), с потерей разрешения и чувствительности, или скорректировать, например, с помощью стандартной молекулы (Tramier and Coppey-Moisan, 2008).

FRET под микроскопом

Последние разработки в области многоволновой визуализации и визуализации с поляризационным разрешением привели к широкому использованию визуализации FRET в исследованиях функциональных узлов в клеточных мембранах.Экспериментальные методы визуализации микродоменов мембран и количественной оценки эффективности FRET в микроскопии FRET с акцентом на новые стратегии были рассмотрены в других источниках (Rao and Mayor, 2005; Jares-Erijman and Jovin, 2006; Owen et al., 2007; Padilla-Parra et al. ., 2008). Было разработано несколько подходов для исследования в наноразмерном диапазоне специфических взаимодействий белок-белок, липид-липид или липид-белок в живых клетках, как с использованием гомо-, так и гетеро-FRET.

Клеточные мембраны характеризуются большим количеством липидных и белковых компонентов в неравновесном состоянии.Одним из распространенных упрощений является предположение о двух типах доменов, например, плотный / неплотный или упорядоченный / неупорядоченный. Затем результаты можно сравнить, например, с сосуществованием ld / lo на фазовой диаграмме липидов в тройной модельной системе. Из-за внутренних ограничений, таких как стабильность клеток, и поскольку обычно в клетках проводятся микроскопические исследования (чтобы контролировать состояние клеток, знать локализацию флуорофора и использовать сигнал, исходящий только от интересующей мембраны), интенсивность флуоресценции спадает с большое количество фотонов и низкий фоновый сигнал (необходимые для приложений большинства описанных выше формализмов), как правило, недопустимы.Обычно получают стационарные данные и сравнивают с интегрированным формализмом FRET. Даже когда визуализирующая микроскопия времени жизни флуоресценции (FLIM; обзор ее приложений к неоднородности мембран см. В Stöckl and Herrmann, 2010) получены данные о времени жизни (FRET – FLIM), часто получается относительно небольшое количество отсчетов, что означает, что затухание традиционно используется для расчета эффективности FRET по формуле. 1, а не непосредственно анализировать с помощью лежащей в основе кинетической модели FRET. Однако с инструментальными улучшениями, а также развитием новых подходов к анализу (Grecco et al., 2009) эта тенденция меняется на противоположную. Избранные работы, сочетающие FRET и микроскопию, перечислены в таблице 1, в которой кратко описаны иллюстративные литературные отчеты, в которых FRET использовался (по крайней мере) в одном из описанных выше приложений.

Заключение

В этом обзоре описаны применения FRET в биофизике мембран, включая исследования картирования мембранных белков, латеральной гетерогенности (мембранные домены), определения поперечного расположения (глубины) флуоресцентных остатков / меток внутри мембраны, селективности белков / липидов ( предпочтение конкретного липида по отношению к белку) и олигомеризация мембранного белка.

Была рассмотрена сложность FRET в мембранах, представлена ​​оценка гетеро и гомо-FRET, и подробная топологическая информация может быть получена с помощью этой методологии, если адекватное моделирование будет принято во внимание. Критически рассмотрены примеры соответствующих работ в этой области и упомянуты недавние применения FRET под микроскопом, а именно на основе данных с временным разрешением (FRET – FLIM). В целом подчеркивается мощь FRET как инструмента мембранной биофизики.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы признают финансирование FEDER через программу COMPETE и FCT, ссылки на проекты FCOMP-01-0124-FEDER-010787 (FCT PTDC / QUI-QUI / 098198/2008), PTDC / QUI-BIQ / 099947/2008 и PTDC / QUI-BIQ / 112067/2009.

Список литературы

Acasandrei, M.A., Dale, R.E., VandeVen, M., and Ameloot, M. (2006). Двумерный резонансный перенос энергии Ферстера (2D FRET) и гипотеза мембранного плота. Chem. Phys. Lett. 419, 469–473.

CrossRef Полный текст

Аниковский М., Дейл Л., Фергюсон С. и Петерсен Н. (2008). Резонансная передача энергии в клетках: новый взгляд на эффект фиксации и агрегации рецепторов на клеточной мембране. Biophys. J. 95, 1349–1359.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Антоллини, С. С., и Баррантес, Ф. Дж. (1998). Выявление дискретных сайтов для фосфолипидов и стеринов на границе раздела белок-липид в нативной мембране, богатой рецепторами ацетилхолина. Биохимия 37, 16653–16662.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Бадер, А.Н., Хетцл, С., Хофман, Э.Г., Воортман, Дж., Ван Берген и Хенегувен, П. М. П., ван Меер, Г., и Герритсен, Х. К. (2011). Визуализация Homo-FRET как инструмент для количественной оценки кластеризации белков и липидов. Chemphyschem 12, 475–483.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Blatt, E., Chatelier, R.C., and Sawyer, W.H. (1984). Поперечное расположение флуорофоров в липидных бислоях и мицеллах, определяемое методами флуоресценции. Photochem. Photobiol. 39, 477–483.

CrossRef Полный текст

Браун А.С., Тоулз К.Б. и Ренн С.П. (2007a). Измерение размера рафта в зависимости от состава мембраны в системах на базе ПК: часть I — бинарные системы. Langmuir 23, 11180–11187.

CrossRef Полный текст

Браун А.С., Тоулз К.Б. и Ренн С.П. (2007b). Измерение размера рафта в зависимости от состава мембраны в системах на основе ПК: часть II — тройные системы. Langmuir 23, 11188–11196.

CrossRef Полный текст

Бубольц, Дж. Т., Бваля, К., Уильямс, К., и Шутцер, М. (2007). Картирование с высоким разрешением фазового поведения в тройной липидной смеси: зависят ли фазовые границы липид-рафт от процедуры подготовки образца? Langmuir 23, 11968–11971.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Capeta, R.C., Poveda, J.A., and Loura, L.М. С. (2006). Неравномерное распределение мембранных зондов при резонансном переносе энергии: приложение к белково-липидной селективности. J. Fluoresc. 16, 161–172.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ча А., Снайдер Г. Э., Селвин П. Р. и Безанилла Ф. (1999). Движение в атомном масштабе области измерения напряжения в калиевом канале, измеренное с помощью спектроскопии. Природа 402, 809–813.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Роговица, R.Л., Ниту, Ф., Грубер, С., Колер, К., Зацер, М., Томас, Д. Д., и Фруен, Б. Р. (2009). Картирование на основе FRET кальмодулина, связанного с каналом высвобождения RyR1 Ca2 ⁺ . Proc. Natl. Акад. Sci. США 106, 6128–6133.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Роговица Р. Л., Ниту Ф., Самсо М., Томас Д. Д. и Фруен Б. Р. (2010). Картирование субъединицы белка, связывающего FK506 рецептора рианодина, с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Biol. Chem. 285, 19219–19226.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Коутиньо, А., Лора, Л.М.С., Федоров, А., Прието, М. (2008). Выявленная методом FRET защемленная многослойная структура агрегатов лизоцимных и фосфатидилсеринсодержащих мембран. Biophys. J. 95, 4726–4736.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

де Алмейда, Р. Ф. М., Лора, Л.М. С., Федоров А., Прието М. (2005). Липидные рафты имеют разные размеры в зависимости от состава мембраны: исследование резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением. J. Mol. Биол. 346, 1109–1120.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Доманов Ю.А., Молотковский Ю.Г., Горбенко Г.П. (2005). Зависимые от покрытия изменения поперечного расположения цитохрома с в фосфолипидных мембранах, выявленные FRET. Биохим.Биофиз. Acta 1716, 49–58.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Чичон, Ф. Дж., Карраскоса, Дж. Л., Федоров А. и Прието, М. (2008). Роль спирали 0 домена N-BAR в формировании кривизны мембраны. Biophys. J. 94, 3065–3073.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес Ф., Лора Л.М.С., Федоров А. и Прието М.(2006). Отсутствие кластеризации фосфатидилинозитол- (4,5) -бисфосфата в жидком фосфатидилхолине. J. Lipid Res. 47, 1521–1525.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Кохорст, Р., Спруйт, Р. Б., Хемминга, М. А., Федоров, А., Прието, М. (2004). Количественная оценка белково-липидной селективности с использованием FRET: приложение к основному белку оболочки M13. Biophys. J. 87, 344–352.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Прието, М., Кохорст, Р., Спруйт, Р. Б., и Хемминга, М. А. (2003). Зависимость олигомеризации и латеральной сегрегации основного белка оболочки М13 от состава бислоя. Biophys. J. 85, 2430–2441.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Förster, T. (1949). Experimentelle und Theoretische Untersuchung des Zwischenmolekularen übergangs von Elektrinenanregungsenergie. Z. Naturforsch. 4а, 321–327.

Фрейзер, М. Л., Райт, Дж. Р., Покорный, А., и Алмейда, П. Ф. Ф. (2007). Исследование образования доменов в смесях сфингомиелин / холестерин / POPC с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии и моделирования Монте-Карло. Biophys. J. 92, 2422–2433.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фунг, Дж. Дж., Деупи, X., Пардо, Л., Яо, X. J., Велес-Руис, Г. А., Деври, Б. Т., Сунахара, Р. К., и Кобилка, Б.К. (2009). Регулируемая лигандом олигомеризация бета (2) -адренорецепторов в модельном липидном бислое. EMBO J. 28, 3315–3328.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гамбхир А., Хангьяс-Михалине Г., Зайцева И., Кафисо Д. С., Ван Дж., Мюррей Д., Пентяла С. Н., Смит С. О. и Маклафлин С. (2004). Электростатическая секвестрация PIP2 на фосфолипидных мембранах основными / ароматическими участками белков. Biophys. J. 86, 2188–2207.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Госвами, Д., Гоуришанкар, К., Билграми, С., Гош, С., Рагхупати, Р., Чадда, Р., Вишвакарма, Р., Рао, М., и мэр, С. (2008). Нанокластеры GPI-заякоренных белков формируются кортикальной активностью, управляемой актином. Cell 135, 1085–1097.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гутьеррес-Мерино, К. (1981). Количественное определение переноса энергии Ферстера для двумерных систем.I. Боковое разделение фаз в однослойных везикулах, образованных бинарными смесями фосфолипидов. Biophys. Chem. 14, 247–257.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гутиеррес-Мерино, К., Мунконге, Ф., Мата, А. М., Ист, Дж. М., Левинсон, Б. Л., Напье, Р. М., и Ли, А. Г. (1987). Положение сайта связывания АТФ на (Ca ²⁺ + Mg ²⁺ ) -АТФазе. Биохим. Биофиз. Acta 897, 207–216.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Хардинг П.J., Attrill, H., Boehringer, J., Ross, S., Wadhams, G.H., Smith, E., Armitage, J.P., and Watts, A. (2009). Конститутивная димеризация рецептора, связанного с G-белком, рецептора нейротензина 1, воссозданного в фосфолипидные бислои. Biophys. J. 96, 964–973.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Харикумар, К. Г., Хаппс, Р. М., и Миллер, Л. Дж. (2008). Димеризация в отсутствие олигомеризации более высокого порядка рецептора секретина, связанного с G-белком. Биохим. Биофиз. Acta 1778, 2555–2563.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Heberle, F. A., Wu, J., Goh, S. L., Petruzielo, R. S., and Feigenson, G. W. (2010). Сравнение трех смесей тройных липидных бислоев: FRET и ESR выявляют нанодомены. Biophys. J. 99, 3309–3318.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Херрерос, Дж., Нг, Т., и Скьяво, Г.(2001). Липидные рафты действуют как специализированные домены для связывания столбнячного токсина и интернализации в нейроны. Мол. Биол. Cell 12, 2947–2960.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

Хофман, Э. Г., Руонала, М. О., Бадер, А. Н., ван ден Хеувел, Д., Воортман, Дж., Руверс, Р. К., Верклей, А. Дж., Герритсен, Х. К., и ван Берген ан Хенегувен, П. М. П. (2008). EGF вызывает слияние различных липидных рафтов. J. Cell. Sci. 121, 2519–2528.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Джеймс, Дж. Р., Оливейра, М. И., Кармо, А. М., Ябони, А., и Дэвис, С. Дж. (2006). Строгая экспериментальная основа для обнаружения олигомеризации белков с использованием биолюминесцентного резонансного переноса энергии. Nat. Методы 3, 1001–1006.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Джонсон, Д. А., и Нусс, Дж. М. (1994). Чувствительный к гистрионикотоксину сайт связывания этидия расположен за пределами трансмембранного домена никотинового ацетилхолинового рецептора: исследование флуоресценции. Биохимия 33, 9070–9077.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Кенуорти, А.К., и Эдидин, М. (1998). Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK, исследованных с разрешением <100 Å с использованием визуализации переноса энергии резонанса флуоресценции. J. Cell Biol. 142, 69–84.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Кусба, Ю., Ли, Л., Грычинский, И., Пищек, Г., Джонсон, М., и Лакович, Дж. Р. (2002). Коэффициенты боковой диффузии в мембранах, измеренные с помощью резонансной передачи энергии и нового алгоритма диффузии в двух измерениях. Biophys. J. 82, 1358–1372.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лакович, Дж. Р. (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии , 3-е изд. Нью-Йорк: Спрингер.

Ледер, Р.О., Хелгерсон, С. Л., и Томас, Д. Д. (1989). Поперечное расположение хромофора сетчатки в пурпурной мембране за счет передачи энергии, усиленной диффузией. J. Mol. Биол. 209, 683–701.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Леви В., Росси Дж. П. Ф. К., Кастелло П. Р. и Флеха Ф. Л. Г. (2003). Количественный анализ мембранных белок-амфифильных взаимодействий с использованием резонансного переноса энергии. Анал. Biochem. 317, 171–179.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Леви В., Росси Дж. П. Ф. К., Эшарт М. М., Кастелло П. Р. и Флеча Ф. Л. Г. (2000). Термическая стабильность кальциевого насоса плазматической мембраны. Количественный анализ его зависимости от липидно-белковых взаимодействий. J. Membr. Биол. 173, 215–225.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ли, М., Редди, Л.Г., Беннет, Р., Сильва, Н.Д. Младший, Джонс, Л. Р., и Томас, Д. Д. (1999). Метод переноса энергии флуоресценции для анализа олигомерной структуры белка: приложение к фосфоламбану. Biophys. J. 76, 2587–2599.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Коутиньо, А., Сильва, А., Федоров, А., Прието, М. (2006). Структурные эффекты основного пептида на организацию мембран дипальмитоилфосфатидилхолин / дипальмитоилфосфатидилсерин: исследование флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Phys. Chem. В 110, 8130–8141.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Федоров, А., Прието, М. (1996). Резонансный перенос энергии в модельной системе мембран: приложение к гелевой и жидкокристаллической фазам. Biophys. J. 71, 1823–1836.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Федоров, А., Прието, М. (2000a).Разделение мембранных зондов в двухкомпонентной липидной системе гель / жидкость: исследование флуоресцентного резонансного переноса энергии. Биохим. Биофиз. Acta 1467, 101–112.

CrossRef Полный текст

Лора, Л. М. С., Федоров, А., Прието, М. (2000b). Неоднородность распределения мембранного зонда: исследование резонансной передачи энергии. J. Phys. Chem. B 104, 6920–6931.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Фернандес, Ф., и Прието, М. (2010a). Микрогетерогенность мембраны: характеристика резонансного переноса энергии Фёрстера латеральных мембранных доменов. евро. Биофиз. J. 39, 589–607.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Прието, М., и Фернандес, Ф. (2010b). Количественная оценка белково-липидной селективности с помощью FRET. евро. Биофиз. J. 39, 565–578.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., и Прието, М. (2000). Резонансный перенос энергии в гетерогенных плоских и двухслойных системах: теория и моделирование. J. Phys. Chem. B 104, 6911–6919.

CrossRef Полный текст

Марш Д. и Хорват Л. И. (1998). Структура, динамика и состав липид-белковой границы. Перспективы спин-этикетирования. Биохим. Биофиз. Acta 1376, 267–296.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

Мельцер, Р. Х., Лурц, М. М., Венсель, Т. Г., и Педерсен, С. Е. (2006). Электростатика никотинового ацетилхолинового рецепторного канала определяется усиленной диффузией передачей энергии люминесценции. Biophys. J. 91, 1315–1324.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Мерсье, Дж. Ф., Салахпур, А., Анже, С., Брейт, А., и Бувье, М. (2002). Количественная оценка гомо- и гетеродимеризации бета-1- и бета-2-адренорецепторов по резонансному переносу энергии биолюминесценции. J. Biol. Chem. 277, 44925–44931.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Мейер, Б.Х., Сегура, Ж.-М., Мартинес, К. Л., Ховиус, Р., Джордж, Н., Джонссон, К., и Фогель, Х. (2006). Визуализация FRET показывает, что функциональные рецепторы нейрокинина-1 являются мономерными и находятся в микродоменах мембран живых клеток. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 2138–2143.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Моррис, С. Дж., Судхоф, Т. К., и Хейнс, Д. Х. (1982). Резонансный перенос энергии, стимулируемый кальцием, между флуоресцентно меченными белками во время агрегации мембран хромаффинных гранул. Биохим. Биофиз. Acta 693, 425–436.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Нараянасвами В. и МакНэми М. Г. (1993). Белково-липидные взаимодействия и функция никотинового ацетилхолинового рецептора Torpedo californica . 2. Текучесть мембраны и лиганд-опосредованное изменение доступности остатков цистеина гамма-субъединицы для холестерина. Биохимия 32, 12420–12427.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Нельсон, Л.Д., Чейнтия, С., Лондон, Э. (2010). Ассоциация перфринголизина O с упорядоченными липидными доменами: влияние на сродство трансмембранного белка к рафту. Biophys. J. 99, 3255–3263.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Номикос М., Малгрю-Несбитт А., Паллави П., Михалин Г., Зайцева И., Суонн К., Лай Ф.А., Мюррей Д. и Маклафлин С. (2007) . Связывание фосфоинозитид-специфической фосфолипазы C-ξ (PLC-ξ) с фосфолипидными мембранами. J. Biol. Chem. 282, 16644–16653.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Падилья-Парра, С., Одуж, Н., Коппи-Мойзан, М., и Трамье, М. (2008). Количественный FRET-анализ с помощью быстрого сбора данных FLIM во временной области с высоким пространственным разрешением в живых клетках. Biophys. J. 95, 2976–2988.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Пап, Э. Х. У., Бастианс, П.И. Х., Борст, Дж. У., ван ден Берг, П. А. У., ван Хук, А., Снук, Г. Т., Виртц, К. В. А. и Виссер, А. Дж. У. Г. (1993). Количественное определение взаимодействия протеинкиназы С с диацилглицерином и фосфоинозитидами с помощью детектирования резонансной передачи энергии с временным разрешением. Биохимия 32, 13310–13317.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Picas, L., Suárez-Germà, C., Montero, M. T., Vázquez-Ibar, J. L., Hernández-Borrell, J., Прието, М., и Лора, Л.М.С. (2010). Селективность липидов лактозопермеазы с использованием резонансного переноса энергии Ферстера. Биохим. Биофиз. Acta 1798, 1707–1713.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Поведа, Дж. А., Энсинар, Дж. А., Фернандес, А. М., Матео, К. Р., Феррагут, Дж. А., и Гонсалес-Рос, Дж. М. (2002). Сегрегация доменов, богатых фосфатидной кислотой, в восстановленных мембранах рецепторов ацетилхолина. Биохимия 41, 12253–12262.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Шарма П., Варма Р., Сарасидж Р. К., Ира, Гуссет К., Кришнамурти Г., Рао М. и мэр С. (2004). Наноразмерная организация множественных GPI-заякоренных белков в мембранах живых клеток. Cell 116, 577–589.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Сильвиус, Дж. Р. (2003). Передача энергии флуоресценции выявляет образование микродоменов при физиологических температурах в липидных смесях, моделирующих внешний листок плазматической мембраны. Biophys. J. 85, 1034–1045.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Стейнберг И. З., Качальски Э. (1968). Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательном переносе энергии. J. Chem. Phys. 48, 2404–2410.

CrossRef Полный текст

Страйер, Л. (1978). Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Annu. Rev. Biochem. 47, 829–846.

CrossRef Полный текст

Валенсуэла, К. Ф., Вайн, П., Игерабид, Дж., И Джонсон, Д. А. (1994). Поперечное расстояние между мембраной и сайтами связывания агонистов на рецепторе ацетилхолина Torpedo: исследование флуоресценции. Biophys. J. 66, 674–682.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

ван ден Богаарт, Г., Холт, М.Г., Бунт, Г., Ридель, Д., Воутерс, Ф. С., и Ян, Р. (2010). Для слияния мембран достаточно одного комплекса SNARE. Nat. Struct. Мол. Биол. 17, 358–364.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Van Der Meer, B. W., Coker, G. III, and Chen, S.-Y. С. (1994). Резонансный перенос энергии: теория и данные . Нью-Йорк: ВЧ.

Витч В. и Страйер Л. (1977). Димерная природа трансмембранного канала грамицидина А: исследования проводимости и передачи энергии флуоресценции гибридных каналов. J. Mol. Биол. 113, 89–102.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фон Арним, CAF, Kinoshita, A., Peltan, ID, Tangredi, MM, Herl, L., Lee, BM, Spoelgen, R., Hshieh, TT, Ranganathan, S., Battey, FD, Liu, CX, Bacskai, BJ, Sever, S., Irizarry, MC, Strickland, DK, и Hyman, BT (2005). Белок, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP), представляет собой новый субстрат бета-секретазы (BACE1). Дж.Биол. Chem. 280, 17777–17785.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Егнесваран, С., Вуд, Г. М., Эсмон, К. Т., и Джонсон, А. Э. (1997). Белок S изменяет расположение активного центра активированного протеина C над поверхностью мембраны. Исследование топографии с флуоресцентным резонансным переносом энергии. J. Biol. Chem. 272, 25013–25021.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Йеу, Э.К. Л. и Клейтон А. Х. А. (2007). Подсчет состояний олигомеризации мембранных белков в живых клетках методами гомо-FRET-спектроскопии и микроскопии: теория и применение. Biophys. J. 92, 3098–3104.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ю, М., Ли, Э., Уимли, В. К., и Христова, К. (2005). Фёрстеровский резонансный перенос энергии в липосомах: измерения димеризации трансмембранной спирали в естественной двухслойной среде.