36 регион где: 36 и 136 регион — это какой город России

Содержание

Коды регионов России (rus) — Центр научной мысли

01 Код региона Республика Адыгея

02 Код региона Республика Башкортостан

03 Код региона Республика Бурятия

04 Код региона Республика Алтай

05 Код региона Республика Дагестан

06 Код региона Республика Ингушетия

07 Код региона Кабардино-Балкарская Республика

08 Код региона Республика Калмыкия

09 Код региона Карачаево-Черкесская Республика

10 Код региона Республика Карелия

11 Код региона Республика Коми

12 Код региона Республика Марий Эл

13 Код региона Республика Мордовия

14 Код региона Республика Саха (Якутия)

15 Код региона Республика Северная Осетия

16 Код региона Республика Татарстан

17 Код региона Республика Тыва (Тува)

18 Код региона Удмуртская Республика

19 Код региона Республика Хакасия

20 Код региона Чеченская Республика

21 Код региона Чувашская Республика

22 Код региона Алтайский край

23 Код региона Краснодарский край

24 Код региона Красноярский край

25 Код региона Приморский край

26 Код региона Ставропольский край

27 Код региона Хабаровский край

28 Код региона Амурская область

29 Код региона Архангельская область

30 Код региона Астраханская область

31 Код региона Белгородская область

32 Код региона Брянская область

33 Код региона Владимирская область

34 Код региона Волгоградская область

35 Код региона Вологодская область

36 Код региона Воронежская область

37 Код региона Ивановская область

38 Код региона Иркутская область

39 Код региона Калининградская область

40 Код региона Калужская область

41 Код региона Камчатская область

42 Код региона Кемеровская область

43 Код региона Кировская область

44 Код региона Костромская область

45 Код региона Курганская область

46 Код региона Курская область

47 Код региона Ленинградская область

48 Код региона Липецкая область

49 Код региона Магаданская область

50 Код региона Московская область

51 Код региона Мурманская область

52 Код региона Нижегородская область

53 Код региона Новгородская область

54 Код региона Новосибирская область

55 Код региона Омская область

56 Код региона Оренбургская область

57 Код региона Орловская область

58 Код региона Пензенская область

59 Код региона Пермская область

60 Код региона Псковская область

61 Код региона Ростовская область

62 Код региона Рязанская область

63 Код региона Самарская область

64 Код региона Саратовская область

65 Код региона Сахалинская область

66 Код региона Свердловская область

67 Код региона Смоленская область

68 Код региона Тамбовская область

69 Код региона Тверская область

70 Код региона Томская область

71 Код региона Тульская область

72 Код региона Тюменская область

73 Код региона Ульяновская область

74 Код региона Челябинская область

75 Код региона Читинская область

76 Код региона Ярославская область

77 Код региона г. Москва

78 Код региона г. Санкт-Петербург

79 Код региона Еврейская автономная область

80 Код региона Агинский Бурятский автономный округ

81 Код региона Коми-Пермяцкий автономный округ

82 Код региона Корякский автономный округ

83 Код региона Ненецкий автономный округ

84 Код региона Таймырский автономный округ

85 Код региона Усть-Ордынский Бурятский автономный округ

86 Код региона Ханты-Мансийский автономный округ

87 Код региона Чукотский автономный округ

88 Код региона Эвенкийский автономный округ

89 Код региона Ямало-Ненецкий автономный округ

отзывы клиентов и покупателей о компании

А

Абакан

Абу-Даби

Агрыз

Адлер

Азов

Айхал

Аксай

Актобе

Алапаевск

Алейск

Александров

Алексеевка (Белгородская область)

Алексин

Алматы

Алушта

Альметьевск

Амстердам

Анапа

Ангарск

Анкара

Апатиты

Арамиль

Аргун

Армавир

Арсеньев

Артём

Архангельск

Асбест

Асино

Астрахань

Атырау

Ачинск

Б

Баку

Балаково

Балашиха

Барнаул

Батайск

Бежецк

Белгород

Белово

Белогорск

Белорецк

Белореченск

Белоярский

Березники

Берёзовский

Берлин

Бийск

Биробиджан

Бишкек

Благовещенск

Благодарный

Бобруйск

Боготол

Бодайбо

Бокситогорск

Бологое

Болхов

Большой Камень

Боровск

Братск

Брянск

Бугульма

Буденновск

Бузулук

Бухара

В

Валуйки

Варшава

Великие Луки

Великий Новгород

Верхний Тагил

Верхний Уфалей

Верхняя Пышма

Видное

Вильнюс

Винница

Витебск

Владивосток

Владикавказ

Владимир

Волгоград

Волгодонск

Волжск

Волжский

Вологда

Володарск

Волхов

Вольск

Воркута

Воронеж

Воскресенск

Воткинск

Всеволожск

Выборг

Выкса

Вытегра

Вышний Волочек

Вязники

Вязьма

Вятские Поляны

Г

Гагарин

Гатчина

Геленджик

Георгиевск

Глазов

Гомель

Горно-Алтайск

Гороховец

Горячий Ключ

Грайворон

Гремячинск

Гродно

Грозный

Грязи

Губкин

Губкинский

Гулькевичи

Гусев

Д

Дедовск

Десногорск

Дзержинск

Димитровград

Дмитров

Днепр (Днепропетровск)

Долгопрудный

Домодедово

Донецк

Дрезна

Дубна

Душанбе

Дюртюли

Е

Евпатория

Егорьевск

Ейск

Екатеринбург

Елабуга

Елец

Еманжелинск

Ереван

Ессентуки

Ж

Жезказган

Железногорск

Железнодорожный

Жигулевск

Житомир

Жуковский

З

Забайкальск

Заволжье

Заозерск

Запорожье

Зарайск

Звенигород

Зеленоград

Зеленодольск

Зеленокумск

Зима

Златоуст

Знаменск

И

Иваново

Ивантеевка

Ижевск

Избербаш

Иланский

Инта

Иркутск

Исилькуль

Истра

Ишим

Ишимбай

Й

Йошкар-Ола

К

Казань

Калининград

Калтан

Калуга

Каменск-Уральский

Каменск-Шахтинский

Каменское

Камышин

Канаш

Канск

Караганда

Карпинск

Карши

Касимов

Качканар

Кашира

Кемерово

Керчь

Киев

Кимовск

Кимры

Кингисепп

Кинешма

Кириши

Киров

Киров (Калужская область)

Кировград

Кисловодск

Кишинев

Климовск

Клин

Клинцы

Ковров

Ковылкино

Когалым

Коломна

Колпино

кольчугино

Комсомольск-на-Амуре

Конаково

Кондопога

Копейск

Коркино

Королёв

Корсаков

Костомукша

Кострома

Котлас

Краков

Краматорск

Красногорск

Краснодар

Красноперекопск

Краснотурьинск

Красноуральск

Красноуфимск

Красноярск

Кривой Рог

Кропивницкий

Кропоткин

Крымск

Кстово

Кубинка

Кузнецк

Кумертау

Курган

Курск

Кущевская

Кызыл

Кыштым

Л

Лабинск

Лангепас

Лениногорск

Ленск

Лермонтов

Лесной

Ликино-Дулёво

Липецк

Лобня

Лондон

Луга

Луховицы

Лыткарино

Люберцы

М

Магадан

Магнитогорск

Мадрид

Майкоп

Малаховка

Малоярославец

Мантурово

Мариуполь

Маркс

Маркс

Махачкала

Мегион

Межвежьегорск

Междуреченск

Миасс

Минеральные Воды

Минск

Минусинск

Мирный

Михайлов

Михайловка

Михайловск

Мичуринск

Могилёв

Мончегорск

Москва

Московская Область

Муравленко

Мурманск

Муром

Мытищи

Мюнхен

Н

Набережные Челны

Навашино

Надым

Назарово

Назрань

Нальчик

Наро-Фоминск

Нахабино

Находка

Невинномысск

Нерюнгри

Нефтекамск

Нефтеюганск

Нижневартовск

Нижнекамск

Нижнеудинск

Нижний Новгород

Нижний Тагил

Нижняя Тура

Николаев

Нововоронеж

Новокубышевск

Новокузнецк

Новокуйбышевск

Новомосковск

Новороссийск

Новосибирск

Новотроицк

Новоуральск

Новочебоксарск

Новочеркасск

Новый Уренгой

Ногинск

Норильск

Ноябрьск

Нур-Султан

Нюрнберг

Нягань

Нязепетровск

О

Обнинск

Обухово

Одесса

Одинцово

Озерск

Октябрьский

Оленегорск

Омск

Онега

Опочка

Орел

Оренбург

Орехово-Зуево

Орск

Осло

Осташков

Оха

П

Павлово

Павловск

Павловский Посад

Павлодар

Папенбург

Певек

Пенза

Первоуральск

Переславль-Залесский

Пермь

Петрозаводск

Петропавловск

Петропавловск-Камчатский

Печора

Питкяранта

Плавск

Пласт

Подольск

Подпорожье

Покров

Полевской

Полысаево

Полярный

Поронайск

Посёлок Афипский

Посёлок Ахтырский

Поселок Белоозёрский

Поселок Любучаны

Поселок Таксимо

Прага

Прокопьевск

Протвино

Прохладный

Псков

Пугачев

Пушкин

Пушкино

Пущино

Пыть-Ях

Пятигорск

Р

Радужный

Райчихинск

Раменское

Рассказово

Ревда

Реутов

Речица

Ржев

Родники

Рославль

Россошь

Ростов-на-Дону

Рубцовск

Рыбинск

Ряжск

Рязань

С

Саки

Салават

Салехард

Сальск

Самара

Санкт- Петербург

Санкт-Петербург

Саранск

Сарапул

Саратов

Саров

Саяногорск

Севастополь

Северобайкальск

Северодвинск

Северск

Сегежа

село Варваровка

Село Дубовское (Ростовская область)

Село Кожевниково (Томская область)

Село Сабетта

Сергиев Посад

Серебряные Пруды

Серов

Серпухов

Сибай

Симферополь

Скопин

Славгород

Славянск-на-Кубани

Сланцы

Смоленск

Сморгонь

Снежинск

Советск

Советская Гавань

Соликамск

Солнечногорск

Сорочинск

Сосновый Бор

Сочи

Ставрополь

Станица Динская

Станица Ильская

Станица Ленинградская

Станица Отрадная

Станица Северская

Станица Холмская

Старая Русса

Старый Оскол

Стерлитамак

Стрежевой

Струнино

Ступино

Судак

Суджа

Судогда

Суздаль

Сургут

Сызрань

Сыктывкар

Т

Таганрог

Талдом

Тамбов

Ташкент

Таштагол

Тбилиси

Тверь

Темрюк

Тимашевск

Тихвин

Тихорецк

Тобольск

Тольятти

Томилино

Томск

Топки

Торонто

Троицк

Туапсе

Туймазы

Тула

Туринск

Тучково

Тында

Тюмень

У

Удомля

Улан-Удэ

Ульяновск

Урюпинск

Усинск

Уссурийск

Усть- Илимск

Усть-Илимск

Усть-Лабинск

Уфа

Ухта

Ф

Феодосия

Фрязино

Фурманов

Х

Хабаровск

Ханты-Мансийск

Харьков

Хасавюрт

Херсон

Химки

Ц

Цюрих

Ч

Чайковский

Чайковский

Чебоксары

Челябинск

Черемхово

Черепаново

Череповец

Черкесск

Черняховск

Чехов

Чистополь

Чита

Чкаловск

Ш

Шадринск

Шарыпово

Шатура

Шахты

Шимановск

Шимкент

Шлиссельбург

Шумерля

Шуя

Щ

Щекино Тульской области

Щелково

Щербинка

Щецин

Э

Электросталь

Элиста

Энгельс

Ю

Югра

Южно-Сахалинск

Южноуральск

Юрьевец

Я

Якутск

Ялта

Ялуторовск

Янаул

Ярославль

Ясногорск

Яхрома

✅ ООО «36 РЕГИОН», 🏙 Воронеж (OГРН 1083668038288, ИНН 3664093424, КПП 366401001) — 📄 реквизиты, 📞 контакты, ⭐ рейтинг

Последствия пандемии

В полной версии сервиса доступна вся информация по компаниям, которых коснулись последствия пандемии коронавируса: данные об ограничениях работы и о программе помощи от государства тем отраслям, которые испытывают падение спроса

Получить доступ

Краткая справка

ООО «36 РЕГИОН» было зарегистрировано 26 сентября 2008 (существует 13 лет) под ИНН 3664093424 и ОГРН 1083668038288. Юридический адрес 394006, Воронежская область, город Воронеж, Кольцовская улица, 76. Руководитель ЛЕОНОВА ЛЮДМИЛА ВАЛЕНТИНОВНА. Основной вид деятельности ООО «36 РЕГИОН»: 68.3 Операции с недвижимым имуществом за вознаграждение или на договорной основе. Телефон, адрес электронной почты, адрес официального сайта и другие контактные данные ООО «36 РЕГИОН» отсутствуют в ЕГРЮЛ.

Информация на сайте предоставлена из официальных открытых государственных источников.

Контакты ООО «36 РЕГИОН»

Основной адрес

394006, Россия, Воронежская область, город Воронеж, Кольцовская улица, 76

Зарегистрирован 26 сентября 2008

Перейти ко всем адресам


Телефоны

+7 (473). .. показать

Электронная почта


Быстрые и качественные услуги подарит воронежцам проект «Эффективный регион». Последние свежие новости Воронежа и области

В Воронежской области стартует реализация проекта «Эффективный регион», ориентированного на внедрение технологий бережливого производства по методике госкорпорации «Росатом». Его целью является совершенствование механизмов предоставления государственных услуг в наиболее востребованных сферах, в числе которых – ЖКХ, здравоохранение и социальная защита. Запустить проект позволило соглашение о сотрудничестве, которое губернатор Александр Гусев и руководство «Росатома» подписали 15 декабря 2020 года.

Оптимизация предусмотрена по семи ключевым направлениям в рамках бережливых проектов. Вести их будут руководители профильных органов власти, главы муниципальных образований и предприятий. Кроме того, за каждым проектом будут присматривать кураторы из «Росатома» – ими стали сотрудники Нововоронежской АЭС.

За проект «Жилищно-коммунальное хозяйство» отвечает региональный Фонд капремонта под руководством областного департамента ЖКХ и энергетики. Работа в этом направлении призвана оптимизировать процессы подготовки, проведения и приемки ремонта воронежского жилого фонда.

Проект «Здравоохранение» ориентирован на более качественное сопровождение беременных от постановки на диспансерный учет до самого момента рождения ребенка. Задействованы четыре медучреждения: Областной перинатальный центр, роддом №2, а также воронежские городские больницы №11 и №16. Работа будет проходить под надзором профильного департамента.

Качественные улучшения в «Образовании» реализуют на базе Семилукского политехнического колледжа под руководством департамента образования, науки и молодежной политики. Образовательный бережливый проект направлен на отладку процесса профессиональной подготовки для предприятий специалистов среднего звена.

Хохольский район начал под руководством главы районной администрации бережливый проект «Муниципальное управление», цель которого – оптимизация содержания и благоустройства территории Костенского сельского поселения. За «Промышленность» отвечают компания «Некст Трейд» и Борисоглебский приборостроительный завод.

«Социальная защита» – в Советском районе Воронежа под присмотром профильного департамента – планирует в рамках бережливого проекта наладить комплексное получение выплат и пособий по единственному заявлению и за одно посещение. Работа по оптимизации процесса трудоустройства временно безработных в рамках проекта «Занятость населения» пройдет под руководством департамента труда на базе ЦЗН «Молодежный». «Пассажирскими перевозками» в свою очередь озаботится департамент промышленности и транспорта – бережливый проект реализуют на базе Воронежского пассажирского автотранспортного предприятия (ВПАТП) №3.

В ходе декабрьской встречи с руководством «Росатома», определившей дальнейшее сотрудничество, губернатор отметил высокую эффективность взаимодействия госкорпорации и Воронежской области.

– Мы знаем о тех практиках, которые наработаны «Росатомом», в том числе по улучшению госуправления, бережливым технологиям, которые разработаны госкомпанией. Мы внимательно следили и общаемся с нашими коллегами, где все это системно и масштабно применяется. Хочу вас заверить: у нас есть необходимая платформа для того, чтобы все процессы, которые уже опробованы в других регионах, были запущены у нас, – подчеркнул тогда Александр Гусев.

Фото – пресс-служба правительства Воронежской области

Воплотить проекты в жизнь организаторы планируют в срок от четырех до шести месяцев. Из всего этого времени около месяца потребуется на диагностику текущей ситуации и выявление проблем, а еще порядка месяца – на обстоятельное планирование. Контролировать работу над всеми проектами будет сам глава региона – «ревизии» станут ежемесячными.

Заметили ошибку? Выделите ее мышью и нажмите Ctrl+Enter

36 CFR § 261.77 — Запреты в регионе 8, Южный регион. | CFR | Закон США

(a) Использование или занятие любой территории национального леса Самтер или национального леса Чаттахучи, примыкающего к реке Чаттуга, с целью входа в реку или спуска по ней в, на или на любом плавучем объекте или судне любого вида и описания, если это не разрешено разрешением, полученным путем регистрации на регистрационных станциях лесной службы, примыкающих к реке Чаттуга, расположенных на шоссе 28, мосту Лоу-Уотер, Эрлс-Форд, Сэнди-Форд, шоссе 76, Вудалл-Шолс или мосту Переполнения, или если это не разрешено специальным разрешением на использование.

(b) Использование или занятие в рамках любой коммерческой деятельности или ведения бизнеса любой территории Национального леса Самтер или Национального леса Чаттахучи, примыкающего к реке Чаттуга, с целью входа в реку или спуска по ней в любых плавучих средствах. объект или ремесло любого вида или описания, если только это не разрешено специальным разрешением на использование.

(c) Нарушение или несоблюдение любого из условий любого разрешения, разрешающего размещение и использование, указанное в параграфе (a) или (b) этого раздела, запрещено.

(d) Вход, движение, верховая езда или плавание на любой части или участке реки Чаттуга в пределах границ Национального леса Чаттахучи в, на или на любом плавучем объекте или судне любого вида, если только это не разрешено разрешение, полученное путем регистрации на регистрационных станциях лесной службы, примыкающих к реке Чаттуга, расположенных на шоссе 28, мосту Лоу-Уотер, Эрлс-Форд, Сэнди-Форд, шоссе 76, Вудалл-Шолс или мосту переполнения, или если это не разрешено специальным разрешением на использование.

(e) Вход, движение, верховая езда или плавание в рамках любой коммерческой операции или бизнеса на любой части или участке реки Чаттуга в пределах границ национального леса Чаттахучи в, на или на любом плавучем объекте или судне любой вид или описание, если только это не разрешено специальным разрешением на использование.

(f) Нарушение или несоблюдение любого из условий любого разрешения, разрешающего размещение и использование, указанное в параграфе (d) или (e) этого раздела, запрещено.

Мутации в гене UBIAD1 на коротком плече 1 хромосомы, регион 36, вызывают кристаллическую дистрофию роговицы Шнайдера

Цель: Кристаллическая дистрофия роговицы Шнайдера (SCCD; MIM 121800) — редкое аутосомно-доминантное заболевание, характеризующееся аномальным увеличением отложений холестерина и фосфолипидов в роговице, что приводит к прогрессирующему помутнению роговицы. Хотя SCCD был сопоставлен с генетическим интервалом между маркерами D1S1160 и D1S1635, переклассификация ранее не затронутого человека увеличила интервал до D1S2667 и включила девять дополнительных генов.Были проанализированы три гена-кандидата, которые могут участвовать в метаболизме липидов и / или экспрессироваться в роговице.

Методы: Образцы ДНК были получены от шести семей с клинически подтвержденным SCCD. Анализ FRAP1, ANGPTL7 и UBIAD1 был выполнен с помощью секвенирования ДНК на основе ПЦР, чтобы изучить кодирующие белок области, сплайсинговые соединения РНК и 5′-нетранслируемые области (UTR) экзонов.

Полученные результаты: Болезненных мутаций в генах FRAP1 или ANGPTL7 обнаружено не было. Мутация в UBIAD1 была идентифицирована во всех шести семьях: пять семей имели одинаковую мутацию N102S, а одна семья имела мутацию G177R. Прогнозы структуры белка показали, что эти мутации влияют на домен пренилтрансферазы и несколько трансмембранных спиралей. Каждая мутация косегрегирована с заболеванием в четырех семьях с образцами ДНК как пораженных, так и незатронутых людей.Мутации не наблюдались в 100 контрольных образцах ДНК (200 хромосом).

Выводы: Несинонимичные мутации в гене UBIAD1 были обнаружены в шести семействах SCCD, а потенциальная горячая точка мутации наблюдалась в аминокислоте N102. Ожидается, что мутации нарушат функцию белка UBIAD1, поскольку они расположены в высококонсервативных и структурно важных доменах.

Площадь 36 | Специальная Олимпиада Мичиган

Информация о сборе средств и пожертвованиях

Сбор средств является неотъемлемой частью Специальной Олимпиады Зоны 36. Собранные деньги используются для оплаты расходов, связанных с тренировками, регистрационными сборами, транспортом, проживанием, питанием, оборудованием и возможностями проведения турниров для наших спортсменов.

Все поступления от сбора средств и пожертвования, предназначенные для Зоны 36, остаются в Зоне 36 и покрывают расходы по нашей программе.

Если вы хотите сделать пожертвование с вычетом налога в Зону 36, пожалуйста, внесите платеж, подлежащий уплате в Зону 36 Специальной Олимпиады, и отправьте письмо по адресу Специальной Олимпиады Мичиган Район 36, N5405 S Ferguson Rd, Skandia, MI 49885.

Присоединяйтесь к области 36

Зона 36 обеспечивает круглогодичную спортивную подготовку детей и взрослых с ограниченными интеллектуальными возможностями. Зона 36 помогает спортсменам улучшить свою физическую форму, освоить новые спортивные навыки и испытать радость победы в соревнованиях и тренировках.Наряду со спортивными тренировками мы даем спортсменам возможность познакомиться с новыми людьми, подружиться, путешествовать и участвовать в общественных мероприятиях с другими спортсменами и волонтерами Специальных олимпиад. Благодаря специальным олимпийским атлетам спортсмены приобретут чувство собственного достоинства и дисциплину, которые обычно переносятся в школу, дом и на работу.

Area 36 не была бы тем, чем она является, без исключительной поддержки семьи. Семьи играют неотъемлемую роль в успехе всей организации Специальной олимпиады. Члены семьи позволяют спортсмену участвовать в Специальной Олимпиаде, поощряя их в тренировках и делясь своими достижениями.

Кроме того, Зона 36 не смогла бы двигаться вперед без помощи и поддержки наших замечательных добровольцев. Улыбка на лице спортсмена; факт попадания мяча в сетку спортсменом; новый друг, которого завел спортсмен; прилив уверенности, который испытывает спортсмен на финише; эти спортивные достижения возможны благодаря тому, что каждый волонтер на своем пути и дает что-то из своих даров для поддержки целей спортсменов. Во время всех наших местных мероприятий требуются волонтеры для выполнения многих ролей — от секретаря, судьи, бригады по настройке / уборке до обслуживающего персонала.

Если вы или кто-то из ваших знакомых заинтересованы в волонтерстве в любом качестве в Зоне 36, пожалуйста, свяжитесь с директором Зоны Памелой Бахрман по адресу [email protected] или заполнив форму волонтерского интереса по ссылке в разделе Ресурсы Зоны 36.

36 часов в Бароло, Италия

Воскресенье

9) 9 утра Совершите поход

Не говоря уже о холмистой местности. Сеть сентиери, или пешеходных маршрутов, пересекает регион, маня горных велосипедистов, бегунов и воскресных прогулок к виноградникам и окружающей природе.Один прекрасный маршрут начинается в самом Бароло и ведет на юг, за город. Красно-белые указатели тропы ведут к холмистой грунтовой тропе, которая пролегает через виноградники, мимо редких коз и по извилистой дороге к тихой деревушке Новелло, примерно в двух с половиной милях от отеля. Найдите богато украшенный неоготический замок (ныне отель) на дальнем краю города и полюбуйтесь видами далеких Альп, прежде чем вернуться в Бароло через холмы, усыпанные виноградниками.

10) 11:00 Музейное утро

Вернувшись в город, прогуляйтесь по мощеным улочкам Бароло к старинному замку, укреплению цвета охры, история которого восходит к 10 веку.Первоначально оборонительная крепость, это возвышающееся здание позже служило загородным домом для богатой семьи Фаллетти, среди прочего, но сегодня здесь находится WiMu, Музей вина Бароло, где интерактивные экспонаты исследуют вино через научные, культурные и исторические аспекты (входной билет, € 8). Чтобы узнать больше об истории виноделия, загляните в соседний Museo dei Cavatappi, крошечный музей, в котором рассказывается об эволюции штопора с 18-го века, Т-образные тяги, многие из которых имеют любопытный фаллический дизайн, до эффективного винного ключа и кроличьего стиля. инструменты, используемые сегодня (4 евро).

11) 13:00 Final sips

Если вы хотите купить бутылку или просто хотите быстро отпустить глоток и перекусить, La Vite Turchese должен стать вашей последней остановкой перед отъездом из Бароло. Эта гостеприимная энотека отлично подходит для индивидуальных дегустаций вин, поэтому попросите сравнить барбекю из Альбы и Асти. Персонал, столь же дружелюбный, сколь и знающий, укажет виноградники на карте, побеседует о дегустации и подберет сопутствующие закуски, такие как местная салями, хрустящие крекеры таралли и покрытый пеплом козий сыр из этого региона.Бар с двумя залами одновременно служит магазином с тысячами бутылок, поэтому те, кому нравится то, что они пробуют, также могут взять с собой бутылку (или чемодан).


Жилье

В центре города Бароло, Casa Svizzera Agriturismo — это отель типа «постель и завтрак» с шестью комнатами, которым управляет семья Джермано, известные виноделы в этом районе, которые также владеют соседним винным магазином. . Некоторые из недавно отремонтированных номеров, в том числе люкс на верхнем этаже, имеют небольшие балконы с видом на городскую площадь (Via Roma, 65, Barolo; casasvizzera.com; удваивается от 110 €).

В самой старой части Монфорте д’Альба, Le Case della Saracca представляет собой интригующий отель с пансионом типа «постель и завтрак» и рестораном, спрятанным в средневековых постройках. Шесть номеров, некоторые с каминами, привносят современный комфорт в средневековье (Via Cavour, 5, Monforte d’Alba; saracca.com; от 148 евро).

Аренда больших и малых домов доступна по всему региону. Недавние предложения на HomeAway включали современные апартаменты в центре Ла-Морра (от 95 евро за ночь) и дом для отпуска с двумя спальнями на холмах за пределами Монфорте-д’Альба (от 133 евро).

Границы | Влияние конститутивного и острого дефицита коннексина 36 на восприимчивость всего мозга к PTZ-индуцированной нейрональной гиперактивности

Введение

Коннексины — это трансмембранные белки, которые олигомеризуются с образованием трансмембранной поры, называемой гемиканалом, которая обеспечивает обмен молекулами между внеклеточным пространством и внутренней частью клетки. Два полуканала между соседними клетками могут стыковаться и образовывать непрерывную пору, известную как щелевое соединение, что обеспечивает прямое межклеточное соединение.

Несколько типов белков коннексина экспрессируются в головном мозге как в ненейрональных клетках, так и в нейронах. Коннексин 43 (Cx43) экспрессируется в астроцитах и ​​играет важную роль в ионном гомеостазе в синапсе (Ca 2+ и K + ) (Cotrina et al., 1998; Kofuji and Newman, 2004). Через взаимосвязанную сеть астроцитов, связанных с Cx43, ионы могут отводиться от синапсов и определенных областей мозга (Kofuji and Newman, 2004). Нарушение этого процесса может привести к нарушению работы нейронных сетей.Таким образом, было показано, что Cx43 играет важную роль в развитии эпилепсии (Vincze et al., 2019). Коннексин 36 (Cx36) является основным коннексином, экспрессируемым нейронами, и образует межнейрональные щелевые соединения (электрические синапсы), которые отвечают за быструю синаптическую передачу и синхронное возбуждение нейронов в мозге (Rash et al., 2012). Он участвует в функциях мозга, которые зависят от синхронного возбуждения, таких как обучение и память (Allen et al., 2011; Wang and Belousov, 2011), визуальная обработка сетчатки (Kovács-Öller et al., 2017) и сенсомоторный рефлекс у рыбок данио (Miller et al., 2017). Как ключевой структурный компонент электрических синапсов, Cx36 может также действовать как терапевтическая мишень при заболеваниях, включающих недостаточность быстрой связи и аберрантную синхронную активацию, таких как судороги. Однако реципрокные отношения между Сх36 и припадками остались неясными.

Предыдущая работа была посвящена изучению роли Сх36 в патогенезе припадков, но не было единого мнения о том, увеличивает или уменьшает Сх36 предрасположенность к припадкам (Gajda et al., 2005; Jacobson et al., 2010; Voss et al., 2010; Шин, 2013). Jacobson et al. (2010) обнаружили, что у мышей с нокаутом Cx36 наблюдается усиление судорожного поведения после введения пентилентетразола (PTZ; антагонист GABA (A) -рецептора), что указывает на то, что нормальная экспрессия Cx36 может защищать от состояний, вызывающих судороги. Однако это открытие противоречит исследованиям с использованием препарата, блокирующего коннексин, хинина, которые показали, что препарат либо снижает тяжесть приступов (Gajda et al., 2005) или без изменений (Voss et al., 2010). Расхождение потенциально может быть связано с различием между хроническим дефицитом Сх36 (нокаут Сх36) и острым дефицитом Сх36 (хинин). Однако хинин обладает широкой антагонистической активностью в отношении многих различных коннексинов, экспрессируемых в нервной системе, и его эффекты нельзя объяснить только ингибированием Cx36 (Cruikshank et al., 2004; Manjarrez-Marmolejo and Franco-Pérez, 2016). Кроме того, разница в методах индукции приступов и показателях приступов также делает прямые сравнения между исследованиями проблематичными.

Предыдущие результаты также неоднозначны относительно того, как гиперактивность нейронов влияет на экспрессию Cx36. В моделях приступов грызунов и вскрытиях пациентов с эпилепсией некоторые группы обнаружили, что экспрессия Cx36 была увеличена (Collignon et al., 2006; Laura et al., 2015; Wu et al., 2017), в то время как другие обнаружили снижение экспрессии Cx36. (Söhl et al., 2000; Condorelli et al., 2003) или без изменений (Motaghi et al., 2017). Более того, даже несмотря на то, что судороги приводят к изменениям нейронных связей в масштабах всего мозга (Morgan et al., 2010), изменения экспрессии Cx36, вызванные судорогами, изучались только в дорсальном отделе конечного мозга (кора и гиппокамп) (Condorelli et al., 2003; Laura et al., 2015; Motaghi et al., 2017; Wu et al. , 2018). Возможные изменения экспрессии Cx36 в других областях мозга после гиперактивности нейронов остаются неизвестными.

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между Сх36 и гиперактивностью нейронов и устранения технических ограничений, перечисленных выше, мы используем рыбок данио в качестве экспериментальной системы.Небольшой размер личинок рыбок данио облегчает визуализацию всего мозга под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом, который дает уникальную возможность изучить активность всего мозга, а также регуляцию белка Cx36 в интактном организме позвоночных. Кроме того, модель PTZ-индуцированного приступа у рыбок данио хорошо изучена физиологически и поведенчески и является эффективной моделью для определения терапевтических средств, направленных на борьбу с эпилепсией у людей (Baxendale et al., 2012; Baraban et al., 2013).Предыдущие исследования с использованием грызунов и рыбок данио изучали различные эффекты PTZ в различных областях мозга (Shehab et al., 1992; Nehlig, 1998; Baraban et al., 2005; Szyndler et al., 2009; Baxendale et al., 2012; Диас Вердуго и др., 2019; Лю и Барабан, 2019; Ян и др., 2019). Эти регионально-специфические эффекты могут быть эффективно зафиксированы у рыбок данио с использованием недавно разработанной техники MAP-карты с использованием фосфорилированной киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (pERK) в качестве заместителя нейрональной активности (Randlett et al., 2015).

У рыбок данио белки Cx36 кодируются четырьмя генами: cx35.1, cx34.7, cx34.1 и cx35.5 (Miller et al., 2017). В культуре все четыре изоформы распознаются антителом против Cx36 человека, и потеря либо cx34.1 , либо cx35.5 привела к наибольшему снижению маркировки Cx36 антител в масштабе всего мозга. Напротив, потеря cx34.7 и cx35.1 оказывает минимальное влияние на глобальные уровни Cx36. Интересно, что экспрессия Cx34.1 и Cx35.5 взаимозависимы. Например, у животных с потерей функции cx35.5 ( cx35,5 — / — ) большая часть маркировки анти-Cx36 теряется, со слабой остаточной маркировкой от Cx34.1 (Miller et al. , 2017).

Используя рыбок данио, мы создали карту активности всего мозга после гиперактивности, используя метод картирования MAP (Randlett et al., 2015), чтобы определить, что после введения PTZ наблюдаются как дозозависимые, так и региональные изменения гиперактивности нейронов.Кроме того, мы создали карту экспрессии всего мозга Cx36 после введения PTZ. С этим мы определили определенные области мозга, которые показали снижение экспрессии Cx36 после гиперактивности. Наконец, резко снизив функцию Cx36 с помощью препарата, блокирующего Cx36, мефлохина, мы определили, что резкое ингибирование Cx36 является пагубным и делает животное более восприимчивым к PTZ-индуцированной гиперактивности, чем их необработанные аналоги.

Методы

Рыбоводство данио

Все рыбки данио, использованные в этом исследовании, не имели пигмента ( перламутр — / — ) на смешанном фоне штаммов дикого типа AB и TL (Международный ресурсный центр по рыбкам данио). cx35.5 (символ гена ZFIN: gjd2a ) гетерозиготы были подарком доктора Адама Миллера из Университета Орегона. Мутант cx35.5 был создан с помощью TALEN-опосредованного нацеливания на геном, что привело к мутации сдвига рамки считывания (делеция 5 п.н. в экзоне 1) и укорочению полипептида (Shah et al., 2015). Эмбрионы и личинки рыбок данио выращивали при цикле 14 часов света / 10 часов темноты при 28,5 ° C в воде, содержащей 0,1% гидрата метиленового синего (Sigma-Aldrich). Пол не является значимой переменной для используемых личиночных стадий (0–6 дней после оплодотворения, dpf), поскольку лабораторные рыбки данио остаются сексуально недифференцированными до 2-недельного возраста (Maack and Segner, 2003; Wilson et al., 2014). Все процедуры содержания и эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных в Технологическом институте Вирджинии.

Иммуногистохимия

Личинок рыбок данио фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегиде (PFA) на качалке при 4 ° C. Затем образцы обрабатывали и окрашивали, как описано ранее Randlett et al. (2015). Были использованы следующие первичные антитела: p44 / 42 MAPK (tERK) (4696S, Cell Signaling Technologies), Phospho-p44 / 42 MAPK (pERK) (4370S, Cell Signaling Technologies) и антиактивированная каспаза-3 (559565 , BD Pharmingen).Что касается антитела против коннексина 36 (36-4600, Invitrogen), рыбу фиксировали в 2% трихлоруксусной кислоте (TCA) в течение 3 часов, а обработку образцов и окрашивание проводили, как описано ранее (Marsh et al., 2017).

Картирование активности мозга (MAP-mapping)

6 dpf дикого типа и cx35.5 мутантных личинок рыбок данио сначала акклиматизировали в течение 15 мин в 6-луночном планшете, а затем переносили в лунку, содержащую 0 мМ (только среда для зародыша E3), 2, 5, 10, или 20 мМ PTZ в среде зародыша в течение 15 мин.Затем личинок фиксировали в 4% PFA в течение ночи, иммуноокрашивали и визуализировали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1. Последующие анализы MAP-картирования были выполнены, как описано ранее (Randlett et al., 2015). Статистическая значимость определялась с помощью статистики Mann-Whitney U , рассчитывая статистически значимые изменения в соотношении pERK / tERK для каждого зарегистрированного воксела по всем образцам в группе. Коррекция множественного сравнения была сделана с использованием метода на основе коэффициента ложного обнаружения (FDR) с порогом FDR, установленным на 0.005%. Пороговое значение FDR вычислялось для каждого сравнения MAP-карты путем рандомизации пиксельных данных в псевдогруппы в течение 500 итераций. Пиксели с Z-оценкой (рассчитанной на основе статистики Манна-Уитни U ) выше порога FDR считаются значимыми. Для пикселей со значительной Z-оценкой им присваивается значение интенсивности на основе дельта-медианы (дельта-медиана 0–0,5 соответствует 0–65535). Среднее значение интенсивности для каждой области вычислялось путем деления общего значения интенсивности пикселей на общую площадь.Положительные (более активные) и отрицательные (менее активные) значения интенсивности рассчитывались отдельно (т.е. они не компенсируют друг друга). Области со значениями больше или меньше нуля считались существенно разными в данном сравнении. Области мозга, выделенные в тексте этого документа, были выбраны на основе следующих критериев: были выбраны только области мозга (отдельные кластеры нейронов не упоминались), и для выделения были выбраны только области мозга с четко определенными функциями.Все идентифицированные области мозга и кластеры нейронов можно найти в дополнительных таблицах.

Cx36 Карта выражений

При 6 dpf личинок акклиматизировали в течение 15 мин в 6-луночном планшете со средой для эмбрионов, а затем переносили в лунку, содержащую 20 мМ PTZ, на 30 мин или 1 час. Затем личинок либо немедленно фиксировали, либо давали возможность восстановиться в течение 1, 3, 6 или 24 ч в среде для эмбрионов. Личинок фиксировали 2% трихлоруксусной кислотой (TCA) в течение 3 часов и иммуноокрашивали антителами против коннексина 36 и tERK (Miller et al., 2017). Затем конфокальные изображения были преобразованы в стандартный стек изображений мозга tERK с использованием CMTK (Randlett et al., 2015). Чтобы вычесть фоновый сигнал, средний стек из cx35,5 — / — рыб, трансформированных и окрашенных таким же образом, вычитали из всех изображений, а затем обрабатывали, как описано ранее для MAP-картирования, за исключением замены pERK на морфированные и окрашенные. фон за вычетом анти-Cx36 (Randlett et al., 2015).

Количественная оценка гибели клеток

При 6 dpf мутантные личинки и личинки дикого типа сначала акклиматизировались в течение 15 минут в 6-луночном планшете, а затем переносились в лунку, содержащую либо среду для эмбриона, либо 20 мМ PTZ на 1 час.Затем личинок немедленно фиксировали в 4% PFA в течение ночи и иммуноокрашивали. Изображения были преобразованы в стандартный мозг и проанализированы, как описано ранее (Randlett et al., 2015). Области интереса для промежуточного, среднего и конечного мозга из ZBrain затем накладывались на каждый стек, и каспазоположительные клетки подсчитывались в каждой области интереса. Стандартные непарные t -тесты с поправкой Холма-Сидака для множественных сравнений были проведены между каждой группой в GraphPad Prism.

Лечение мефлохином

При 6 dpf личинки подвергались воздействию либо 0.025% ДМСО (группа носителей) или 25 мкМ мефлохина. После 3 ч воздействия рыбу и относящуюся к ней среду (ДМСО или мефлохин) переносили в 6-луночный планшет и давали возможность акклиматизироваться в течение 15 мин. Затем личинок переносили на среду для эмбрионов с 0, 2, 5, 10 или 20 мМ PTZ на 15 мин. Затем личинок немедленно фиксировали в 4% PFA в течение ночи, иммуноокрашивали и отображали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1. Последующий анализ был выполнен, как описано ранее (Randlett et al., 2015).

Обработка изображений и статистический анализ

Изображения были обработаны и количественно оценены с использованием Fiji (Schindelin et al., 2012). MATLAB 2019 (MathWorks) использовался для анализа карты MAP (Randlett et al., 2015). Для количественного определения каспазы-3 статистический анализ выполняли в GraphPad Prism (версия 8). Был проведен непарный t -тест с поправкой Холма-Сидака на множественные сравнения. Результаты считались значимыми, если p <0,05. Исходные данные будут доступны по разумному запросу.

Результаты

PTZ вызывает гиперактивацию нейронов всего мозга дозозависимым образом

PTZ ингибирует опосредованную рецептором ГАМК (A) ингибирующую нейротрансмиссию, что приводит к глобальной гиперактивации нейронов и сходным с припадками неврологическим и поведенческим фенотипам как у грызунов, так и у рыбок данио (Baraban et al., 2005). Чтобы определить, имеют ли разные области мозга различную чувствительность к PTZ-индуцированной гиперактивации нейронов, мы сравнили активность всего мозга у рыб дикого типа, подвергшихся воздействию различных концентраций PTZ. Для этого мы использовали анализ MAP-картирования для создания карт активности всего мозга (Randlett et al., 2015) (рисунок 1A). MAP-картирование предлагает моментальный снимок нейрональной активности за счет использования отношения общей внеклеточной киназы, регулируемой сигналом (tERK), которая присутствует во всех нейронах, и фосфорилированной ERK (pERK), фосфорилированной формы ERK, которая индуцируется в течение 5 мин ( Ji et al., 1999; Дай и др., 2002; Cancedda et al., 2003) после нейрональной активности. Затем ратиометрический сигнал pERK / tERK может быть количественно определен для отдельных зарегистрированных стопок изображений мозга и статистически протестирован в аннотированном трехмерном атласе мозга, Z-Brain (Randlett et al., 2015). Статистическая значимость определялась с помощью статистики Mann-Whitney U , рассчитывая статистически значимые изменения в соотношении pERK / tERK для каждого зарегистрированного воксела по всем образцам в группе. Вокселы, которые показывают статистически значимое увеличение отношения pERK / tERK, показаны зеленым цветом, а статистически значимое уменьшение отношения pERK / tERK показано пурпурным цветом.Путем усреднения pERK по большой группе животных (7–20) MAP-карта генерирует пространственно точный снимок средней нейронной активности в данной группе. Этот метод позволяет нам оценить влияние PTZ на среднюю активность нейронов, хотя время и местоположение иктальных событий не могут быть определены из-за длительной временной интеграции передачи сигналов ERK.

Рисунок 1 . Карта активности всего мозга, показывающая значительные региональные различия в нейрональной активности после воздействия различной концентрации PTZ у дикого типа и cx35.5 — / — личинка рыбок данио. (A) Схема, описывающая процесс сбора и анализа данных для картирования активности всего мозга с использованием техники MAP-картирования. (B) Типичный атлас, изображающий вид спереди и сбоку 4 основных отделов головного мозга у рыбок данио, показывая конечный мозг (Te) голубым, промежуточный мозг (Di) красным, средний мозг (Me) зеленым и ромбовидный мозг ( Rh) пурпурным. (C) Репрезентативный атлас, изображающий меньшие области мозга, упомянутые в тексте.Обонятельная луковица (OLF) помечена синим цветом, паллий (PM) — зеленым, субпаллий (SPM) — пурпурным, гипоталамус (ростральный, промежуточный и каудальный) — голубым (HYT), мозжечок (CB) — красным. , а нижняя олива (IO) — желтым. (D – G) Цветами обозначены области интереса с повышенным (зеленый) или пониженным (пурпурный) соотношением pERK / tERK в группах, обработанных PTZ дикого типа, по сравнению с группой, получавшей только среду дикого типа. (D) Обработка PTZ 2 мМ ( n = 10) (E) Обработка PTZ 5 мМ ( n = 8) (F) Обработка 10 мМ PTZ ( n = 10) и (G) 20 мМ, обработанных PTZ ( n = 10) vs.СМИ ( n = 10). (H – K) Цвета обозначают области интереса с повышенным (зеленый) или пониженным (пурпурный) соотношением pERK / tERK в группах cx35,5 — / — личинок, обработанных PTZ, по сравнению с cx35,5 — / — группа только со средой . (H) Обработка PTZ 2 мМ ( n = 9) (I) Обработка 5 мМ PTZ ( n = 10) (J) Обработка 10 мМ PTZ ( n = 11) и (K) , обработанные 20 мМ PTZ ( n = 10) по сравнению со средой ( n = 9). (L – P) Цвета обозначают области интереса с повышенным (зеленый) или пониженным (пурпурный) соотношением pERK / tERK в группах cx35,5 — / — по сравнению с соответствующими группами дикого типа. (L) Обработка носителя (WT n = 10, MUT n = 9) (M) Обработка 2 мМ PTZ (WT n = 10, MUT n = 9) (N) Обработка PTZ 5 мМ (WT n = 8, MUT = 10) (O) Обработка PTZ 10 мМ (WT n = 10, MUT n = 11) и (P) 20 мМ PTZ обработанные (WT n = 10, MUT n = 10).

Используя MAP-картирование, мы обнаружили регионально-специфические изменения нейрональной активности в ответ на различные концентрации PTZ. Мы лечили животных дикого типа, подвергая их воздействию среды для эмбрионов с 2, 5, 10 и 20 мМ PTZ в течение 15 мин. Животные, подвергавшиеся воздействию только среды, использовались в качестве базовых для сравнения. Активность нейронов измеряли по соотношению pERK / tERK, как описано ранее (Randlett et al., 2015). Полный список статистически значимых изменений нейрональной активности по областям мозга см. В дополнительной таблице 2.После воздействия 2 мМ PTZ мы наблюдали умеренное увеличение нейрональной активности в более ограниченных областях мозга в областях, ответственных за гомеостатическую регуляцию (гипоталамус и преоптическая область) и исполнительное функционирование (субпаллий, паллий), а также мозжечок (рисунок 1D), см. На рисунке 1 представлен атлас областей мозга рыбок данио. После воздействия 5, 10 и 20 мМ PTZ мы наблюдали более широкое увеличение нейрональной активности мозга (рисунки 1E – G). Эти области включают те, которые были активированы 2 мМ PTZ (гипоталамус, преоптическая область, субпаллий и многие области, участвующие в контроле движений, такие как претектум, мозжечок и глазодвигательные ядра.Кроме того, мы наблюдали некоторые области мозга, которые стали менее активными после воздействия PTZ: конечный мозг был менее активен при 10 и 20 мМ PTZ, чем при более низких концентрациях (рис. 1G), а обонятельная луковица была менее активна при всех концентрациях PTZ (рис. 1D– ГРАММ). Полный список всех выявленных изменений представлен в дополнительной таблице 1.

В целом, нам удалось создать PTZ-карту активности всего мозга с изменяющейся дозой у рыбок данио 6 dpf. Мы наблюдали повышенную активность нейронов в областях, ранее идентифицированных как вовлеченные в индуцированную PTZ гиперактивность, таких как паллий и покров зрительного нерва (Liu and Baraban, 2019).Мы также идентифицировали дополнительные области, которые ранее не были идентифицированы, такие как гипоталамус.

Генетический

cx35.5 Дефицит приводит к изменениям нейронной гиперактивности, индуцированной PTZ, во всем головном мозге

Чтобы понять, какое влияние потеря Cx36 оказывает на гиперактивность, мы исследовали изменения активности всего мозга при различных концентрациях PTZ у личинок cx35.5 — / — . cx35.5 — / — рыба имеет полную потерю изоформы Cx35.5 Cx36, а также значительное сокращение трех других изоформ Cx36 (Miller et al., 2017, а также рисунки 3A, B). Однако важно отметить, что некоторая остаточная экспрессия из изоформ, отличных от Cx35.5, действительно сохраняется, и мутант, следовательно, не является полным нокаутом всех изоформ Cx36 (Miller et al., 2017). Мы снова использовали технику MAP-картирования, чтобы определить, какие области мозга показывают значительную разницу между мутантами, обработанными PTZ, и необработанными мутантами. Как и у их братьев и сестер дикого типа, при 2 мМ PTZ, значительное увеличение нейрональной активности наблюдалось в промежуточном мозге (преоптическая область и гипоталамус) и конечном мозге (субпаллий) (Рисунок 1H), см. Рисунок 1 для атласа мозга рыбок данио. регионы.Кроме того, мы увидели увеличение промежуточного мозга (поля ветвления сетчатки), связанные с обработкой изображений (рис. 1H). При 5, 10 и 20 мМ PTZ мы обнаружили карту, очень похожую на карту их братьев и сестер дикого типа, с увеличением и уменьшением во многих из тех же основных областей мозга, перечисленных ранее (Рисунки 1E – G, I – K). Полный список значительно изменившихся областей мозга см. В дополнительной таблице 1.

Изменения в

cx35.5 — / — Карты активности всего мозга по сравнению с диким типом

Чтобы понять различия в гиперактивности нейронов между cx35.5 — / — и животных дикого типа, мы сравнили карту активности cx35,5 — / — и братьев и сестер дикого типа на исходном уровне (только среда) и после воздействия различных концентраций PTZ (рисунки 1L – P) . Мы не наблюдали увеличения нейрональной активности на исходном уровне, однако мы наблюдали снижение активности в cx35,5 — / — по сравнению с диким типом в ретикулоспинальных нейронах ромбовидного мозга и медиальных вестибулярных нейронах (Рисунок 1L), см. Рисунок 1 для атлас областей мозга рыбок данио.При 2 мМ PTZ не было значительных изменений в нейрональной активности всего мозга между cx35,5 — / — и братьями и сестрами дикого типа (рис. 1M). При 5 мМ PTZ наблюдалось небольшое увеличение активности промежуточного мозга (гипоталамус) и конечного мозга (субпаллий) (рис. 1N). При 10 мМ PTZ мы наблюдали увеличение в гипоталамусе и различных областях внутри ромбовидного мозга (рис. 10). Мы также обнаружили области, которые демонстрируют меньшее увеличение активности в cx35.5 — / — по сравнению с диким типом в ромбовидном мозге, особенно в областях, которые зависят от синхронной способности активировать Сх36 (клетки Маутнера, нижняя оливковая) ( Флорес и др., 2012; Yao et al., 2014; Bazzigaluppi et al., 2017). При самой высокой концентрации (20 мМ) мы наблюдали повышенную активность в cx35,5 — / — по сравнению с диким типом в областях, ранее идентифицированных как связанные с припадками в конечном мозге, таких как паллий (Liu and Baraban, 2019). а также гипоталамус. Эти области аналогичны нашим результатам у животных дикого типа после воздействия PTZ, что указывает на увеличение тяжести гиперактивности в этих регионах после обработки PTZ в cx35.5 — / — животное. Мы также наблюдали области, которые демонстрируют меньшее увеличение активности в ромбовидном мозге по сравнению с диким типом, аналогично 10 мМ PTZ, но они менее серьезные (Рисунки 10, P). Полный список региональных различий см. В дополнительной таблице 1.

Genetic

cx35.5 Дефицит не влияет на гибель клеток на исходном уровне или после PTZ

Мы определили, что PTZ отдельно и PTZ в сочетании с cx35.5 дефицит приводит к региональным и дозозависимым изменениям нейрональной активности всего мозга.Одно из возможных объяснений состоит в том, что мутация cx35.5 может привести к измененной гибели нейрональных клеток либо на исходном уровне, либо после PTZ, что затем изменит общий баланс связности мозга. Чтобы проверить это, мы окрашивали активированную каспазу-3 (маркер апоптотических клеток) и количественно определяли количество положительных клеток в каждом из основных отделов мозга (ромбовидный мозг, средний мозг, конечный мозг и промежуточный мозг, см. Рисунок 1B для атласа рыбок данио. области мозга). Мы обнаружили, что не было никаких различий на исходном уровне (только среда) в количестве активированных клеток, положительных по каспазе-3, между 90–100 cx35.5 — / — и братьев и сестер дикого типа в любом из основных отделов мозга (Рисунки 2A – C). Кроме того, не было обнаружено различий в количестве положительных по каспазе-3 клеток при сравнении cx35,5 — / — и братьев и сестер дикого типа после 20 мМ PTZ (рисунки 2D – F). Исходя из этих данных, мы, следовательно, заключаем, что изменения в ответе нейронов у животных cx35.5 вряд ли вызваны измененной индукцией гибели клеток.

Рисунок 2 . Активировал положительные по каспазе 3 клетки путем основного деления мозга, сравнивая cx35.5 — / — по сравнению с диким типом с поворотной камерой и без нее. Репрезентативная сумма проекций стека личинок дикого типа и cx35,5 — / -, обработанных средой (A, B) или PTZ (D, E) и окрашенных антиактивированной каспазой-3. (C – F) Графики, изображающие количество активированных каспазо-3 положительных клеток в ромбовидном, среднем, конечном и промежуточном мозге у дикого типа (черный) по сравнению с cx35,5 — / — (красная) рыба с обработка зародышевой средой (C), (носитель) или (F), PTZ.Данные были проанализированы с использованием непарного t -теста с поправкой Холма-Сидака для множественных сравнений. Обработка среды зародыша (носитель), дикий тип n = 5, cx35,5 — / — n = 10. Обработка PTZ, дикий тип n = 6, cx35,5 — / — n = 8.

Создание карты экспрессии всего мозга Cx36

Чтобы понять, как гиперактивность нейронов влияет на Cx36, мы создали карту экспрессии всего мозга для эффективного и непредвзятого измерения изменений в экспрессии белка с использованием модифицированной процедуры обработки картирования MAP.Мы использовали ранее проверенные человеческие антитела против Cx36, которые распознают все четыре изоформы Cx36 у рыбок данио ( cx34.7, cx35.1, cx34.1 и cx35.5 ). Эти антитела были проверены против антител, специфичных для рыбок данио и изоформ, созданных в клетках HeLa (Miller et al., 2017). Используя это антитело, мы окрашивали братьев и сестер дикого типа (рис. 3А) и cx35,5 — / — (рис. 3В). В соответствии с предыдущими исследованиями, значительная потеря анти-Cx36 окрашивания в cx35.5 — / — Было обнаружено животное (Фигуры 3A, B). Чтобы количественно оценить экспрессию Cx36 во всем мозге, мы выполнили нормализацию изображения (с помощью CMTK) и вычли средний набор всех cx35,5 — / — рыбы от каждого животного. Затем мы использовали тот же конвейер обработки MAP-отображения для количественной оценки отношения Cx36 / tERK. Окрашивание tERK используется для морфинга в качестве стандартной согласованной метки (дополнительный рисунок 1) и для нормализации интенсивности окрашивания у животных и условий с учетом редкой экспрессии Сх36.Статистическую значимость определяли с помощью статистики Mann-Whitney U , вычисляя статистически значимые изменения в соотношении Cx36 / tERK для каждого вокселя. Это представлено на каждом из следующих изображений как статистически значимое увеличение отношения Cx36 / tERK, показанное голубым, и статистически значимое уменьшение отношения Cx36 / tERK, показанное красным. Коррекция FDR использовалась с p <0,00005 в качестве порогового значения для значимости (Randlett et al., 2015). Полученная в результате карта экспрессии Cx36 показывает снижение интенсивности окрашивания Cx36 в cx35.5 — / — рыб по сравнению с братьями и сестрами дикого типа в таких областях, как средний мозг (оптический покров), ромбэнцефалон (ромбомеры, клетки маутнера) и т. Д. (Рис. 3С). См. Дополнительную таблицу 2 для получения полного списка региональных изменений. Затем мы применили этот же метод для проверки выражения Cx36 после PTZ.

Рисунок 3 . Карта экспрессии всего мозга cx35,5 — / — в сравнении с иммуноокрашиванием личинок рыбок данио дикого типа анти-Cx36. (A, B) Окрашивание Anti-Cx36 у рыб дикого типа (A) и cx35.5 — / — рыба (B). (C) Карта экспрессии всего мозга, показывающая повышенную экспрессию в cx35,5 — / — (голубой) и повышенную экспрессию в диком типе (красный), показывающая сравнение экспрессии Cx36 между cx35,5 — / — и диким типом тип. Области с повышенной экспрессией Cx36 в cx35.5 — / — показаны голубым, а области со сниженной экспрессией Cx36 в cx35.5 — / — показаны красным. Дикий тип n = 10, cx35,5 — / — n = 7.

Уменьшение выражения Cx36 после экспонирования PTZ

Затем, чтобы определить, изменяет ли воздействие PTZ экспрессию Cx36, мы сравнили карту экспрессии Cx36 между животными, получавшими PTZ, и животными, не получавшими лечения (только среда).Из-за временных рамок оборота Cx36 (период полураспада ~ 1–3 ч) (Flores et al., 2012) мы не ожидали увидеть изменений в экспрессии только после 15 минут воздействия PTZ. Таким образом, мы подвергали рыбу воздействию PTZ в течение 30 минут и 1 часа, чтобы убедиться, что мы зафиксировали изменения в экспрессии. После 30 минут воздействия PTZ мы обнаружили глобальное снижение маркировки Cx36 (рис. 4A). Аналогичный, но более выраженный эффект наблюдался через 1 час (рис. 4В). Мы наблюдали снижение экспрессии Сх36 в среднем мозге (зрительный канал), промежуточном мозге (поля ветвления сетчатки) и в ромбэнцефалоне в ромбомере 7, области, которая важна для двигательного поведения (рис. 4A, B), см. Рис. атлас областей мозга рыбок данио.После 1 часа PTZ также наблюдалось снижение экспрессии в мозжечке (рис. 4B), области, которая в значительной степени зависит от Сх36 для синхронного возбуждения. Полный список ROI с изменениями см. В дополнительной таблице 2. Вместе эти данные показывают, что экспрессия Cx36 снижается после воздействия PTZ через 30 минут, и это усугубляется после 1 часа воздействия.

Рисунок 4 . Карта экспрессии Cx36 с иммуноокрашиванием всего мозга дикого типа в E3 по сравнению с обработанными PTZ личинками рыбок данио.Вид спереди и сбоку на мозг личинок рыбок данио. Экспрессия Cx36 во всем головном мозге с использованием антитела против Cx36 и tERK. Голубой цвет указывает на усиление мечения Cx36 у обработанных PTZ рыб, а красный цвет указывает на уменьшение мечения Cx36 у обработанных PTZ рыб. (A) После 30 мин воздействия PTZ 20 мМ ( n = 10). (B) Через 1 час воздействия PTZ 20 мМ ( n = 10). (C) 1-часовое восстановление после удаления PTZ, n = 12. (D) 3 часа восстановления после удаления PTZ, n = 12. (E) 6 часов восстановления после удаления PTZ, n = 12. (F) 24 часа восстановления после удаления PTZ, n = 10. (G) График, отображающий номер активированных каспазо-3-положительных клеток в ромбовидном мозге, среднем мозге, конечном мозге и промежуточном мозге у рыб дикого типа с обработкой эмбриональной средой (носитель) (черный) или PTZ (красный). Данные были проанализированы с использованием непарного t -теста с поправкой Холма-Сидака для множественных сравнений, n = 9.

Восстановление экспрессии Cx36 после прекращения воздействия PTZ

Чтобы проверить, восстанавливается ли экспрессия Cx36 после удаления PTZ, мы создали карты экспрессии Cx36 для животных, подвергшихся воздействию 20 мМ PTZ в течение 1 часа, а затем позволили им восстановиться в среде эмбриона в течение 1, 3, 6 или 24 часов после удаления PTZ. . По сравнению с животными, не подвергавшимися воздействию PTZ (только среда), экспрессия Cx36 все еще значительно снижалась в конечном мозге (паллий, субпаллий) и промежуточном мозге (габенула, претектум) через 1 час восстановления, но наблюдалось некоторое увеличение экспрессии в ограниченных областях. в ромбовидном мозге (рис. 4C).Снижение экспрессии Сх36 почти полностью восстановилось через 3 часа (рис. 4D). Интересно, что экспрессия затем немного увеличивается к 6 часам восстановления в среднем мозге (нейропиле зрительного нерва) и мозжечке (рис. 4E). Это сохраняется через 24 часа (рис. 4F). Полный список регионов, которые демонстрируют изменения в экспрессии, см. В дополнительной таблице 2. Эти изменения в экспрессии не были связаны с гибелью клеток в результате длительного воздействия PTZ, поскольку не было значительных различий в количестве положительных по каспазе-3 клеток между необработанными. (только СМИ) vs.мы обнаружили тех, кто получал 20 мМ PTZ в течение 1 часа (рис. 4G).

Острая блокада Сх36 увеличивает гиперактивность нейронов после воздействия PTZ

Учитывая, что PTZ-индуцированная гиперактивность нейронов приводит к снижению экспрессии Cx36, мы затем проверили, может ли резкое снижение функции Cx36 вносить вклад в дальнейшую восприимчивость к гиперактивации нейронов, то есть, является ли вызванное PTZ снижение Cx36 дезадаптивным. Чтобы резко подавить функцию Cx36, мы использовали Cx36-специфический блокирующий препарат, мефлохин, и исследовали изменения нейрональной активности (Harris and Locke, 2008).Эффекты мефлохина оценивали путем сравнения карт активности рыб дикого типа, обработанных ДМСО (носитель) или 25 мкМ мефлохина в течение 3 ч перед воздействием различных концентраций PTZ (0–20 мМ). Подобно нашему картированию активности дикого типа (рисунки 1D – G), мы наблюдали значительное увеличение нейрональной активности у животных, получавших ДМСО, после воздействия PTZ в зависимости от дозы (рисунки 5A – D). Это увеличение было больше по сравнению с животными дикого типа, не подвергавшимися воздействию ДМСО (рисунки 1D – G), вероятно, из-за более низкого исходного уровня нервной активности, вызванного умеренными ингибирующими эффектами ДМСО на возбуждающие токи (дополнительный рисунок 2, дополнительная таблица 5) ( Лу и Маттсон, 2001; Tamagnini et al., 2014). При 2–5 мМ PTZ мы наблюдали увеличение активности в среднем мозге (оптический покров, нейропиль), ромбэнцефалоне (мозжечок), конечном мозге (паллий) и промежуточном мозге (гипоталамус) (рисунки 5A, B, см. Рисунки 1B, C. области мозга рыбок данио). Также наблюдалось снижение активности обонятельной луковицы (Рисунки 5A, B). При 10 мМ мы наблюдали увеличение в аналогичных областях, причем большее увеличение наблюдалось в гипоталамусе, уменьшение в обонятельной луковице и небольшое уменьшение в гипоталамусе и паллии (рис. 5C).Наконец, при 20 мМ PTZ наблюдалось увеличение нейрональной активности в тех же областях, что и при предыдущих дозах, с наибольшим увеличением в гипоталамусе. Также наблюдалось снижение обонятельной системы, гипоталамуса и паллия (рис. 5D). У рыб, получавших мефлохин, мы обнаружили очень сходные общие закономерности с рыбами, получавшими ДМСО (Рисунки 5A – D), с прогрессивно более высокой нейрональной активностью с увеличением концентрации PTZ (Рисунки 5E-H).

Рисунок 5 .Карта активности всего мозга, показывающая значительные региональные различия после блокирования Cx36 лекарственного препарата мефлохин и воздействия PTZ на личинок рыбок данио дикого типа. Вид спереди и сбоку на мозг личинок рыбок данио. (A – D) На изображениях показаны области со значительно повышенной (зеленый) или пониженной (пурпурный) активностью по сравнению с рыбами, обработанными ДМСО и эмбриональной средой (наполнитель) ( n = 9). (A) 2 мМ PTZ ( n = 10). (B) 5 мм PTZ ( n = 10) (C) 10 мм PTZ ( n = 10). (D) 20 мМ PTZ ( n = 10). (E – H) На изображениях показаны области со значительно повышенной (зеленый) или пониженной (пурпурный) активностью по сравнению с рыбами, обработанными мефлохином и эмбриональной средой (носитель) ( n = 9). (E) 2 мм PTZ ( n = 10). (F) 5 мм PTZ ( n = 8). (G) 10 мМ PTZ ( n = 10). (H) 20 мМ PTZ ( n = 10). (I – M) На изображениях показаны области со значительно повышенной (зеленый) или пониженной (пурпурный) активностью у рыб, обработанных мефлохином, по сравнению с рыбами, обработанными ДМСО (носитель). (I) среда для эмбрионов (0 мМ PTZ) ( n = 9). (J) 2 мм PTZ ( n = 10). (K) 5 мМ PTZ (ДМСО n = 10, мефлохин n = 8) (L) 10 мМ PTZ ( n = 10). (M) 20 мМ PTZ ( n = 10). Меф: мефлохин.

Затем мы сравнили мефлохин и братьев и сестер, получавших ДМСО, при различных концентрациях PTZ. В отсутствие PTZ у рыб, получавших мефлохин, наблюдалось увеличение и уменьшение нейрональной активности в различных областях мозга по сравнению с братьями и сестрами, получавшими ДМСО (рис. 5I).В частности, мы наблюдали умеренное увеличение гипоталамуса, мозжечка и среднего мозга (тегментума). Наблюдалось снижение нейрональной активности по сравнению с контролем, получавшим ДМСО, в конечном мозге, особенно в обонятельной луковице и субпаллии (рис. 5I). При 2 мМ PTZ рыба, обработанная мефлохином, показала увеличение в основных областях, связанных с воздействием PTZ (рис. 1D), по сравнению с рыбой, обработанной DMSO. Было обнаружено увеличение гипоталамуса, промежуточного мозга (поля ветвления сетчатки, претектум) и конечного мозга (субпаллиум).Было уменьшение обонятельной луковицы и других областей конечного мозга по сравнению с контролем (рис. 5J). При 5 мМ PTZ мы обнаружили аналогичные области повышенной активности у обработанных мефлохином рыб, но мы также увидели области, которые показали пониженную активность по сравнению с контролем как в конечном, так и в ромбовидном мозге (рис. 5K). Известно, что некоторые области ромбовидного мозга со сниженной активностью зависят от функциональности Сх36, в частности, нижние оливковые клетки и клетки Маутнера (Flores et al., 2012; Yao et al., 2014; Bazzigaluppi et al., 2017). При 10 и 20 мМ PTZ мы наблюдали аналогичное увеличение активности у обработанных мефлохином рыб, каждое из которых увеличивалось с дозой PTZ, и снижение активности по сравнению с контролем в конечном мозге, которое было менее тяжелым, чем 5 мМ, в этих двух группах (рисунки 5Л, М). При 20 мМ мы наблюдали снижение активности в гипоталамусе и среднем мозге (глазодвигательных ядрах) по сравнению с диким типом, чего не наблюдалось при других дозах (рис. 5M). Полный список измененных регионов см. В дополнительной таблице 3.По сравнению с cx35,5 — / — животным (Рисунки 1L – P) повышение активности, которое мы обнаружили у животных, получавших мефлохин, было более распространенным. В целом, эти результаты показывают, что резкое снижение функциональности Cx36 приводит к повышенной восприимчивости к PTZ-индуцированной гиперактивности нейронов.

Снижение индуцированной мефлохином чувствительности к PTZ у

cx35,5 Мутанты

Более тяжелый фенотип мефлохина по сравнению с мутантами c x35.5 может быть вызван острым ингибированием обоих Cx35.5 и другие изоформы Сх36. Мефлохин в умеренных концентрациях оказывает различные побочные эффекты. Кроме того, мутанты cx35.5 все еще имеют низкие уровни мечения Cx36 (Miller et al., 2017, и рисунок 3), что означает, что модель не является полной нокаутом. Таким образом, мы хотели определить, какие изменения нейрональной активности после лечения мефлохином связаны с этими различными нецелевыми эффектами. Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали влияние мефлохина на рыбу cx35.5 — / — с функцией PTZ и без нее.Мы сравнили различия в активности нейронов у обработанных мефлохином и обработанных ДМСО cx35,5 — / — рыбы, без PTZ (только среда для эмбриона), 5 мМ PTZ или 20 мМ PTZ (рис. 6). Во всех условиях мы наблюдали снижение активности нейронов в конечном мозге (обонятельная луковица, субпаллий, паллий), промежуточном мозге (габенула, поля ветвления сетчатки) и ромбовидном мозге (нижняя олива). Как в среде зародыша, так и в условиях PTZ с 5 мМ мы наблюдали увеличение нейрональной активности после введения мефлохина в небольшую область ромбовидного мозга (область постремы, нейропиль, ромбомер 7).При 20 мМ PTZ мы наблюдаем небольшое увеличение активности в меньших кластерах нейронов и наблюдали значительное снижение в конечном мозге (обонятельная луковица, паллий, субпаллий), промежуточном мозге (габенула) и ромбэнцефалоне (рис. 6С). Эти изменения нейрональной активности являются cx35.5 -независимыми и, вероятно, являются нецелевыми эффектами и могут быть следствием ингибирования других изоформ Cx36. Тем не менее, эффекты мефлохина значительно снижены у животных cx35,5 — / — по сравнению с его воздействием на животных дикого типа (сравните рисунки 5A – D с рисунками 6A – C).В частности, у животных cx35.5 — / — не наблюдалось выраженного увеличения нейрональной активности в области гипоталамуса, претектума и субпаллия. Этот результат указывает на то, что большая часть эффектов мефлохина зависит от экспрессии Cx36. Полный список измененных регионов см. В дополнительной таблице 4.

Рисунок 6 . Активность всего мозга cx35,5 — / — животных, получавших мефлохин, по сравнению с ДМСО. Показаны виды головного мозга личинок рыбок данио сверху и сбоку.На изображениях показаны области со значительно повышенной (зеленый) или пониженной (пурпурный) активностью у cx35,5 — / — животных, получавших мефлохин, по сравнению с cx35,5 — / — животных, получавших ДМСО. (A) Эмбриональная среда (0 мМ PTZ) ( cx35,5 — / — мефлохин n = 9, cx35,5 — / — DMSO n = 11). (B) 5 мМ PTZ ( cx35,5 — / — мефлохин n = 11, cx35,5 — / — DMSO n = 11). (C) 20 мМ PTZ (cx35.5 — / — мефлохин n = 10, cx35,5 — / — DMSO n = 7). Меф: мефлохин.

Обсуждение

Целью этого исследования было понять взаимную связь между Сх36 и гиперактивностью нейронов в масштабе всего мозга. Мы использовали MAP-картирование для количественной оценки нейрональной активности и экспрессии белков во всем мозге. Таким образом, мы охарактеризовали сложный характер этой взаимосвязи и ее зависимость от многих факторов, включая регион мозга, дозу лекарства и время воздействия.Мы обнаружили, что хронический дефицит у мутантов cx35.5 изменяет восприимчивость к PTZ-индуцированной гиперактивности нейронов регионально-специфическим образом. Мы разработали метод количественной оценки экспрессии изоформ Cx36 рыбок данио и обнаружили, что воздействие PTZ приводило к резкому снижению белка Cx36, который восстанавливался и слегка превышался при удалении PTZ. Наконец, мы наблюдали, что резкое ингибирование Сх36 мефлохином приводит к значительному увеличению восприимчивости к гиперактивности, индуцированной PTZ.Взятые вместе, эти результаты предполагают, что Cx36 действует для предотвращения гиперактивности в головном мозге, и что потеря белка Cx36, как острая (потенциально из-за предшествующей гиперактивности), так и хроническая, приводит к увеличению предрасположенности к гиперактивности.

PTZ оказывает влияние на мозг и регион

PTZ использовался в качестве химического конвульсанта во многих моделях эпилепсии на животных и, как известно, вызывает генерализованную, но неоднородную активацию мозга (Shehab et al., 1992; Nehlig, 1998; Baraban et al., 2005; Szyndler et al., 2009; Baxendale et al., 2012; Диас Вердуго и др., 2019; Ян и др., 2019). Предыдущие исследования с использованием изображений кальция на рыбках данио обнаружили повышение нейрональной активности и синхронности после введения PTZ с дифференцированным привлечением различных областей мозга. Например, Лю и Барабан обнаружили, что усиление нейрональной активности происходит в мантии, а затем распространяется на задний мозг (Liu and Baraban, 2019). Кроме того, было обнаружено значительное увеличение нейронных связей в каждой из наблюдаемых областей (Diaz Verdugo et al., 2019). Исследования на более молодых рыбках данио (2 dpf) также обнаружили изменения в экспрессии c-fos после введения PTZ способом, подобным нашей MAP-карте (Baxendale et al., 2012). Нам удалось создать карты активности для различных концентраций PTZ, которые идентифицируют те же области, описанные ранее (паллий, оптический покров, задний мозг), но также и дополнительные области мозга, которые ранее не были задействованы (например, гипоталамус). Это демонстрирует важность выявления эффектов, специфичных для области мозга, при исследовании гиперактивности.Взятые вместе, эти результаты иллюстрируют уникальные дозозависимые эффекты PTZ на весь мозг, которые могут быть расширены в будущей работе.

cx35.5 Нокдаун вызывает региональные изменения гиперактивности после администрирования PTZ

В дополнение к характеристике влияния PTZ на активность всего мозга у животных дикого типа, мы получили представление об эффектах PTZ у рыбок данио cx35,5 — / — . Мы наблюдали увеличение количества областей, идентифицированных в нашем эксперименте по реакции на дозу PTZ, что указывает на более серьезное увеличение гиперактивности нейронов после введения PTZ в этих областях (рис. 1).Эти результаты согласуются с предыдущим поведением, которое показало повышенную восприимчивость мутантов Cx36 к PTZ-индуцированному тяжелому припадочному поведению, чем их аналоги дикого типа (Jacobson et al., 2010). Помимо увеличения активности, мы наблюдали значительное снижение нейрональной активности при концентрациях 10 мМ PTZ. Это снижение наблюдалось в ромбовидном мозге, особенно в областях, которые полагаются на Сх36 для синхронного возбуждения (нижняя оливковая, клетки Маутнера) (Flores et al., 2012; Yao et al., 2014; Bazzigaluppi et al., 2017). Эти результаты важны, так как это первое исследование, показывающее региональные различия в нейрональной активности между Cx36-дефицитными животными и животными дикого типа, что указывает на отсутствие возможности обобщения от области к области внутри мозга при изучении белков коннексина.

Гиперактивность, вызванная PTZ, вызывает регионально-специфическое снижение экспрессии Cx36

Чтобы лучше понять взаимосвязь между Сх36 и гиперактивностью, мы задали ответный вопрос: как гиперактивность влияет на Сх36? Подобно исследованиям предрасположенности к приступам, работа по выявлению этой взаимосвязи остается противоречивой (Söhl et al., 2000; Лаура и др., 2015; Motaghi et al., 2017; Wu et al., 2017). Предыдущие подходы, использованные для решения этого вопроса (например, кПЦР, вестерн-блоттинг), не обладали необходимым пространственным разрешением, чтобы определить, изменяются ли эффекты гиперактивности на Сх36 в зависимости от области мозга. Чтобы устранить эти недостатки, мы разработали новый метод количественной оценки экспрессии белка Cx36 во всем головном мозге с использованием окрашивания антител в сочетании с модифицированной техникой картирования MAP (рис. 3). Таким образом, мы смогли определить, что существуют региональные различия и различия во времени воздействия в снижении Сх36 в ответ на индукцию припадка с помощью PTZ.В частности, мы наблюдали снижение в зависимости от региона после воздействия PTZ в течение 30 минут, и это снижение было больше после 1 часа воздействия PTZ (Рисунок 4). Таким образом, мы определили, что PTZ оказывает регионально-специфические эффекты на Cx36, и что изменения, обнаруженные в одной области мозга, могут не иметь прямого отношения к другим регионам.

Снижение экспрессии Сх36 после гиперактивности является острым и восстанавливается со временем

Наблюдая за снижением экспрессии Cx36 после воздействия PTZ, мы измерили временные паттерны этого изменения.Мы обнаружили, что изменение экспрессии Сх36 было резким: оно произошло в течение 1 часа воздействия PTZ и почти полностью восстановилось через 3 часа (Рисунки 4C, D). Тогда восстановление было немного недооценено. Cx36 был сверхэкспрессирован в покровной оболочке зрительного нерва и мозжечке, а также в других областях мозга, и эта избыточная экспрессия сохранялась через 24 часа (Рисунки 4E, F). Поскольку снижение не было вызвано увеличением гибели клеток (рис. 4G), этот эффект, вероятно, связан с увеличением эндоцитоза и деградацией белка Cx36.Различные исследования показали, что существует зависимая от активности модуляция белков Cx36 (Smith and Pereda, 2003; Haas et al., 2016), и эндоцитоз является вероятным механизмом, с помощью которого это может происходить (Flores et al., 2012).

Острое снижение функциональности Cx36 делает организмы более восприимчивыми к гиперактивности, индуцированной PTZ

Чтобы укрепить связь между гиперактивностью и Сх36, мы изучили, как острая блокада Сх36 влияет на предрасположенность к гиперактивности. Является ли снижение Cx36 после воздействия PTZ адаптивным, дезадаптивным или несущественным? Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали мефлохин, специфический для Cx36 блокирующий препарат, и подвергали обработанных и необработанных мефлохином рыб воздействию PTZ, чтобы наблюдать различия.Мефлохин — это противомалярийный препарат, который избирательно блокирует Сх36 и Сх50. В предыдущих исследованиях использовался хинин, который имеет больше побочных эффектов. Предполагается, что мефлохин блокирует Cx36, связываясь с внутренней частью поры, предотвращая поток ионов через эту пору (Harris and Locke, 2008). Мы обнаружили значительное увеличение гиперактивности нейронов после лечения PTZ у рыб, получавших мефлохин, по сравнению с контролем (рис. 5). Этот результат указывает на то, что снижение Сх36 во всех случаях (острых и хронических) пагубно и ведет к изменению тяжести гиперактивности.Этот результат согласуется с Voss et al. (2009), которые обнаружили, что при использовании различных блокаторов щелевых контактов у животных наблюдается повышение нейрональной активности в коре головного мозга, но это противоречит данным Franco-Pérez et al. (2015), которые обнаружили снижение судорожного моторного поведения и активности в моторной коре головного мозга. Это может быть связано с различиями в показателях выпуска. В каждом из этих исследований изучалась отдельная область мозга, и, как мы показали, Сх36 оказывает регионально-специфические эффекты. У рыбок данио нет моторной коры, поэтому мы не можем подтвердить или опровергнуть результаты, полученные Franco-Pérez et al.(2015), однако в нашей модели мы наблюдаем увеличение активности паллия (аналогично коре головного мозга у млекопитающих).

В умеренных дозах (6–25 мкМ) мефлохин может проявлять нецелевые эффекты различной степени (McArdle et al., 2006; Caridha et al., 2008; Harris and Locke, 2008). Чтобы лучше понять эффекты мефлохина не-Cx36, мы обработали cx35,5 — / — рыбу мефлохином и количественно оценили изменения нейрональной активности как в состоянии покоя (в среде для эмбриона), так и после PTZ (5 мМ).Мы наблюдали значительное снижение активности нейронов в переднем мозге и небольшое уменьшение ромбовидного мозга в обоих случаях. Кроме того, мы наблюдали небольшое увеличение активности нейронов в ромбовидном мозге, которое несколько усиливалось PTZ (рис. 6). Мы связываем эти эффекты с нецелевыми эффектами мефлохина. Таким образом, у животных дикого типа изменения, которые мы наблюдали в чувствительности PTZ (Рисунки 5J – M) в других регионах, более вероятно, были вызваны блокадой Cx36.

Мы обнаружили, что влияние мефлохина на PTZ-индуцированную гиперактивность нейронов (рис. 5) было больше, чем у cx35.5 заглушка (рисунок 1). Это может быть связано с различием между острым (мефлохин) и врожденным ( cx35,5 ) нарушением общей функции Сх36. У мутантов cx35.5 могут быть компенсаторные механизмы, которые могут частично улучшать эффекты сниженной функции Cx36 (Rossi et al., 2015). Кроме того, важно отметить, что хотя общие уровни Cx36 (измеренные с помощью иммуномечения Cx36) значительно снижаются у животных cx35.5 — / — , все же остается некоторый остаточный Cx34.1 выражение. Таким образом, более тяжелый фенотип, наблюдаемый у животных, получавших мефлохин, может отражать более полное ингибирование всех изоформ Сх36. Наконец, хотя мы выбрали мефлохин из-за его избирательной активности по отношению к Cx36, он все еще оказывает нецелевые эффекты, включая блокировку других белков коннексина, и может быть токсичным (Cruikshank et al., 2004). Тем не менее, основной эффект мефлохина на PTZ-индуцированную гиперактивность зависит от экспрессии Cx35.5 (Рисунок 6), что подтверждает нашу интерпретацию, что острый нокдаун белков Cx36 рыбок данио мефлохином приводит к повышенной восприимчивости к гиперактивности нейронов (Рисунок 5).

Cx36 как фактор, регулирующий реакцию мозга на гиперактивность

Правдоподобная связь с болезнью человека обнаружена в ювенильной миоклонической эпилепсии (JME). Люди с JME имеют более высокую вероятность нести специфический интронный SNP в гене Cx36 (Mas et al., 2004; Hempelmann et al., 2006). Предполагается, что этот SNP влияет на энхансеры сплайсинга гена, следовательно, влияя на трансляцию белка (Mas et al., 2004). Хотя Cx36 — не единственная причина таких заболеваний, как JME, он может быть сопутствующим фактором.Основываясь на наших результатах, можно предположить, что потеря Сх36 сделает человека более восприимчивым к другим факторам, ведущим к гиперактивности, увеличивая тяжесть гиперактивности (Рисунки 1, 5). Это особенно актуально, поскольку экспрессия Cx36 максимальна во время развития и снижается со временем (Belousov and Fontes, 2013), а JME впервые появляется у детей и подростков.

Наша работа демонстрирует, что Cx36, по-видимому, снижает индуцированную PTZ гиперактивность в определенных областях мозга и что потеря белка является пагубной для этого процесса.Мы смогли определить, где в мозгу мы видим эффекты помимо того, когда происходят эти изменения. Эта работа обеспечивает основу для лучшего понимания роли гиперактивности, вызванной Cx36 и PTZ.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Технологического института штата Вирджиния.

Авторские взносы

AB, MM и YP разработали исследование. AB, KC, MM и YP разработали эксперименты. AB проводил эксперименты. AB, IW и YP проанализировали данные. KC и MM внесли свой вклад в анализ карты MAP. AB и YP написали рукопись. Все авторы внесли свой вклад в редактирование статьи и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа финансировалась Фондом коммерциализации исследований Содружества (ER14S-001-LS для YP) и Virginia Tech.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников Технологического института Вирджинии за животноводство и доктора Адама Миллера за мутантных рыбок данио cx35.5 . Мы также признательны доктору Сьюзан Кэмпбелл и доктору Джеймсу Смиту за их полезные предложения.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2020.587978/full#supplementary-material

Дополнительный рисунок 1. Сравнение интенсивности окрашивания tERK. График, отображающий среднюю интенсивность окрашивания tERK между всеми совместно окрашенными Cx36 группами. Нет значительных различий между группами, обработанными средой и PTZ, для каждого условия воздействия и восстановления.

Дополнительный рисунок 2. Карта активности всего мозга, показывающая эффекты ДМСО у животных дикого типа. Вид спереди и сбоку на мозг личинок рыбок данио.На изображениях показаны области с повышенной (зеленый) и пониженной (пурпурный) активностью у животных дикого типа, обработанных ДМСО, по сравнению с животными дикого типа, обработанными эмбриональной средой (без ДМСО) (ДМСО n = 9; без ДМСО n = 10).

Список литературы

Аллен К., Фукс Э. К., Ящонек Х., Баннерман Д. М. и Моньер Х. (2011). Щелевые соединения между интернейронами необходимы для нормального пространственного кодирования в гиппокампе и кратковременной пространственной памяти. J. Neurosci. 31, 6542–6552.DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.6512-10.2011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барабан, С. К., Диндей, М. Т., и Хортопан, Г. А. (2013). Скрининг лекарств у мутантов Scn1a рыбок данио идентифицирует клемизол как потенциальное средство для лечения синдрома Драве. Nat. Commun. 4: 2410. DOI: 10.1038 / ncomms3410

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барабан, С. К., Тейлор, М. Р., Кастро, П. А., и Байер, Х. (2005). Пентилентетразол вызывал изменения в поведении рыбок данио, нервной активности и экспрессии c-fos. Neuroscience 131, 759–768. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2004.11.031

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баксендейл, С., Холдсворт, К. Дж., Меза Сантоской, П. Л., Харрисон, М. Р. М., Фокс, Дж., Паркин, К. А. и др. (2012). Идентификация соединений с противосудорожными свойствами на модели эпилептических припадков у рыбок данио. DMM Dis. Модели Mecha. 5, 773–784. DOI: 10.1242 / dmm.010090

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баззигалуппи, П., Изения, С. К., Хаасдейк, Э. Д., Эльгерсма, Ю., де Зееу, К. И., ван дер Гиссен, Р. С. и др. (2017). Модуляция щелевых контактов мышиного оливкового коннексина 36 с помощью PKA и CaMKII. Фронт. Клетка. Neurosci. 11: 397. DOI: 10.3389 / fncel.2017.00397

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Белоусов А. Б., Фонтес Дж. Д. (2013). Нейрональные щелевые контакты: создание и разрыв связей во время развития и травмы. Trends Neurosci. 36, 227–236.DOI: 10.1016 / j.tins.2012.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Cancedda, L., Putignano, E., Impey, S., Maffei, L., Ratto, G.M, and Pizzorusso, T. (2003). Узорчатое зрение вызывает опосредованную CRE экспрессию генов в зрительной коре через PKA и ERK. J. Neurosci. 23, 7012–7020. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.23-18-07012.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карида, Д., Юрик, Д., Кабесас, М., Вольф, Л., Хадсон, Т. Х., и Доу, Г. С. (2008). Нарушение гомеостаза кальция в клетках млекопитающих, вызванное мефлохином, аналогично тому, которое вызывается иономицином, загруженным из. Антимикробный. Агенты Chemother. 52, 684–693. DOI: 10.1128 / AAC.00874-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Collignon, F., Wetjen, N. M., Cohen-Gadol, A. A., Cascino, G. D., Parisi, J., Meyer, F. B., et al. (2006). Измененная экспрессия подтипов коннексина при мезиальной височной эпилепсии у людей. J. Neurosurg. 105, 77–87. DOI: 10.3171 / jns.2006.105.1.77

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кондорелли, Д. Ф., Тровато-Салинаро, А., Мудо, Г., Мироне, М. Б., и Беллуардо, Н. (2003). Клеточная экспрессия коннексинов в головном мозге крысы: нейрональная локализация, эффекты каинат-индуцированных припадков и экспрессия в апоптотических нейрональных клетках. евро. J. Neurosci. 18, 1807–1827. DOI: 10.1046 / j.1460-9568.2003.02910.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Котрина, М.Л., Лин, Дж. Х. С., Алвес-Родригес, А., Лю, С., Ли, Дж., Азми-Гадими, Х. и др. (1998). Коннексины регулируют передачу сигналов кальция, контролируя высвобождение АТФ. Proc. Natl. Акад. Sci. США 95, 15735–15740. DOI: 10.1073 / pnas.95.26.15735

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крукшанк, С. Дж., Хопперстад, М., Янгер, М., Коннорс, Б. В., Спрей, Д. К., и Шринивас, М. (2004). Мощная блокировка каналов щелевых соединений Сх36 и Сх50 мефлохином. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101, 12364–12369. DOI: 10.1073 / pnas.0402044101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дай Ю., Ивата К., Фукуока Т., Кондо Э., Токунага А., Яманака Х. и др. (2002). Фосфорилирование киназы, регулируемой внеклеточными сигналами, в первичных афферентных нейронах с помощью вредных стимулов и его участие в периферической сенсибилизации. J. Neurosci. 22, 7737–7745. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.22-17-07737.2002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Диас Вердуго, К., Myren-Svelstad, S., Aydin, E., Van Hoeymissen, E., Deneubourg, C., Vanderhaeghe, S., et al. (2019). Взаимодействия глии с нейроном лежат в основе переходов состояний к генерализованным припадкам. Nat. Commun. 10: 3830. DOI: 10.1038 / s41467-019-11739-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флорес, К. Э., Наннапанени, С., Дэвидсон, К. Г. В., Ясумура, Т., Беннет, М. В. Л., Раш, Дж. Э. и др. (2012). Перемещение каналов щелевого соединения в электрическом синапсе позвоночных in vivo . Proc. Natl. Акад. Sci. 109, E573 – E582. DOI: 10.1073 / pnas.1121557109

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Франко-Перес, Дж., Бальестерос-Зебадуа, П., и Манджаррес-Мармолехо, Дж. (2015). Противосудорожные эффекты мефлохина на генерализованные тонико-клонические судороги, вызванные двумя острыми моделями у крыс. BMC Neurosci. 16: 7. DOI: 10.1186 / s12868-015-0145-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гайда, З., Шупера, З., Блашо, Г., и Сенте, М. (2005). Хинин, блокатор нейрональных каналов cx36, подавляет судорожную активность в неокортексе крысы in vivo . Эпилепсия 46, 1581–1591. DOI: 10.1111 / j.1528-1167.2005.00254.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаас, Дж. С., Гринвальд, К. М., и Переда, А. Э. (2016). Зависимая от активности пластичность электрических синапсов: все больше доказательств ее присутствия и функциональной роли в мозге млекопитающих. BMC Cell Biol. 17:14. DOI: 10.1186 / s12860-016-0090-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харрис А. и Локк Д. (2008). Коннексины: Руководство (проиллюстрировать) . Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer Science & Business Media.

Хемпельманн А., Хейлс А. и Сандер Т. (2006). Подтверждающие доказательства ассоциации гена коннексина-36 с ювенильной миоклонической эпилепсией. Epilepsy Res. 71, 223–228. DOI: 10.1016 / j.eplepsyres.2006.06.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Якобсон, Г. М., Восс, Л. Дж., Мелин, С. М., Мейсон, Дж. П., Керсонс, Р. Т., Стейн-Росс, Д. А. и др. (2010). Мыши с нокаутом Connexin36 демонстрируют повышенную чувствительность к поведению, подобному припадкам, вызванному пентилентетразолом. Brain Res. 1360, 198–204. DOI: 10.1016 / j.brainres.2010.09.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джи, Р. Р., Баба, Х., Бреннер, Г. Дж., И Вульф, К. Дж. (1999). Ноцицептивно-специфическая активация ERK в нейронах спинного мозга способствует повышенной чувствительности к боли. Nat. Neurosci. 2, 1114–1119. DOI: 10.1038 / 16040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ковач-Оллер, Т., Дебертин, Г., Балог, М., Ганцер, А., Орбан, Дж., Ньитрай, М., и др. (2017). Экспрессия коннексина 36 в сетчатке млекопитающих: сравнение нескольких видов. Фронт. Клетка. Neurosci. 11:65.DOI: 10.3389 / fncel.2017.00065

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лаура, M.-C., Xóchitl, F.-P., Anne, S., and Alberto, M.-V. (2015). Анализ экспрессии коннексина во время судорог, вызванных 4-аминопиридином в гиппокампе крыс. J. Biomed. Sci. 22:69. DOI: 10.1186 / s12929-015-0176-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Дж. И Барабан С. С. (2019). Свойства сети, выявленные во время многомасштабной кальциевой визуализации судорожной активности у рыбок данио. Eneuro 6: ENEURO.0041-19.2019. DOI: 10.1523 / ENEURO.0041-19.2019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лу, К., и Маттсон, М. П. (2001). Диметилсульфоксид подавляет индуцированные NMDA и AMPA ионные токи и приток кальция и защищает нейроны гиппокампа от эксайтотоксической гибели. Exp. Neurol. 170, 180–185. DOI: 10.1006 / exnr.2001.7686

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маак, Г., и Сегнер, Х. (2003). Морфологическое развитие гонад у рыбок данио. J. Fish Biol. 62, 895–906. DOI: 10.1046 / j.1095-8649.2003.00074.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Манджаррес-Мармолехо, Дж., И Франко-Перес, Дж. (2016). Блокаторы щелевого соединения: обзор их воздействия на индуцированные судороги на животных моделях. Curr. Neuropharmacol. 14, 759–771. DOI: 10.2174 / 1570159X14666160603115942

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марш, А.Дж., Мишель, Дж. К., Адке, А. П., Хекман, Э. Л., и Миллер, А. С. (2017). Асимметрия внутриклеточного каркаса электрических синапсов позвоночных. Curr. Биол. 27, 3561–3567.e4. DOI: 10.1016 / j.cub.2017.10.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мас, К., Таске, Н., Дойч, С., Гиппони, М., Томас, П., Кованис, А. и др. (2004). Ассоциация гена коннексина36 с ювенильной миоклонической эпилепсией. J. Med. Genet . 41: e93.DOI: 10.1136 / jmg.2003.017954

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МакАрдл, Дж. Дж., Селлин, Л. К., Коукли, К. М., Потян, Дж. Г., и Хогнасон, К. (2006). Мефлохин избирательно увеличивает асинхронное высвобождение ацетилхолина из окончаний двигательных нервов. Нейрофармакология 50, 345–353. DOI: 10.1016 / j.neuropharm.2005.09.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Миллер, А.С., Уайтбирч, А.С., Шах, А.Н., Марсден К. К., Гранато М., О’Брайен Дж. И др. (2017). Генетическая основа молекулярной асимметрии электрических синапсов позвоночных. ELife 6: e25364. DOI: 10.7554 / eLife.25364.025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Морган В. Л., Гор Дж. К. и Абу-Халил Б. (2010). Функциональная эпилептическая сеть при эпилепсии левой мезиальной височной доли обнаружена с помощью фМРТ в покое. Epilepsy Res. 88, 168–178. DOI: 10.1016 / j.eplepsyres.2009.10.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мотаги, С., Сайях, М., Бабапур, В., и Махдиан, Р. (2017). Экспрессия коннексина 36 и коннексина 43 в гиппокампе во время эпилептогенеза на пилокарпиновой модели эпилепсии. Иранский Биомед. J. 21, 167–173. DOI: 10.18869 / acadpub.ibj.21.3.167

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нелиг А. (1998). Картирование нейронных сетей, лежащих в основе генерализованных припадков, вызванных увеличением доз пентилентетразола у неполовозрелых и взрослых крыс: иммуногистохимическое исследование c-Fos. евро. J. Neurosci. 10, 2094–2106. DOI: 10.1046 / j.1460-9568.1998.00223.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рандлетт, О., Ви, К. Л., Науман, Э. А., Ннаемека, О., Шоппик, Д., Фицджеральд, Дж. Э. и др. (2015). Картирование активности всего мозга на атласе мозга рыбок данио. Nat. Методы 12, 1039–1046. DOI: 10.1038 / nmeth.3581

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Раш, Дж. Э., Камасава, Н., Дэвидсон, К. Г. В., Ясумура, Т., Переда, А. Э., и Надь, Дж. И. (2012). Состав коннексина в прилегающих гемиплаках щелевого соединения, выявленный с помощью сопоставленной двойной реплики замораживания-перелома, мечения иммунным золотом. J. Membrane Biol. 245, 333–344. DOI: 10.1007 / s00232-012-9454-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Росси А., Контаракис З., Герри К., Нольте Х., Хёльпер С., Крюгер М. и др. (2015). Генетическая компенсация, вызванная вредными мутациями, но не нокдаунами генов. Nature 524, 230–233. DOI: 10.1038 / природа14580

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frize, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., et al. (2012). Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Nat. Методы . 9, 676–682. DOI: 10.1038 / nmeth.2019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шах, А. Н., Дэйви, К. Ф., Уайтбирч, А. К., Миллер А.С. и Моенс К.Б. (2015). Быстрый обратный генетический скрининг с использованием CRISPR на рыбках данио. Nature Methods 12, 535–540. DOI: 10.1038 / nmeth.3360

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шехаб, С., Коффи, П., Дин, П., и Редгрейв, П. (1992). Региональная экспрессия fos-подобной иммунореактивности после судорог, вызванных пентилентетразолом и максимальным электрошоком. Exp. Neurol. 118, 261–274. DOI: 10.1016 / 0014-4886 (92) -Q

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шин, С.И. (2013). Мыши с нокаутом по коннексину-36 имеют повышенный порог киндлинга: роль ингибирования ГАМК. Biochem. Pharmacol. Открытый доступ S: 9. DOI: 10.4172 / 2167-0501.S1-006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зель Г., Гюльденагель М., Бек Х., Тойбнер Б., Трауб О., Гутьеррес Р. и др. (2000). Экспрессия генов коннексина в гиппокампе обработанных каинатом и киндлированных крыс в условиях экспериментальной эпилепсии. Мол. Brain Res. 83, 44–51.DOI: 10.1016 / S0169-328X (00) 00195-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Szyndler, J., Maciejak, P., Turzyńska, D., Sobolewska, A., Taracha, E., Skórzewska, A., et al. (2009). Картирование экспрессии c-Fos в головном мозге крыс во время развития припадков, вызванных пентилентетразолом. Epilepsy Behav. 16, 216–224. DOI: 10.1016 / j.yebeh.2009.07.030

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Таманьини, Ф., Скаллион, С., Браун, Дж. Т., и Рэндалл, А. Д. (2014). Низкие концентрации растворителя диметилсульфоксида изменяют свойства внутренней возбудимости кортикальных и пирамидных клеток гиппокампа. PLoS ONE 9: e92557. DOI: 10.1371 / journal.pone.0092557

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Винче, Р., Петер, М., Сабо, З., Кардос, Дж., Хейя, Л., и Ковач, З. (2019). Коннексин 43 по-разному регулирует эпилептиформную активность в моделях судорожной и несудорожной эпилепсии. Фронт. Клетка. Neurosci. 13: 173. DOI: 10.3389 / fncel.2019.00173

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Восс, Л. Дж., Якобсон, Ю., Сани, Дж. У., Стейн-Росс, А., и Стейн-Росс, М. (2009). Возбуждающие эффекты блокаторов щелевых контактов на судорожную активность коры головного мозга у крыс и мышей. Эпилепсия. DOI: 10.1111 / j.1528-1167.2009.02087.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Восс, Л.Дж., Муцаертс, Н., Сани, Дж. У. (2010). Блокада щелевого соединения Connexin36 неэффективна для снижения активности припадков в срезах неокортекса мышей. Epilepsy Res. Относиться. 2010: 310753. DOI: 10.1155 / 2010/310753

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уилсон, К. А., Хай, С. К., Маккласки, Б. М., Аморес, А., Ян, Ю. Л., Титус, Т. А., и др. (2014). Дикий секс у рыбок данио: потеря естественной половой детерминанты у одомашненных линий. Genetics 198, 1291–1308. DOI: 10.1534 / genetics.114.169284

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

У X., Ван Г., Хао Х. и Фэн Дж. (2017). Динамическая экспрессия белка CX36 при эпилепсии, индуцированной киндлингом каиновой кислоты. Пер. Neurosci. 8, 31–36. DOI: 10.1515 / tnsci-2017-0007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wu, X. L., Ma, D. M., Zhang, W., zhou, J. S., Huo, Y. W., Lu, M., и другие. (2018). Cx36 в гиппокампе мышей во время и после индуцированного пилокарпином эпилептического статуса. Epilepsy Res. 141, 64–72. DOI: 10.1016 / j.eplepsyres.2018.02.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян, Х., Шань, В., Чжу, Ф., Ю, Т., Фань, Дж., Го, А. и др. (2019). Картирование C-Fos и характеристики ЭЭГ нескольких областей мозга мышей в модели мышей с пентилентетразолом. Neurol. Res. 41, 749–761. DOI: 10.1080 / 01616412.2019.1610839

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Яо К., Вандерпул К. Г., Делфинер М., Эдди В., Лукачи А. Г., Сото-Риверос К. и др. (2014). Электрическая синаптическая передача у развивающихся рыбок данио: свойства и молекулярный состав щелевых контактов в центральном слуховом синапсе. J. Neurophysiol. 112, 2102–2113. DOI: 10.1152 / jn.00397.2014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

[CII] Эмиссионные свойства массивной области звездообразования RCW 36 в нитевидном молекулярном облаке

A&A 651, A30 (2021)

[CII] Эмиссионные свойства массивной области звездообразования RCW 36 в нитевидном молекулярном облаке

т.Suzuki 1 , S. Oyabu 1 , SK Ghosh 2 , DK Ojha 2 , H. Kaneda 1 , H. Maeda 1 , T. Nakagawa 3 , JP Ninan 4 , С. Виг 5 , М. Ханаока 1 , Ф. Сайто 1 , С. Фудзивара 1 и Т. Канаяма 1

1 Высшая школа естественных наук Нагойского университета, Фуро-чо, Тикуса-ку, Нагоя, Айти 464-8602, г. Япония
электронная почта: suzuki @ ir.isas.jaxa.jp
2 Институт фундаментальных исследований Тата, Homi Bhabha Road, Колаба, Мумбаи 400005, г. Индия
3 Институт космоса и астронавтики, Японское агентство аэрокосмических исследований 3-1-1 Ёсинодай, Тюо-ку, Сагамихара, Канагава 252-5210, г. Япония
4 Государственный университет Пенсильвании, Университетский парк, Государственный колледж, PA, США
5 Индийский институт космической науки и техники, Валиамала, Тируванантапурам 695 547, г. Индия

Поступило: 19 апрель 2019 г.
Принято: 25 Февраль 2021 г.

Аннотация

Цели. Мы исследуем свойства излучения [CII] 158 мкм RCW 36 в плотном волокнистом облаке.

Методы. [CII] Наблюдения RCW 36, охватывающие площадь ~ 30 ′ × 30 ′, были выполнены с помощью спектрометра Fabry-Pérot на борту 100-сантиметрового баллонного дальнего инфракрасного (ИК) телескопа с угловым разрешением. 90 ′ ′. Используя изображения AKARI и Herschel , мы сравнили пространственное распределение интенсивности [CII] с излучением от крупных зерен и полициклического ароматического углеводорода (ПАУ).

Результаты. Излучение [CII] находится в хорошем пространственном согласии с оболочечными структурами биполярного лепестка, наблюдаемыми на ИК-изображениях, которые проходят в направлении, перпендикулярном направлению холодного плотного волокна. Мы обнаружили, что отношение [CII] –160 мкм для RCW 36 показывает более высокий коэффициент яркости [CII] / 160 мкм, чем для RCW 38, в то время как соотношение [CII] –9 мкм для RCW 36 находится в хорошем состоянии. Согласие с этим для RCW 38.

Выводы. Посредством анализа спектрального разложения на попиксельной основе с использованием ИК-изображений, излучение [CII] пространственно хорошо коррелировано с выбросами ПАУ и холодной пыли.Это означает, что наблюдаемое излучение [CII] в основном исходит из областей фотодиссоциации. Кроме того, соотношение L [CII] L FIR показывает большие различия (10 −2 −10 −3 ) по сравнению с L [CII] / L PAH соотношение. Принимая во внимание наблюдаемую тесную корреляцию между L [CII] L FIR и оптической толщиной при λ = 160 мкм, большая разница в L [CII] L FIR можно просто объяснить геометрическим эффектом, то есть L FIR имеет вклад от всего столба пылевого облака вдоль луча зрения, а L [CII] имеет вклады от поверхностей облаков, освещенных далеким УФ-излучением.Основываясь на картине геометрического эффекта, повышенное отношение яркости [CII] / 160 мкм объясняется различием газовых структур, в которых образуются массивные звезды: нитевидные (RCW 36) и комковатые (RCW 38) молекулярные облака; таким образом, предполагая, что RCW 36 преобладает облачными поверхностями, освещенными далеким УФ-излучением, по сравнению с RCW 38.

Ключевые слова: пыль, поглощение / ISM: линии и полосы / области HII / ISM: отдельные объекты: RCW36

Государственных законов о медицинской марихуане

Содержание

Контакт

ОБНОВЛЕНИЕ ПО МЕДИЦИНСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ: по состоянию на 18 мая 2021 года в 36 штатах и ​​четырех территориях разрешено медицинское использование продуктов каннабиса.
В ноябре 2020 года избиратели в Миссисипи приняли инициативу голосования, разрешающую использование в медицинских целях, но она была отменена верховным судом штата 14 мая 2021 года и не учитывается в общих итогах штата на этой странице. Пожалуйста, см. Таблицу 1 для получения дополнительной информации.

ОБНОВЛЕНИЕ ДЛЯ НЕМЕДИЦИНСКИХ / ВЗРОСЛЫХ: по состоянию на 22 июня 2021 года 18 штатов, две территории и округ Колумбия приняли законодательство, регулирующее использование каннабиса в немедицинских целях.

  • Избиратели в Аризоне, Монтане, Нью-Джерси и Южной Дакоте одобрили меры по регулированию каннабиса для немедицинского использования.
  • 8 февраля 2021 года окружной судья Южной Дакоты Кристина Клингер постановила, что эта мера является неконституционной. Решение обжаловано по состоянию на 31 марта 2021 года.
  • Губернатор Нью-Джерси подписал вводящий в действие закон 1 марта 2021 года.
  • Законодательный орган и губернатор Нью-Йорка приняли закон AB 1248 / SB 854 31 марта 2021 года.
  • Генеральная ассамблея Вирджинии приняла закон 27 февраля и одобрила поправки губернатора 7 апреля 2021 года.
  • Законодательный орган штата Нью-Мексико принял закон 31 марта, а губернатор подписал его 12 апреля 2021 года.
  • Генеральная ассамблея Коннектикута приняла SB 1201 17 июня, а губернатор подписал его 22 июня 2021 года.
  • В результате этих действий количество штатов, в которых регулируется немедицинский (употребление взрослыми) каннабиса, достигло 18, плюс две территории и округ Колумбия (округ Колумбия не регулирует продажу немедицинских товаров).
  • В эту сумму НЕ входит пересмотренная судом штата Южная Дакота мера, апелляция по которой находится на рассмотрении.

Дополнительную информацию см. В таблице 1 ниже.


В общей сложности 36 штатов, округ Колумбия, Гуам, Пуэрто-Рико и Виргинские острова США одобрили комплексные общедоступные программы медицинской марихуаны / каннабиса.
Дополнительные сведения см. В таблице 1 ниже.

Утвержденные меры в 11 штатах позволяют использовать продукты с низким содержанием ТГК и высоким содержанием каннабидиола (CBD) по медицинским показаниям в ограниченных ситуациях или в качестве правовой защиты. (дополнительную информацию см. В Таблице 2 ниже) .Программы с низким содержанием ТГК не считаются комплексными медицинскими программами каннабиса. NCSL использует критерии, аналогичные критериям других организаций, отслеживающих эту проблему, чтобы определить, является ли программа «всеобъемлющей»:

  1. Защита от уголовного наказания за использование конопли в медицинских целях.
  2. Доступ к каннабису путем выращивания в домашних условиях, в диспансерах или какой-либо другой системе, которая может быть внедрена.
  3. Он позволяет использовать различные штаммы или продукты, в том числе с более чем «низким содержанием ТГК».»
  4. Он позволяет курить или испарять какие-либо продукты каннабиса, растительный материал или экстракт.
  5. Это не ограниченная пробная программа. (В Небраске есть пробная программа, закрытая для публики.)

14 апреля 2021 г .: Отмененная в Южной Дакоте мера, касающаяся немедицинских (для взрослых) избирательных бюллетеней, в настоящее время находится на рассмотрении 11 марта 2021 г.

* = 2020 меры в Миссисипи для медицинского использования и Южной Дакоты для немедицинского использования были отменены в 2021 году.
Дополнительные сведения см. В таблице 1 ниже.

Применение каннабиса в медицине

В ответ на предложение 215 Калифорнии Институт медицины выпустил отчет, в котором изучалось возможное терапевтическое использование каннабиса. В отчете говорится, что: «Научные данные указывают на потенциальную терапевтическую ценность каннабиноидных препаратов, в первую очередь ТГК, для облегчения боли, контроля тошноты и рвоты и стимуляции аппетита; куренная марихуана, однако, представляет собой грубую систему доставки ТГК, которая также доставляет вредные вещества. .Психологические эффекты каннабиноидов, такие как снижение тревожности, седативный эффект и эйфория, могут влиять на их потенциальную терапевтическую ценность. Эти эффекты потенциально нежелательны для определенных пациентов и ситуаций и полезны для других. Кроме того, психологические эффекты могут затруднить интерпретацию других аспектов действия препарата ».

Дальнейшие исследования показали, что марихуана эффективна для облегчения некоторых симптомов ВИЧ / СПИДа, рака, глаукомы и рассеянного склероза. 1

В начале 2017 года Национальные академии наук, инженерии и медицины выпустили отчет, основанный на обзоре более 10 000 научных выдержек из исследований здоровья каннабиса. Они также сделали 100 выводов, касающихся здоровья, и предложили способы улучшить исследования каннабиса.

Государственная и федеральная перспектива

На федеральном уровне каннабис по-прежнему классифицируется как вещество Списка I в соответствии с Законом о контролируемых веществах, где вещества Списка I считаются имеющими высокий потенциал зависимости и неприемлемым для медицинского использования, что делает распространение каннабиса федеральным преступлением.В октябре 2009 года администрация Обамы направила федеральным прокурорам служебную записку, призывающую их не преследовать лиц, распространяющих каннабис в медицинских целях, в соответствии с законодательством штата.

В конце августа 2013 года Министерство юстиции США объявило об обновлении своей политики по борьбе с марихуаной. В заявлении говорится, что, хотя каннабис остается незаконным на федеральном уровне, Министерство юстиции США ожидает, что такие штаты, как Колорадо и Вашингтон, предпримут «сильные меры по обеспечению соблюдения на уровне штатов … и пока отложат право оспаривать свои законы о легализации».«Департамент также оставляет за собой право бросить вызов штатам в любое время, когда они сочтут это необходимым.

Совсем недавно, в январе 2018 года, бывшие сессии генерального прокурора выпустили Меморандум о применении марихуаны, который отменил Меморандум Коула и позволяет федеральным прокурорам решать, как расставить приоритеты в применении федеральных законов о каннабисе. В частности, меморандум о заседаниях требует от прокуроров США «взвесить все соответствующие соображения, включая приоритеты федеральных правоохранительных органов, установленные Генеральным прокурором, серьезность преступления, сдерживающий эффект уголовного преследования и совокупное влияние конкретных преступлений на общество.»Текст служебной записки можно найти здесь: https://www.justice.gov/opa/pr/justice-department-issues-memo-marijuana-enforcement

Политику

NCSL в отношении законов штата о каннабисе можно найти в разделе «Дополнительные ресурсы» ниже.

Избиратели в Аризоне и округе Колумбия выступили с инициативами, разрешающими использование в медицинских целях, но они были отменены. В 1998 году избиратели округа Колумбия приняли Инициативу 59. Однако Конгресс не позволил этой инициативе стать законом. В 2009 году Конгресс отменил свое предыдущее решение, позволив инициативе стать законом.Совет округа Колумбия временно приостановил Инициативу 59 и единогласно одобрил поправки к закону.

Перед принятием Предложения 203 в 2010 году избиратели Аризоны первоначально выступили с инициативой голосования в 1996 году. Однако в инициативе говорилось, что врачам будет разрешено выписывать «рецепт» на каннабис. Поскольку каннабис входит в Список I, федеральный закон запрещает его выписывать по рецепту, что делает инициативу недействительной. Медицинские «рецепты» каннабиса чаще называют «рекомендациями» или «направлениями» из-за федерального запрета на рецепты.

Государства, в которых действуют законы о медицинской каннабисе, обычно имеют какую-либо форму реестра пациентов, которая может обеспечить некоторую защиту от ареста за хранение определенного количества продуктов для личного медицинского использования.

Некоторые из наиболее распространенных вопросов политики в отношении медицинского каннабиса включают в себя то, как регулировать его рекомендацию, выдачу и регистрацию одобренных пациентов. Некоторые мелкие производители каннабиса или их часто называют «сиделками» и могут выращивать определенное количество растений на одного пациента.Этот вопрос также может регулироваться на местном уровне в дополнение к любым государственным постановлениям.

* Ссылки и ресурсы предоставлены только в информационных целях. NCSL не поддерживает мнения, выраженные в каких-либо статьях, на которые есть ссылки на этой странице.

Закон
Таблица 2. Законы о продуктах каннабиса с ограниченным доступом (каннабидиол с низким содержанием ТГК и высоким содержанием КБД)
Государственный Название программы и установленный язык (год) Реестр пациентов или удостоверения личности Диспансеры или источник продукции Определяет условия Распознает пациентов из других штатов Определение разрешенных продуктов Допускает правовую защиту Разрешено для несовершеннолетних

Алабама

(SB46 от 2021 года создал новый закон о медицинском каннабисе, вступивший в силу 17 мая 2021 года и перечисленный в таблице 1.)

SB 174 «Закон Карли» (Закон 2014-277) позволяет Университету Алабамы в Бирмингеме проводить исследования эффективности с использованием продуктов с низким содержанием ТГК для лечения судорожных расстройств на срок до 5 лет. HB 61 (2016) Закон Лени позволяет большему количеству врачей направлять пациентов для использования КБД при других заболеваниях. Обеспечивает юридическую защиту владения и / или использования масла CBD. Не создает метод производства в штате. Да, изнурительные эпилептические состояния, опасные для жизни припадки, синдром истощения, хроническая боль, тошнота, мышечные спазмы, любые другие тяжелые состояния, не поддающиеся лечению традиционной медициной.

Экстракты с низким содержанием ТГК = менее 3% ТГК Есть Есть
Флорида
(НОВАЯ комплексная программа, утвержденная в 2016 г., включена в таблицу выше)
Закон о сострадании к медицинскому каннабису от 2014 года CS для SB 1030 (2014) Информация о лечении пациентов и его результатах будут собираться и использоваться для исследований трудноизлечимой детской эпилепсии Есть Да, 5 зарегистрированных питомников по всему штату с разбивкой по регионам, которые работают во Флориде не менее 30 лет. Да, рак, заболевание или судорожные расстройства, которые хронически вызывают симптомы, которые можно облегчить с помощью продуктов с низким содержанием ТГК Каннабис с низким содержанием ТГК = менее 0,8% ТГК и более 10% КБД по весу Да, с одобрения 2 врачей
Грузия HB 1 (2015) (подпись губернатора 16.04.15) Есть позволяет Университетской системе Джорджии разрабатывать обширную программу клинических исследований масла ТГК, которая соответствует требованиям испытаний FDA. Да, рак в последней стадии, БАС, РС, судорожные расстройства, болезнь Крона, митохондриальная болезнь, болезнь Паркинсона, серповидно-клеточная анемия Масла каннабиса с низким содержанием ТГК = менее 5% ТГК и как минимум равным количеством CDB. Есть Есть

Айдахо — ПРОВЕРЕНО ГУБЕРНАТОРОМ

SB 1146 (ПРОВЕРЕНО губернатором 16.04.15) Не определяет. Владелец имеет или является родителем или опекуном лица, страдающего раком, боковым амиотрофическим склерозом, судорожными расстройствами, рассеянным склерозом, болезнью Крона, митохондриальной болезнью, фибромиалгией, болезнью Паркинсона или серповидно-клеточной анемией; Состоит из не более трех десятых процента (0,3%) тетрагидроканнабидиола по весу; состоит из по меньшей мере в пятнадцать (15) раз большего количества каннабидиола, чем тетрагидроканнабидиола по весу; и не содержит других психоактивных веществ. Есть Есть
Индиана HB 1148 (2017) Есть Не определяет. Лечение устойчивой эпилепсии. Не менее 5 процентов CBD по весу. Не более 0,3% ТГК по весу. Есть Есть
Айова SF 2360, Закон о медицинском каннабидиоле от 2014 г. (вступил в силу 01.07.14, отменен в 2017 г. и заменен)
HF 524 от 2017 г. теперь раздел 124E
Есть Есть Есть Да, только для хранения или использования, а не для покупки CBD в Айове. Менее 3 процентов THC Есть Есть
Кентукки SB 124 (2014) Закон Клары Мадлен Гиллиам Освобождает каннабидиол от определения марихуаны и позволяет применять его в государственных университетах или медицинских школах в Кентукки для клинических испытаний или программы расширенного доступа, одобренной FDA. университетов в Кентукки с медицинскими школами, которые могут пройти исследования.Не позволяет производить продукт CBD на территории штата. Неизлечимые судорожные расстройства Нет, только каннабидиол.
Миссисипи
(Отмененная поправка 65 от 2020 г. включена в таблицу выше)
HB 1231 «Закон Харпер Грейс» 2014 Все предоставлено Национальным центром исследований природных продуктов при Univ.Миссисипи и распределяется Департаментом фармацевтических услуг Univ. Медицинского центра Миссисипи Да, изнуряющее эпилептическое состояние или связанное с ним заболевание «Масло CBD» — обработанный экстракт растения каннабиса, масло или смола, которые содержат более 15% каннабидиола, или разведение смолы, которое содержит не менее 50 миллиграммов каннабидиола (CBD) на миллилитр, но не более половины один процент (0,5%) тетрагидроканнабинола (THC) Да, если уполномоченный пациент или опекун Есть
Миссури (НОВАЯ комплексная программа, утвержденная в 2018 г., включена в таблицу выше)

HB 2238 (2014) Есть Да, создает центры по уходу за маслом каннабидиола и лаборатории / лаборатории по выращиванию и производству. Да, трудноизлечимая эпилепсия, не поддающаяся лечению тремя или более вариантами лечения. «Экстракты конопли» равные или менее 0,3% THC и не менее 5% CBD по весу. Есть Есть
Северная Каролина HB 1220 (2014) Закон об альтернативном лечении эпилепсии — пилотное исследование HB 766 (2015) отменяет обозначение пилотного исследования Есть Университетские исследования с использованием регистрационной карты экстракта конопли, выданной DHHS штата или полученной из другой юрисдикции, которая позволяет вывозить продукты из штата. Да, трудноизлечимая эпилепсия «Экстракты конопли» с содержанием тетрагидроканнабинола (ТГК) менее девяти десятых процента (0,9%) по весу. Состоит по крайней мере из пяти процентов (5%) каннабидиола по весу.
Не содержит других психоактивных веществ.
Есть Есть
Оклахома (НОВАЯ комплексная медицинская программа, утвержденная в 2018 г. и указанная выше) HB 2154 (2015) Есть Производство на территории штата не разрешено, поэтому продукты придется привозить.Любая формальная система распределения потребует утверждения на федеральном уровне. Люди младше 18 лет (несовершеннолетние) Несовершеннолетние с синдромом Леннокса-Гасто, синдромом Драве или другой тяжелой формой эпилепсии, которая не лечится с помощью традиционных методов лечения Препарат каннабиса с содержанием ТГК не более 0,3% в жидкой форме. Есть Да, разрешено только несовершеннолетним
Южная Каролина SB 1035 (2014) Закон о медицинском лечении каннабисом — Закон Джулиана Есть Необходимо использовать продукт CBD из утвержденного источника; и (2) одобрено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для использования для лечения состояния, указанного в заявке на исследуемый новый лекарственный препарат.- Главный исследователь и любой субисследователь могут получать каннабидиол непосредственно из утвержденного источника или авторизованного дистрибьютора для утвержденного источника для использования в клинических испытаниях с расширенным доступом. Некоторые истолковали закон, чтобы позволить пациентам и лицам, осуществляющим уход, производить свои собственные продукты. Синдром Леннокса-Гасто, синдром Драве, также известный как тяжелая миоклоническая эпилепсия младенчества, или любая другая форма рефрактерной эпилепсии, которая не поддается адекватному лечению традиционными медицинскими методами лечения. Каннабидиол или производное марихуаны, которое содержит 0,9% THC и более 15% CBD, или не менее 98% каннабидиола (CBD) и не более 0,90% тетрагидроканнабинола (THC) по объему, которые были извлечены из марихуаны или синтезированы в лаборатории Есть Есть
Теннесси

SB 2531 (2014)
Создает четырехлетнее исследование каннабиса с высоким CBD / низким THC в Tenn. Tech Univ.

Исследователям необходимо отслеживать информацию о пациентах и ​​результаты
Только продукты, произведенные Технологическим университетом Теннесси.
Пациенты могут иметь масла с низким содержанием ТГК только в том случае, если они приобретены «на законных основаниях в Соединенных Штатах и ​​за пределами Теннесси» в предполагаемом медицинском штате каннабис, однако в большинстве штатов продукты не разрешается вывозить из штата.

Да, трудноизлечимые приступы.

«Масло каннабиса» с менее чем.9% THC в рамках клинического исследования.

Есть Есть
HB 197 (2015) Позволяет защищать право собственности на продукт при условии, что он был получен на законных основаниях в США или другом штате медицинского каннабиса. Да, трудноизлечимые приступы. То же, что и выше. Есть Есть
Техас

SB 339 (2015)
Закон штата Техас о сострадательном использовании

HB 3703 (2019)

Есть Да, лицензировано Департаментом общественной безопасности. Да, трудноизлечимая эпилепсия, неизлечимое нейродегенеративное заболевание, неизлечимый рак, рассеянный склероз, спастичность, БАС, аутизм.

«Каннабис с низким содержанием ТГК», не более 0,5% по весу тетрагидроканнабинолов. Есть Есть
Юта (НОВАЯ комплексная программа, утвержденная в 2018 г., включена в таблицу выше) HB 105 (2014) Закон о регистрации экстракта конопли Есть Не совсем понятно, однако это может позволить высшим учебным заведениям выращивать или выращивать промышленную коноплю. Да, трудноизлечимая эпилепсия, не поддающаяся лечению тремя или более вариантами лечения, предложенными неврологом. «Экстракты конопли» с содержанием ТГК менее 0,3% по весу и не менее 15% по весу CBD и не содержат других психоактивных веществ Есть Есть

Вирджиния
(НОВАЯ комплексная медицинская программа, утвержденная в 2020 г. и указанная выше)

HB 1445 — больше не действует Нет средств для приобретения продуктов каннабиса на территории штата. Неизлечимая эпилепсия Масла каннабиса, содержащие не менее 15% CBD или THC-A и не более 5% THC. Да

Есть
Висконсин AB 726 (Закон № 267 от 2013 г.) Врачи и аптеки, получившие разрешение FDA на исследование лекарств, могут отпускать каннабидиол. Квалифицированным пациентам также будет разрешен доступ к CBD из медицинского диспансера каннабиса за пределами штата, который позволяет пациентам за пределами штата использовать свои диспансеры, а также вывозить продукты из штата.Механизм производства / производства на территории штата не предусмотрен. Судорожные расстройства Исключение из определения ТГК, запрещенного законодательством штата, допускает хранение «каннабидиола в форме без психоактивного эффекта». Уровни THC или CBD не определены. Есть
Вайоминг
HB 32 (2015)
Медицинское использование экстрактов конопли под надзором. Действует 01.07.2015
Есть Не определен метод производства или закупки на территории штата. Эпилепсия или судорожные расстройства, трудно поддающиеся лечению «Экстракты конопли» с содержанием ТГК менее 0,3% и не менее 5% КБД по весу. Есть Есть

* Ссылки и ресурсы предоставлены только в информационных целях. NCSL не поддерживает мнения, выраженные в каких-либо статьях, на которые есть ссылки на этой странице.

Дополнительные ресурсы

  • Страница NCSL, посвященная каннабису и законам о занятости.
  • NCSL на странице Marijuana Deep Dive, посвященной законам о марихуане и каннабисе в области уголовного правосудия, здравоохранения и других ресурсов.
  • Письмо NCSL FY 2018, которое Комитет LCJPS направил в Хилл против приостановления финансирования для штата с законами о медицинской марихуане:

    NCSL FY 2018 Письмо о поддержке ассигнований CJS. (16 мая, 2017)

  • Политика штата в отношении марихуаны освещена в 4-м эпизоде ​​подкаста NCSL «Наши американские Штаты».
    Вы можете найти его на нашем веб-сайте или подписаться на подкаст в iTunes, Google Play или в своем любимом приложении для подкастов.

  • Сравнение программ
  • Финансы / налоговая информация
  • Правоохранительные органы / информация о преступлениях
  • Исследования и отчеты о медицинской марихуане
    • Воздействие каннабиса и каннабиноидов на здоровье: современное состояние данных и рекомендации для исследований, 2017 г.
    • «Марихуана и медицина: оценка научной базы», ​​Институт медицины, 1999 г.
    • «Разоблачение мифа о курении медицинской марихуаны», Управление по борьбе с наркотиками США
    • Заявление о политической позиции Института исследований в области лечения (TRI) в отношении медицинской марихуаны
    • ProCon.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *