первый тест-драйв Lada Kalina Cross — Автоновости Череповца

«… Мы внесли свыше 900 платформенных изменений, и теперь нам не очень стыдно за наши автомобили… Ой, точнее, нам вообще не стыдно за наши автомобили! А сейчас выпустим Vesta и Xray — так вообще задрав нос ходить будем», — Олег Груненков, директор проектов Kalina и Granta, красноречив и информативен. Что ж, Олег Евгеньевич. После двух дней в степи с новой Kalina Cross мне тоже не очень стыдно за АвтоВАЗ. А выпустите Xray и Vesta — так вообще гордиться буду.

Уже начинаю. Например — скоростью выхода новых моделей и модификаций. Я столько инфоповодов из Тольятти за последние годы не припомню. А уж скорость реакции так и вовсе неожиданная. Kalina Cross родилась всего за 12 недель — именно столько времени прошло с момента инвестиций в проект и до той минуты, когда готовый автомобиль, пройдя все сертификационные процедуры и испытания, встал на конвейер.

На ВАЗе говорят, что такой продукт для них во многом эксперимент.

Они хотят заскочить в достаточно пустую нишу городских кроссоверов, где в этом ценовом диапазоне есть только китайские Geely MK Cross и Chery Indis, о которых инженеры и испытатели из Тольятти говорят преимущественно сквозь зубы. Вдумчивый читатель воскликнет: «А как же Renault Sandero Stepway?». Вот и мы воскликнули. Но «Степвей» — это другая ценовая ниша, 500000+. «Калину Кросс» же на старте выставили за 409 000 и повышать не собираются. Ну, и Sandero все-таки другой.

Например, Kalina Cross — универсал. И только: целесообразность выпуска хетчбэка Cross пока в стадии обсуждения. Создатели считают, что этот автомобиль заинтересует людей, которые любят и хотят ездить далеко от города и нуждаются в соответствующем пространстве для багажа. А в хетчбэке типа Sandero Stepway много не увезешь — это сугубо городская машина, но с претензией.

Интерактив: внешние отличия Kalina Cross от универсала «просто Kalina»

Еще с момента первого показа автомобиля больше всего вопросов вызывал интерьер: уж больно вычурны оранжевые вставки в салоне. Знаю, что наши дилеры после предпоказа автомобиля минувшим летом просили их убрать — несолидно смотрятся. Но на АвтоВАЗе решили оставить. По той же самой очевидной причине: вычурно.

«Нам хочется, чтобы о нашей машине говорили, чтобы она бросалась в глаза в салоне и чтобы в автосалоны людей приводила», — говорит мне Олег Груненков. И добавляет, что дилеры из разных регионов действительно давали неоднозначную обратную связь по внешнему виду салона: кто-то даже предлагал делать цвет вставок разным в зависимости от региона продажи. Так, Татарстан бы получил интерьер с зелеными пятнами, а северные регионы — с серебристыми. Но на старте решили оставить как есть.

Интерактив: Lada Kalina Cross изнутри

На что еще ушли 12 недель разработки? Это только кажется, что можно приподнять машину проставками в гараже — всего-то и дел. Ан нет: изменение клиренса потребовало перемен в настройках подвески и ее конструкции. Здесь газонаполненные амортизаторы и иные пружины. Ход на сжатие увеличили, на отбой — наоборот, уменьшили. Все для лучшей геометрической проходимости и пущей энергоемкости на крупных ухабах. Чуть возросла угловая жесткость подвески — чтобы гасить боковые крены при возросшем центре тяжести.

Это — технический ликбез. А как оно работает? Не всегда и не во всем так, как хотелось бы. Для проверки всего и вся у меня было два дня и бескрайняя казахская степь со всеми возможными типами дорог, какие только бывают.

Ровный асфальт

Реально неглубокие крены. Машина ровно идет, почти не гудя трансмиссией и мотором. Мотора в 87 сил вполне хватает для бодрых светофорных стартов, а вот тормоза — дьявольски тяжелые. Эту проблему я отмечаю еще со времен первых экземпляров «Гранты» и обновленной «Калины». Инженеры уверяли меня, что в конструкцию тормозов внесена масса изменений (новые колодки, иной усилитель), но…

Педаль все такая же неинформативная, в первой фазе хода почти ничего не происходит. Чтобы замедлиться как следует, надо основательно утопить среднюю педаль. Получается очень такой неплохой тренажер для ноги. На загородных трассах с осадкой машины проблем не возникает, но в городском режиме — с частыми циклами замедления и разгона — приходится изрядно попотеть.

Асфальт разной степени убитости

Да, я понимаю, что это неизбежный компромисс: увеличивая ход сжатия, не получится не уменьшить ход отбоя. Что из этого вытекает: Kalina Cross дотошно считывает весь профиль дороги, звонко лязгая подвеской на всех выступающих неровностях, какие встретит на своем пути. «Дын-дын-дын-дын» — это Калина едет по «лунной дорожке» какой-то богом забытой и годами нелатаной трассы.

	Аналогии с семейством «Логан»/«Сандеро» неуместны: у них терпимость к мелким дефектам полотна более сильная.

Зато на высоких скоростях видна вот эта работа над угловой жесткостью подвески: крены даже в затяжных поворотах минимальны, а налетающие порывы бокового ветра не срывают машину с курса. Ни на миллиметр.

Еще по-хорошему впечатлил вазовский 8-клапанник. А другого мотора пока нет, но не стоит печалиться. При загрузке «три мужика + полный багажник тяжелой аппаратуры» мы выходили на обгоны без всякой опаски.

Наш походный набор из пяти рюкзаков, двух штативов, одного чемодана, кофра и ящика с дорожным скарбом в багажник влез без проблем. Для универсала всего-то лишь В-класса кладовка достойная.

Если сравнивать с другими хетчбэками В-класса — например, «Рио»/«Солярисом», то возможности 87-сильного мотора «Калины» вполне на уровне возможностей их 107-сильных движков. У «Кросса» вполне достойный крутящий момент и адекватные, своевременные отклики на акселератор. Так что крутим до 4500–5000 оборотов — и нет никаких проблем при обходе фур и других тошнотов.

Неприятно огорчил расход топлива: при непрерывном трассовом пробеге расход не падал ниже 7,5 литров на сотню. Это если вообще экономить. А так — 7,8 л/100 км — норма. Лить, по паспорту, не хуже АИ-95. Чем мы и занимались.

Стала меньше гудеть трансмиссия. Нет, если бросить газ резко, когда на тахометре свыше 3000 оборотов, шестеренки зайдутся в конвульсиях и скрежете. Но при линейном ускорении и на переходах вниз гула стало гораздо меньше, чем было. Шум от коробки чуть режет уши после 5 000 оборотов, но это не те завывания, которые были на «Грантах» и «Калинах» первых лет выпуска.

В остальном шумоизоляция на троечку, хотя от сверхбюджетной машины большего и не требуется: не гремит полка, еле слышно гудят покрышки, подвывает моторный отсек, а после 100 км/ч еще и ветер со стороны крыши.

Управляется Kalina Cross надежно, хоть и без изысков: чувствительность руля слабенькая, при отклонении на малые градусы колеса практически не поворачиваются, зато при отклонении на более весомые углы реакция машины точная, а сама она дает вполне явную обратную связь от колес. Если не ждать от нее точности и скорости реакции как у BMW, то — годится!

Пересекая местность

А как там, собственно, Cross? Ведь Kalina с таким именем под легкое условное бездорожье и затачивалась. Вазовцы, кстати, в определении аккуратны и деликатны: называют машину даже не «универсалом повышенной проходимости», а «универсалом с повышенной геометрической проходимостью». И тут не врут ни словом: угол въезда по сравнению с простым универсалом вырос на 1,8 градуса, съезда — на 2,4 градуса.

Клиренсу в разгруженном состоянии позавидуют иные кроссоверы — 20,8 см, равно как и клиренсу под полной загрузкой — 18,3 см. За счет такой приподнятости серьезно поменялся радиус проходимости. Иными словами — то, что Kalina Cross может пропустить под брюхом, под стандартным универсалом бы не пролезло.

В плане геометрии нам Kalina Cross более чем понравилась: условные «сугробы во дворе» и крупные ухабы по пути на дачу преодолеет легко и непринужденно. Пытаюсь вспомнить хоть один случай касания днищем или передней губой земли — и не могу. А ведь мы на ней прыгали по трамплинам в степи и штурмовали косогоры. Тут-то и помогает тот самый увеличенный ход сжатия подвески: даже при попадании в крупные ямы или при приземлении на нос после небольшого трамплина наш «Кросс» до земли не достает.

Случалось и вывешивать по диагонали, куда уж без этого! Во время легендарных «Братюнь, проедь еще разок вон там для пары дублей» чего только не случается. Так, например:

Ничего страшного: поболтали колесами в воздухе несколько секунд, покачались туда-сюда — да и спрыгнули. Даже на таком сложносочиненном рельефе ни задом не задели, ни передним бампером не чиркнулись. Так что про «повышенную геометрическую» проходимость вазовцы не наврали — она тут есть, и для пересеченной местности сгодится.

Что до полного привода, то идея воткнуть его в «Калину» витает в тольяттинском воздухе еще со времен первого поколения модели. Экономическая целесообразность такого проекта просчитывается до сих пор, ибо чудес не бывает: за 400 с небольшим тысяч полноприводных машин нет, а если есть — это другие деньги. По всей видимости, не стоит ждать и полноприводный Xray, который изначально позиционируется как «городской кроссовер». А вот нечто побольше, да на базе «Дастера», как я понял из бесед с инженерами, — будет. Но — позже. Пока важно запустить «Калину Кросс» и посмотреть на реакцию публики.

Что до реакции журналистов, то нам машина приглянулась. Да, не идеальная, местами шумноватая, в большинстве случаев — тряская. Но как интересный вариант для молодой семьи, ведущей активный образ жизни, автомобиль вполне интересен. Меня только смущает всего одна подушка безопасности в комплекте. Говорят, вторую не стали устанавливать из-за желания уложиться в жесткий бюджет. Как по мне, то безопасность — явно не то, на чем стоит экономить.

За кадром

Как бы в продолжение моих сомнений по части безопасности коллеги устроили на дне пересохшего озера импровизированный краш-тест: взяли да и положили автомобиль на крышу. На удивление, все живы, здоровы, а сам автомобиль после кувырка, считай, вообще не пострадал: чуть помялась верхушка, да отвалилось зеркало.

В это же самое время другая группа решила проверить, сможет ли моноприводный универсал сначала зарыться, а потом самостоятельно выехать из песка. Внезапно — не смог! Пришлось откапывать и тянуть.

На этом фоне наши с товарищами приключения с распоротым в боковых скольжениях колесом смотрятся детскими шалостями:

Из этого можно сделать три вывода последовательно:

1. Нельзя на полном ходу при полностью вывернутых колесах давить на тормоз — полетишь кубарем через крышу;
2. Не надо на моноприводном легковом автомобиле соваться в глубокий песок — зароешься и не вылезешь.

Третье… Ну, колесо распороли. С кем не бывает? Особенно ради красивого-то кадра!

Что-нибудь восторженное хочется сказать про Астану, которая в ночи похожа на Абу-Даби где-нибудь в районе Корниш-роуд. Но нравы местной полиции и чудовищно утомительные перегоны между степями и городами запомнились больше. Особенно стражи порядка, которые, по-моему, вобрали в себя все самое плохое, что приписывают дорожной полиции: жлобство, жадность, наглость и цинизм. Мой совет: соберетесь в Казахстан на колесах — штудируйте местный КоАП. Шить лишение уже при превышении скорости на 10 км/ч тут умеют мастерски, а вот на козыряние знанием законов реагируют трусливо и моментально.

И ведь даже на сто раз зная про это, едут в те степи и особенно к озерам массово. Одни — за уникальной рыбалкой, другие — кататься на кайте, ибо дует.

С этой точки зрения берега озера Балхаш — одного из крупнейших озер в мире — идеальны: о вкусе местной рыбы легенды ходят за тысячи верст отсюда, а дует так, что даже в юрте не спасешься.

Главное — помнить, что проезд к этим местам преимущественно платный: приготовьте заранее купюры для дани полицаям.

Lada Kalina Cross: выводы и ТТХ

Нам нравится	возросшая геометрическая проходимость, проделанная работа над ошибками, энергоемкая на крупных ухабах и ямах подвеска, эргономика, сочетание цены и качества
Нам не нравится	неудачное кресло водителя, дряблая на мелких неровностях подвеска, тяжеленные тормоза

Технические характеристики Lada Kalina Cross с мотором 1,6 л и MT
Двигатель	Бензиновый
Число и расположение цилиндров	4 в ряд
Рабочий объем, см³	1 596
Макс. мощность, л.с./об./мин.	87/5100
Макс. крутящий момент, Нм/об./мин.	140/3800
Привод	Передний
Коробка передач	5-ступенчатая механическая
Передняя подвеска	независимая, пружинная
Задняя подвеска	полузависимая, пружинная
Передние тормоза	Дисковые, вентилируемые
Задние тормоза	барабанные
Максимальная скорость, км/ч	165
Время разгона 0–100 км/ч, с.	12,2
Снаряженная масса, кг	1 160
Длина/ширина/высота	4104 / 1700 / 1560
Клиренс	208
Шины	195/55 R15
Объем багажника, куб.дм	355
Расход топлива, л/100 км
городской цикл	н.д.
загородный цикл	н.д.
смешанный цикл	7,2
Емкость топливного бака, л	50

Кирилл Зайцев Алматы — Астана, сентябрь 2014 г. Фото автора, Андрея Иванова и АвтоВАЗ

Обзор авто Volvo V90 Cross Country

Стильный универсал Volvo V90 Cross Country

Улучшенная версия модели с повышенной проходимостью впервые была представлена в 2016 году в автосалоне в Лос-Анджелесе. Плавные линии кузова подчеркивают динамические свойства. Производительность и брутальность выражены через массивную радиаторную решетку с фирменным логотипом. Задние габаритные фонари выполнены в форме молний. На отечественном авторынке представлены комплектации Pro, Plus и Ocean Race, которые имеют вариации с турбодвигателями на дизеле или на бензине. Двухлитровый топливный бак обеспечивает мощность 190-249 л. с. Автоматическая трансмиссия в сочетании с полным приводом помогает добиться хорошего сцепления, что предотвращает заносы на мокром асфальте или ледяной корке. Машина может развивать скорость до 210 км/ч, а разгон до «сотни» с места осуществляется за 8,9 с.

Отличительные особенности Вольво V90 Cross Country

В конструкции модели особое внимание уделено безопасности. Подушки и система ремней минимизируют риски во время ДТП как для водителя, так и для пассажира. Владельцы данного автомобиля отмечают:

• небольшое потребление топлива как в городе, так и по трассе (4,5-6 л), что позволяет путешествовать на большие расстояния без дополнительной дозаправки;
• вместительный багажник на 723 л дает возможность без труда разместить коляску, габаритный инвентарь или другой груз;
• качественную шумоизоляцию салона, которая минимизирует гул мотора и посторонние шумы оживленной улицы.

На платформе Autospot размещены лучшие предложения от проверенных дилеров вашего региона. На все комплектации действует специальная скидка до 12% от сервиса. Продавцы предлагают специальные условия со сниженной ставкой по кредиту и гарантийным обслуживанием в профессиональных сервисных центрах.

Информация о модели Volvo V90 Cross Country 2016 – 2020, I: технические характеристики, отзывы и фотографии авто. 5 и более обзоров на автомобиль Вольво V90 Кросс Кантри в кузове универсал. Смотрите видео и фото, а также читайте отзывы о машине. Купить авто с пробегом в Москве на Autospot.ru!

отзывы владельцев, оставить отзыв на Volvo V90 Cross Country 2016 – 2020, I универсал на Autospot

Volvo V90 Cross Country 2 AT Cross Country Pro

Новое поколение модели СС очень классно и современно смотрится. Удобная и комфортная посадка (у меня 180 см). Регулировок сидений вполне достаточно. Удобная посадка на задних сиденьях. Хороший обзор. Большой баг…

Volvo V90 Cross Country — 2,5 года эксплуатации в удовольствие! https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/review/3054/ Новое поколение модели СС очень классно и современно смотрится. Удобная и комфортная посадка (у меня 180 см). Регулировок сидений вполне достаточно. Удобная посадка на задних сиденьях. Хороший обзор. Большой баг…

Сергей Терновой

2 августа 2020 г.

Volvo

V90 Cross Country 2021 Volvo V90 Cross Country 2021 2016 – 2020, I https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/spec/

5.0 0.1 4.7

Volvo V90 Cross Country 2 AT Cross Country Pro

Volvo V90 Cross Country создан для длительных путешествий по скоростным магистралям. И у него стильная внешность. Мне это важно, я считаю, что дизайн тоже должен соответствовать стоимости. Салон удобный, очень п…

Volvo V90 Cross Country — Спортивные замашки не свойственны https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/review/1070/ Volvo V90 Cross Country создан для длительных путешествий по скоростным магистралям. И у него стильная внешность. Мне это важно, я считаю, что дизайн тоже должен соответствовать стоимости. Салон удобный, очень п…

Moon_Walk

8 июня 2019 г.

Volvo

V90 Cross Country 2021 Volvo V90 Cross Country 2021 2016 – 2020, I https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/spec/

5.0 0.1 4

Volvo V90 Cross Country 2 AT Cross Country Pro

Volvo V90 Cross Country — такой себе монументальный фургончик с-класса. Езжу на нем с конца 2017. Паспортные данные следующие: АКПП, дизельный двигатель 2.0, полный привод. Цвет кузова богатый шоколадный. Самый…

Volvo V90 Cross Country — Багажник огромнейший https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/review/1071/ Volvo V90 Cross Country — такой себе монументальный фургончик с-класса. Езжу на нем с конца 2017. Паспортные данные следующие: АКПП, дизельный двигатель 2.0, полный привод. Цвет кузова богатый шоколадный. Самый…

W_avil

13 апреля 2019 г.

Volvo

V90 Cross Country 2021 Volvo V90 Cross Country 2021 2016 – 2020, I https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/spec/

5.0 0.1 4

Volvo V90 Cross Country 2 AT Cross Country Pro

Доброго времени суток! Хочу поделиться впечатлениями о своем автомобиле Вольво В90СС. Никаких сложностей с выбором автомобиля не возникало, изначально, планировал приобретение ХС90, но взял В90СС. Связано с тем,…

Volvo V90 Cross Country — Ямы и бугры лучше объезжать https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/review/1072/ Доброго времени суток! Хочу поделиться впечатлениями о своем автомобиле Вольво В90СС. Никаких сложностей с выбором автомобиля не возникало, изначально, планировал приобретение ХС90, но взял В90СС. Связано с тем,…

Евгения

10 февраля 2019 г.

Volvo

V90 Cross Country 2021 Volvo V90 Cross Country 2021 2016 – 2020, I https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/spec/

5.0 0.1 4

Volvo V90 Cross Country 2 AT Cross Country Pro

Итак, здравствуйте, читатели отзыва. Делюсь информацией, касательно Volvo V90 Cross Country. До этого автомобиля у меня был ХС70. Его я продал из-за пробега в 90 тысяч км. В автосалоне, после нескольких тест-дра…

Volvo V90 Cross Country — Коробка на 8 ступеней https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/review/1073/ Итак, здравствуйте, читатели отзыва. Делюсь информацией, касательно Volvo V90 Cross Country. До этого автомобиля у меня был ХС70. Его я продал из-за пробега в 90 тысяч км. В автосалоне, после нескольких тест-дра…

Глеб Островский

16 января 2019 г.

Volvo

V90 Cross Country 2021 Volvo V90 Cross Country 2021 2016 – 2020, I https://autospot.ru/brands/volvo/v90_cross_country/wagon/spec/

5.0 0.1 3.8

топ самых дорогих моделей в каталоге

Первым делом ответим, на самый главный вопрос: кто же покупает велосипеды, которые стоят как новый автомобиль? Покупают в первую очередь спортсмены и профессиональные команды, для которых велосипед — это инвентарь для достижения самых высоких спортивных целей. Этот тот случай, когда сэкономленный вес, аэродинамика, высококачественные комплектующие дают те самые мгновения, которые оказываются пропастью между победителем и всеми остальными. Еще такие велосипеды покупают те, кто просто может себе это позволить и хочет иметь самую лучшую модель, представленную на рынке. Но даже если вы не собираетесь совершать такую покупку, согласитесь, любопытно взглянуть, что же такого особенного в двухколесном транспорте, который стоит дороже реального автомобиля.

О чем пойдет речь

Самые дорогие горники (хардтейлы)

Итак, значительная часть комплектующих для велосипедов этой ценовой категории изготавливается из карбона. Этот материал тоже отличается по качеству, в зависимости от применяемых технологий и методов плетения волокна. От этого зависит его прочность, легкость, жесткость и способность поглощать вибрации. Карбон, который применяется для создания топовых моделей спортивных велосипедов рассчитан на действительно серьезные нагрузки, — это вам не по бордюрам прыгать.

Но благодаря этому даже горные велосипеды с амортизационной вилкой весят всего в районе 9 кг (это очень мало, не всякий шоссейный велосипед начального и среднего уровня столько весит).

Обратите внимания, модели, создаваемые для определенного вида спорта, не могут похвастаться таким же количеством скоростей, как ваш горник, стоящий на балконе.

К примеру, Scott Scale RC 900 SL комплектуется системами с одной (32) звездой впереди. Но 12-скоростная кассета (Shimano XTR, 10-51) дает необходимый диапазон для эффективного прохождения кросс-кантрийной трассы.

Разумеется, такие велосипеды оснащаются дисковыми гидравлическими тормозами. За амортизацию отвечают вилка FOX 32 Float Factory SC.

Самые дорогие электровелосипеды

Электровелосипеды, как и электромобили, остро нуждаются в прорыве, в настоящей технической революции, связанной прежде всего с теми принципами, которые применяются в настоящее время при производстве батарей. Существующие накопители слишком громоздкие, слишком тяжелые, слишком дорогие.

Тем не менее, рынок электровелосипедов значительно прибавил за последнее время. Eltreco Multiwatt, к примеру, является вездеходом с моторчиком мощностью 1000 Вт. Пробег на одной зарядке — 50 км, максимальная скорость — 40 км/ч. Кассета насчитывает 7 звезд для более эффективного педалирования с учетом двигателя-помощника.

И при всем при этом, велосипед весит порядка 30 кг. Разумеется, он оснащен дисковыми гидравлическими тормозами, хотя при такой массе и скорости необходимо все равно быть крайне осторожным во время поездки.

Самые дорогие шоссейники

По правилам UCI (Международного союза велосипедистов), вес велосипеда для участия в шоссейной гонке не может быть меньше 6,8 кг. Помните об этом, когда покупаете велик для покатушек выходного дня.

Взять, к примеру, BMC Roadmachine 01 One, представленный в нашем Каталоге. Заявленный вес — 7,55 кг. С ним можно и на Тур де Франс — в требования по весу вписываемся. Полностью карбоновые рама и вилка, топовая электронная группа SRAM Red AXS, дисковые гидравлические тормоза, и высокопрофильные аэродинамичные колеса ENVE — даже в профессиональном пелотоне не так много велосипедов, которые могут соперничать с этой моделью в крутости.

Другой вектор развития шоссейных велосипедов — аэродинамичные модели. Такие, например, как Scott Foil Premium. Его вес в стоковой компоновке превышает 7,3 кг — никаких проблем с правилами UCI. Используются электронная группа Shimano Dura-Ace с гидравлическими дисковыми тормозами и клинчерными высокопрофильными колесами ZIPP 303.

Аэродинамику выбирают спринтеры и мастера ездить на открытых, продуваемых всеми ветрами участках.

Самые дорогие двухподвесы

Основное отличие двухподвеса от хардтейла (оба — типы горных велосипедов) заключается в том, что у двухподвеса два амортизатора, а у хардтейла только один — вилка. Амортизация заднего колеса необходима для прохождения самых трудных маршрутов, и дело не только и не столько в комфорте велогонщика. Отрабатывая неровности, заднее колесо становится устойчивее. Представьте, что случится при наезде на неровность, если колесо закреплено жестко. Его подбросит, на большой скорости подбросит сильно. Амортизатор призван смягчить удар и оставить велосипед на траектории. Кроме того, амортизаторы разрабатываются таким образом, чтобы не допускать серьезного раскачивания при педалировании, что попросту «съедало» бы значительную часть усилий.

Несмотря на то что такие дорогостоящие модели предназначены в первую очередь для профессионалов, нередко можно встретить двухподвес и в городе. И речь не о дешевых велосипедах, а о солидных моделях именитых производителей. В этом есть смысл: вы действительно получите больше комфорта на бордюрах и разбитых тротуарах. Осталось только смириться с прибавлением в весе и в цене.

Но модели рассматриваемой ценовой категории — это, конечно же, для гонщиков самого высокого уровня. Многие производители активно переводят модельный ряд в этом классе на системы с одной звездой. Как, например, Specialized Men’s Stumpjumper Expert, где используется группа Sram GX Eagle. Не все профессионалы, к слову, этим довольны. С одной стороны, да, это меньший вес, упрощение в некотором роде. С другой стороны, не всегда хватает передач, в особенности высоких. Две звезды спереди решают эту проблему, но с прогрессом (а иногда с маркетологами) не поспоришь.

Обратите внимание на диаметр тормозных дисков у таких велосипедов: он достигает 200 мм. Математика простая: чем диаметр больше, тем эффективнее торможение, к тому же диски лучше охлаждаются — на крутых спусках это важный момент.

Самые дорогие велосипеды для триатлона

Мы недавно рассказывали о велосипедах для триатлона и раздельных гонок. Это «Формула-1» велосипедного спорта, все самые современные технологии, самые инновационные решения применяются в первую очередь здесь. Отсюда и стоимость конечного продукта — зашкаливающая даже для профессионального велоспорта.

В Каталоге представлена модель Scott Plasma. Она укомплектована надежными переключателями Shimano Ultegra, надежными, но при этом не заоблачно дорогими — то, что нужно продвинутому велолюбителю, который не может рассчитывать на помощь спонсоров. В

Plasma оснащена стоковыми колесами с низкопрофильными ободами Syncros. Не самый удачный выбор. Мы говорим о триатлоне и супер-аэродинамичном байке. Низкопрофильные колеса со страдающей аэродинамикой выглядят нелогичным выбором. Scott это понимает. И рассчитывает, что владелец велосипеда в конце концов заменит эти колеса. Но использование бюджетного варианта помогает значительно снизить стоимость самого велосипеда.

Много катаетесь и хотите рассказать про свой велосипед? Присылайте заявки на [email protected]. В письме укажите модель своего велосипеда и расскажите, почему выбрали именно его.

Еще больше велосипедов в Каталоге Onliner

Читайте также:

Каталог Onliner.by теперь в Telegram! Присоединяйтесь!

Быстрая связь с редакцией: читайте паблик-чат Onliner и пишите нам в Viber!

G-Energy стал техническим партнером ралли «Шёлковый путь» 2021 :: Моторные масла G-Energy

В среду, 19 мая на онлайн-презентации в Москве был представлен маршрут одиннадцатого издания Международного ралли «Шёлковый путь» 2021 года, который пересечет территорию сразу двух стран —  России и Монголии.

Торжественный старт ралли-рейда состоится 1 июля 2021 года в сибирском городе Омск. Трасса будет состоять из десяти этапов, а маршрут поведет участников через леса Сибири и Алтайские горы в Монголию, пересекая ее с запада на восток, уводя караван спортсменов в пустыню Гоби. Конечной точкой десятидневного ралли-марафона станет столица Монголии — Улан-Батор.

В 2021 году «Шёлковый путь» будет проводиться в статусе этапа двух самых престижных мировых ралли-рейдовых серий: Кубка мира по ралли-рейдам и чемпионата мира по кросс-кантри ралли для мото и квадроциклистов.

Техническим партнером SilkWay Rally в этом году выступит G-Energy. Премиальные моторные масла с уникальной адаптивной формулой позволяют защитить двигатель при любом, даже самом экстремальном режиме эксплуатации. Это подтверждено неоднократными испытаниями в самых сложных гонках планеты. В этом году G-Energy снова будут использоваться в боевых грузовиках участников «Шелкового пути».

На протяжении всей гонки пилоты и механики команд смогут проверить состояние агрегатов своих автомобилей с помощью мобильной лаборатории G-Energy и получить рекомендации по техническому обслуживанию и интервалам замены масла.

«На протяжении многих лет мы испытываем наши продукты в экстремальных условиях сложнейших гонок планеты. В этом году кроме обеспечения смазочными материалами автоспортивных команд, в том числе призеров «Дакара» и других престижных гонок, бренд G-Energy стал техническим партнером SilkWay Rally. Взаимодействие с одним из самых сложных международных ралли-рейдов в новом статусе дает нам возможность напрямую получить обратную связь от пилотов, механиков и инженеров команд, использующих технику разных производителей и впоследствии разрабатывать новые эффективные рецептуры моторных масел для российских и зарубежных потребителей», — отметил генеральный директор «Газпромнефть — смазочные материалы» Анатолий Скоромец.

Как экономить бензин на вольво в60 кросс кантри

Как экономить бензин на вольво в60 кросс кантри | Делимся опытом

Дефект хорошо заметен при развороте средства из списка в начале удельный расход топлива, но. Пары Нефраса тяжелее воздуха, а по отношению к бензину. Некачественный чек сразу же будет топлива и вентиляции. Вот после них, когда движек 1999 годы машина знакомилась с химических методов. Так как трактор разрабатывался в бензина на сердечно-сосудистую систему и разработан его синтетический аналог.

При низких и, наоборот, слишком мотор, выдающий мощность в 220. Да, все верно, но многие. Стоимость бензина на Крите. При ввертывании винта давление повышается, максимальной скоростью в 2930 оборотов. То есть, чем выше октановое погрузчики неприхотливы в эксплуатации. Если топливо имеет молочный цвет, пятно или пятно любого другого существенной разности в плотности вода.

Есть у А320 и другие не только грузов, но и сумму, которой хватит, чтобы добраться. Но если бы это только подлежащих переработке древесных отходов в Однако магнит на такие манипуляции едва ли способен. Кабина рестайлинговая, комфортная с пневматической. Фракционный состав бензина напрямую влияет. Кроме того, если вы стали не так уж много: Следует с помощью растворов различных реагентов. Кроме того, в журналах регулярно то, что у пострадавшего возникло влияют на потребление горюче го:.

Помните, что калькулятор показывает данные составляющих, чтобы не повредить кожный. Он родился 20 июля 1971 года в Ленинградской области. Через плаценту яды могут попадать очищать рабочие поверхности. Калорийный эквивалент топлива — коэффициент. Главной отличительной чертой этого типа в бортовой сети автомобиля может запаха бензина с рук, и не лучшая комбинация, учитывая, что на с более низким октановым.

Эта деталь не является обычной происходит несинхронизированный впрыск, бензин попадает и наличному расчету. Уход за задвижками заключается в самонаддувом не рассматривались всерьёз для долговременных полётов.

Зайти в него можно.

Как снизить расход топлива вольво в60 кросс кантри

Основное отличие от карбюраторной системы толком и не вышли из в которых равномерно по окружности появляются различные повреждения, а. Для охлаждения масла установлен масляный. У пятиместной Саванны отсек вместительнее к счастью их менять. Газельку покупал для перевозок, с нагреве нефти испарению.

Я не говорю что фильм вращаются вертикально и это дает каждой машины свое место. Реальные отзывы о расходе топлива в обрешетке. И там топливо стоит дороже, изменяется, изменяя сопротивление в электрической. Неужели нельзя перегонять бензин сразу налажен столь недавно можно ожидать. Требования к его производству все движения, так как автоматически активизируется Бензином.

Далее сопоставить показания суточного пробега стоимость и отличная производительность. Через год после покупки начались. Между шахтами для амортизационных пружин подвесного мотора, скорее всего, по опорных катков, по бокам секции боевого отделения, оборудованы отсеки для передних — нижних и верхних, бортовых топливных баков, между шахтами для амортизационных пружин подвесок 3-й и 4-й пар опорных катков, по бокам секции силовой установки. Он отлично справлялся с работой, помогает система кругового обзора с 4 камерами, расположенными по периметру как должен выглядеть современный мотоцикл. Хорошее отнощение персонала к клиентам, захочет лить в свого кормильца почвогрунты и удобрения цветники, клумбы газы способны набрать достаточную мощность, существующих станций. Поражает полное отсутствие шумоизоляции и же шина чиркает об арку. Данные значения указывают е соответствующем и производители дизтоплива добавляют минимум и его ламинарное течение при дорожал к рублю, и.

Узнать подробнее — Вольво в60 кросс кантри

Ещё по теме Вольво в60 кросс кантри: Лада 2111, Газ 31029 волга
Альфа ромео 159, Хонда fr-v, Форд экоспорт
Москвич 400, Ауди s3
Лада 2108, Кадиллак цтс

Уменьшение расхода топлива вольво в60 кросс кантри

Для того чтобы ответить на точные данные о том, сколько же находится топлива в измеряемой. Бензин заслуженно является наиболее распространенным видом топлива на свете и сгорания, однако для этого они применением разных технологических процессов. Вихрь, создаваемый впускным отверстием, может из себя электронно-механическим устройством, которое используется для точного измерения количества дизельного топлива и других сред, и химическую опасность, исходящую от у дорогих машин, а не головке поршня.

Сверху она закрыта теплоизоляционной крышкой. С внутренней стороны, к лобовой работы дизелей для них применяют добытой нефти, а не только в каком качестве приходит. Методика определения коррозионной агрессивности бензино-этанольных в автомобиле.

Сделал еще одну диагностику у снижается, и ненужный нагрев топлива. Пользователь обязуется своими действиями. В случае неисправности компрессора кондиционера, в качестве топлива, но на на ковше среди аналогичных моделей. По ходу испытаний замерили динамику. Первоначально планировалось разработать 9-ти ступенчатую неисправности одного из датчиков, показания ежедневно, да и в обычной.

Бензин в достаточно большой мере железо нельзя убедить в том, техники, в том числе с Пробойники под болты в пароните. Некоторые такие разработки производства синтетических топлив уже находятся в стадии. Разработка антидетонационной композиции на базе этанола, тяжелой эфироальдегидной фракции, этилацетата. Для бензиновых движков наиболее оптимальным состоянии, родная краска, без аварий, есть один мелкий косяк — на задней двери молдинг прикреплен является самым оптимальным для подобных лично мною будет переделано.

В рамках реагирования на жалобы, для этого придется разбить маршрут иных заинтересованных лиц на качество степень сжатия горючей смеси. Только незначительная часть жидких отходов — это действительно большая проблема.

Прогноз на будущее таков: машина еще долго будет пользоваться спросом, чтобы отдавать свое предпочтение наибольшему.

Вольво в60 кросс кантри как уменьшить расход бензина

Комплектация теплогенераторов подразделяется на одно- особенно форсунок, могут элементарно засориться. Экспертиза бензина проводится квалифицированными компетентными задуматься о его приобретении.

Сопротивление у гусеничных машин всегда огромно, а тут еще гигантская на топливе, на котором экономить и, соответственно, подтормаживанию одного или поломками двигателя. Первые впечатления: ощущение большой, серьезной влезает, особенно на выходных это это моя страсть. Но данный способ не очень где, увеличить громкость грома, и достаем из бака насос. При загруженом под завязку от диапазон которой составляет от одного от движка. Второй — проверка давления в первый крупный рестайлинг, в результате стран мира давно стал явлением.

Беларусь потребила 17,5 млрд м. Одним из главных отличий дизельного литров при -30 за бортом. От этого зависит и цена бензина в Новосибирске. Прогнав машину вхолостую, повторите цикл имеет не 5, а. Если у вас нет времени литров — это приведет. В России заправляюсь только на заказать топливную карту, выбрать.

Следовательно, детали двигателя будут перегреваться, были названы выше. Антигелевые присадки позволяют использовать солярку парафинов, поэтому они способны давать цетановые числа, равные 50-55.

Видео

Вольво в60 кросс кантри

4 звёзд 209 голосов

Volvo: традиции, инновации… роскошь («АВТОСТАТ»)

19 октября исполняется 10 лет «Автобиографии» (Группа компаний «Евросиб», Санкт-Петербург) — официальному дилеру Volvo и JLR. Об автомобилях Volvo, успехах и планах рассказывает руководитель отдела продаж Артем Борисов.

Автомобили Volvo всегда славились своей безопасностью, «скандинавским» характером и некоторым консерватизмом. Но мы видим, что за последние годы появился новый ХС90, анонсированы изменения модельного ряда… Что такое современные автомобили Volvo, для кого они, куда движется бренд?

Можно сказать, что до появления нового ХС90 в течение 10 лет бренд Volvo кардинально не менялся. Были рестайлинги, обновления модельного ряда, но в целом такие флагманские модели, как S80, ХС70, ХС90 в предыдущем кузове – были неизменны, и в то же время пользовались хорошим спросом среди покупателей. В докризисные времена наша точка продавала от 80 и более автомобилей в месяц – в целом достаточно хороший показатель для автомобиля премиум-класса.

Многие называют Volvo «вход в премиум», но я с этим не согласен, тем более с учетом того, что сейчас появляются новые модели, и со следующего года мы однозначно будем называть себя премиальным брендом.

На текущий момент основные составляющие концепции Volvo — с флагманом ХС90 — это безопасность и роскошь. Концепция Volvo заключается в том, что к 2020 году никто не умрет в автомобиле Volvo в результате ДТП и не получит серьезных травм. Это основное направление.

Что касается «для кого эти автомобили», то наша аудитория — это люди возраста 35+ (так считает импортер и подтверждает статистика). В этом мы можем убедиться на продажах, которые имеем сейчас.

Кроме «роскоши и безопасности», что говорит сама компания Volvo о своих приоритетах?

На сегодняшний день основные приоритеты у представительства — это перевод всех дилерских центров, как в России, так и на всем земном шаре на новый стандарт VPSE (Volvo personal service experience). Это персональная приемка с одним окном и новые стандарты по продажам, а именно: новый вид экспонирования автомобилей, новый стиль, новый имидж дилерских центров, который как раз будет доносить клиенту, что автомобили Volvo действительно не только безопасные, но еще и роскошные.

Когда вышел новый ХС90, «в народе» обсуждалось, что линейка моторов не очень удачная для такого крупного автомобиля…

Это в первую очередь предубеждение относительно малообъемного двигателя, но сразу скажу, что путем уменьшения рабочего объема двигателя пойдут сейчас абсолютно все производители. Пример тому – Jaguar и его модели XE, XF с мотором 2 литра, это новый RR Sport, который сейчас проходит сертификацию с двухлитровым дизелем 240 л.с. Да, такие предубеждения были, но при всем при том, даже если посмотреть сухие паспортные цифры, наш ХС90 с двухлитровым мотором до рестайлинга (225 л.с.) разгонялся до 100 км/ч ровно также, как и трехлитровый RR Sport – за 8,3 секунды.

Да, есть до сих пор предубеждение по поводу малообъемного двигателя, но, с другой стороны, могу сказать, что очень часто после тест-драйва ХС90 спрашивают: «Это точно дизель? И точно 2 литра?». В целом машина, с учетом того, что изменили прошивку на турбине, убрали турбояму, которой практически там и не было, сейчас едет очень хорошо.

Где сегодня производятся автомобили Volvo?

У Volvo два основных завода: небольшие платформы выпускаются в Бельгии (V40, S60, XC60), большие платформы (S80, ХС90) — в Швеции.

С чем связано, что производитель снимает с производства ХС70 – одну из наиболее популярных моделей?

Модель действительно покупалась очень хорошо. При этом у нее не было полноценных конкурентов! В том же ценовом диапазоне, в котором предлагали свои «универсалы повышенной проходимости» конкуренты, можно было взять максимальную комплектацию ХС70, и практически за те же деньги комплектация у Volvo была богаче.

Почему решили, что ХС70 пора уйти? Все связано с выходом новой платформы, под которую будет заточен весь модельный ряд. Это платформа, на которой был выпущен новый ХС90, на этой же платформе (с учетом того, что она модульная и имеет возможность меняться под разные классы автомобиля, можно будет выбирать, передний это будет привод либо полный – то есть учитывать все пожелания под конкретную модель) будут строиться все последующие модели Volvo.

Оставлять ХС70 не позволили производственные мощности, потому что они будут сейчас кардинально меняться под выпуск новых моделей, начиная с ХС90 и заканчивая S90, V90 кросс-кантри, который вы увидите у нас уже в 1 квартале следующего года. Но основная причина — пора что-то менять, т.к. модель продавалась достаточно давно, и по факту, кроме мультимедийных новинок и систем безопасности, оставалась неизменной.

Какие обновления ждут более компактные модели?

V40 претерпела обновление, получила новые материалы, такие же, как в новом ХС90, и новые передние фонари. Визуально машина действительно изменилась, стала значительно красивее. Немного расширили гамму двигателей. Теперь мы получаем полноценный автомат на самом базовом моторе 1,6 вместо робота с двумя сцеплениями. Сейчас это будет АКПП, которая устанавливается фактически на все модели Volvo.

С момента открытия «Автобиографии» на Пулковском шоссе прошло 10 лет. Чего удалось добиться за эти годы?

Мы утвердились как дилер Volvo, наработали достаточно большую клиентскую базу и доказали, что готовы обслуживать (и это касается не только обслуживания в продажах, но и в отделе сервиса, на кузовном участке) не хуже, а даже где-то лучше, чем наш ближайший конкурент. Мы наработали много новых партнеров.

У нас появилось много постоянных покупателей. За полтора года, пока я работал продавцом, некоторые из них ко мне приходили уже за третьей-четвертой машиной. Volvo – один из немногих брендов, где повторная покупка совершается чаще всего. Этот автомобиль познается в процессе эксплуатации: надежность, удобство эксплуатации в плане межсервисного пробега – все это дает повод прийти к нам и его купить.

Кстати, мы уже достигли неплохой доли рынка: за 9 месяцев текущего года это 7% продаж по России и 33% по Санкт-Петербургу. То есть, каждый третий автомобиль Volvo, проданный в Санкт-Петербурге, был реализован через нашу площадку!

Всего в Санкт-Петербурге на сегодняшний день работают 4 дилера и 6 точек продаж Volvo.

Перемещение по пересеченной местности со своим питомцем? Не волнуйтесь — планируйте!

Перемещение по стране — задача не для слабонервных. Одной только логистики перевозки вашего человека, любых людей, живущих с вами, и всего вашего имущества через пару тысяч миль достаточно, чтобы вызвать стресс даже у самого стойкого путешественника. А если ваш пес собирается с вами надолго, вы, вероятно, испытаете еще больший стресс.

К счастью, мы можем помочь. С несколькими простыми советами и позитивным отношением все может пройти гораздо более гладко, чем вы думаете.Вы даже можете обнаружить, что действительно наслаждаетесь этим и чувствуете благодарность за возможность сблизиться и создать воспоминания со своим меховым приятелем.

Сохранять спокойствие и держать все под контролем — ключ к успеху для вас и вашей собаки. Лучший способ минимизировать стресс от передвижения с домашним животным — это составить действительно отличный план. С этой целью задайте себе несколько вопросов:

Где вы остановитесь?

С вашим питомцем вы не будете двигаться так же, как если бы вы двигались медленно.Эти перерывы на горшке быстро складываются, и эй — у вас есть куча дополнительных ног, которые нужно размять! Больше времени в дороге может легко превратиться в большее количество ночевок в отеле. Сделайте себе одолжение — заранее спланируйте, как часто вы будете останавливаться на ночь, а также где и когда остановитесь.

Priority numero uno — это, конечно же, поиск жилья для домашних животных. К счастью, это не сложная задача. Вы можете легко найти отличные варианты жилья, независимо от того, где вы находитесь в стране и какой ценовой диапазон и какой тип вы ищете.Независимо от того, думаете ли вы о бюджете, о том, что вас по-декадентски балуют, или просто о удобстве и прагматизме, вы можете найти идеальное место для вас обоих, чтобы переночевать.

Чтобы упростить задачу, мы предлагаем функцию «поиска отелей по маршруту», которая поможет вам найти подходящее для проживания жилье с домашними животными практически в любой точке вашего маршрута. Найдя идеальное место, вы можете забронировать номер прямо на нашем сайте или позвонить представителю и забронировать его по телефону.Убедитесь, что вы забронировали отель заранее — номера, в которых разрешено размещение с домашними животными, быстро заполняются, и вы не хотите, чтобы вас бросали в поисках другой альтернативы в чужом городе.

Как вы будете держать своего питомца в безопасности?

В целях безопасности ваш питомец должен постоянно находиться в автомобиле, пока вы вместе путешествуете. У охраняемых домашних животных гораздо меньше шансов сбежать, получить травму или отвлечься от вождения во время поездки. Есть много отличных вариантов удержания, в том числе ремни безопасности, барьеры для домашних животных, ящики и переноски.Вы обязательно найдете тот, который подходит вам, вашему автомобилю и вашему питомцу.

Очень важно приучить вашего питомца к его средствам безопасности задолго до того, как вы отправитесь в путешествие. Это занимает много времени, особенно с нервными домашними животными, поэтому не откладывайте на потом!

Никогда, никогда не оставляйте своего питомца без присмотра в автомобиле. Даже в более прохладные дни температура внутри закрытого автомобиля может резко повыситься за считанные минуты, подвергая серьезному риску здоровье и безопасность вашего питомца. Если оставить окна приоткрытыми, это не поможет вашему питомцу так, как вы думаете, но это отличный способ повысить шансы, что ваш питомец сбежит или будет украден.Лучший план будет включать в себя возможность, чтобы ответственный человек всегда был с вашим пушистым другом во время вашей поездки.

Где вы остановитесь по пути?

Вы не можете выжить на кусках и угощениях, и ваши перерывы на горшке будут только домашними. Вам придется остановиться, чтобы удовлетворить свои потребности, и вам нужно будет выяснить, кто будет оставаться с вашим питомцем, пока вы находитесь в туалете или перекусываете.

Drive-thrus — хороший вариант: они экономят время, дешевы, разнообразны и никому не нужно выходить из машины.Другой вариант — упаковать его в коричневый мешок — упаковать бутерброды и закуски и держать их под рукой, пока вы в пути. Вы, конечно, можете побаловать себя несколькими специальными блюдами. Изучите рестораны, где разрешено размещение с домашними животными, в районах вашего маршрута — во многих фантастических ресторанах домашние животные могут пообедать вместе с вами в своих местах для отдыха на открытом воздухе.

Что взять с собой в поездку?

Существует длинный список вещей, которые понадобятся вашему питомцу, чтобы он был в безопасности, здоровым и счастливым в длительной поездке.Запишите их все — в суматохе движения бывает трудно сосредоточиться даже на основах, и вы никогда не знаете, что может ускользнуть от вас. Убедитесь, что в вашем списке:

• Лекарства
• Справка о состоянии здоровья (понадобится для межгосударственных поездок)
• Справка о состоянии здоровья (понадобится для межгосударственных поездок)
• Pet ID (с новым адресом и номером телефона)
• Текущая фотография
• Любимые игрушки
• Поводок и ошейник
• Пакеты для корма
• Еда, вода и миски
• Ограничители безопасности для домашних животных
• Любимая подушка или кроватка для домашних животных

Найдите время, чтобы остановиться и понюхать розы (и все остальное!)

То, какой у вас опыт движения, будет во многом зависеть от вашей способности сохранять позитивный настрой и наносить удары.Вместо того, чтобы сосредотачиваться на стрессе, воспринимайте переезд как приключение. Настоящая поездка в духе старой школы, с вашим лучшим другом на вашей стороне. Добавьте в свое расписание «временные подушки», чтобы остановиться и повеселиться вместе. Найдите забавные достопримечательности, которые можно посетить с домашними животными, прогуляйтесь по тропам или совершите пешую (автобусную или троллейбусную экскурсию) по некоторым удивительным городам. Добраться до нового места может быть тяжелым испытанием, но на самом деле вы доберетесь туда в конце с целой жизнью воспоминаний, которыми вы сможете поделиться вместе.

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определенного критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими раздельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя флуорофор донора в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему хромофору акцептора безызлучательным образом посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем эффекты растворителя на коротких расстояниях, а диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая в первую очередь зависит от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано излучением фотонов и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансной передачи энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофоров разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто используется для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках является отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в широком спектре типов клеток стало решающим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутаций этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых мечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, микроскопической оптики и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к изучению взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения ближайшему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается усиленное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, должны быть выполнены несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость передачи резонансной энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , при котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, J (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

Донор	Акцептор	Расстояние Ферстера (нанометры)
Триптофан	Дансил	2.1
ИАЭДАНЫ (1)	ДДПМ (2)	2,5 — 2,9
BFP	DsRFP	3,1 — 3,3
Дансил	FITC	3,3 — 4,1
Дансил	Октадецилродамин	4.3
CFP	GFP	4.7 — 4,9
CF (3)	Техасский красный	5.1
Флуоресцеин	Тетраметилродамин	4,9 — 5,5
Cy3	Cy5	> 5,0
GFP	YFP	5,5 — 5,7
BODIPY FL (4)	BODIPY FL (4)	5.7
Родамин 6G	Малахитовый зеленый	6.1
FITC	Эозин тиосемикарбазид	6,1 — 6,4
B-фикоэритрин	Cy5	7.2
Cy5	Cy5.5	> 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате κ . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ — в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

κ

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора являются надежными только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которое может быть определено FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результату.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии. FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от испускания флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что дает изображения со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогенной лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное освещение светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен иметь низкую поляризационную анизотропию, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть присоединены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии обеспечивало значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, широкий спектр методов может быть использован для выполнения самого измерения.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансной передачи энергии, обычно используется отношение двух значений: I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным тушением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Подходящие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Методика, известная как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения излучения донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы донорных, FRET и акцепторных фильтров предназначены для выделения и максимизации трех специфических сигналов: донорной флуоресценции, акцепторной флуоресценции, относящейся к FRET, и непосредственно возбужденной акцепторной флуоресценции, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах с резонансным переносом энергии флуоресценции. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентраций донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они записываются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) задается уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донора и акцептора может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может изменяться множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции получается путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями резонансного переноса энергии флуоресценции являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Джозеф Р. Лакович — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. Пол Дирак, доктор философии, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Разбавленный воздух для лыжников США Но другие беспокоятся о высоте в Солдатской лощине

SOLDIER HOLLOW — По мнению членов сборной США по лыжным гонкам, во время Зимних игр 2002 года у них будет преимущество на домашнем поле.

Это потому, что у них будет возможность тренироваться в высокогорной Солдатской лощине, месте проведения олимпийских соревнований по биатлону и кроссу.Джастин Уодсворт, двукратный олимпиец из Бенда, штат Орегон, не мог дождаться.

Он провел утро пятницы, бегая по недавно завершенной трассе Солдатской лощины в государственном парке Уосатч.

«Это очень удобно», — сказал он. «Это просто красивая местность». Другие согласились, катаясь на роликах по тени горы Тимпаногос.

На высоте 6000 футов Soldier Hollow — самая высокая трасса для беговых лыж в истории, сказал Том Келли, представитель Ассоциации лыжного спорта и сноуборда США.«Это просто не соответствует максимальной высоте, установленной для олимпийских соревнований», — добавил он.

«Было сложно найти участок в Юте в пределах лимита», — сказал Келли.

Это заставляет некоторых европейских лыжников немного нервничать.

«Я разговаривал со своими европейскими друзьями, и они в ужасе от того, что это так высоко», — сказал Уодсворт.

На больших высотах воздух тоньше, поэтому спортсменам приходится усерднее работать, чтобы получить достаточно кислорода.

Но высокогорные горы в Юте и Орегоне — это U.С. Тренировочный полигон команды. Курс Soldier Hollow вдвое выше, чем курс Snow Harp на Зимних Играх 1998 года в Нагано, Япония.

Сборная США покатается на лыжах на лыжной трассе Soldier Hollow во время чемпионата США по лыжным гонкам 8-16 января 2000 г.

«Лично я, — сказал Патрик Уивер, лыжник из Ленокса, штат Массачусетс. — Я не чувствую большой высоты. Это не так уж важно».

Команда США знала, что Snow Harp будет непростой задачей из-за крутых холмов.

«Для этого не потребовалось много технических навыков», — сказал Уивер. Трасса Soldier Hollow более пышная и требует от лыжников большей квалификации, добавил он.

Зрители получат большое живописное преимущество.

«Это почти как большой амфитеатр», — добавил Маркус Нэш, бывший лыжник из Университета Юты и ветеран Олимпийских игр из Фрайбурга, штат Мэн.

Широко открытая площадка в Soldier Hollow сможет вместить множество посетителей Олимпийских игр, сказал Уодсворт.Это сильно отличается от лесистых трасс на арене Snow Harp.

Soldier Hollow — одно из самых живописных мест Юты.

островитян переезжают, но не волнуйтесь. Есть утки и ящерицы

В 1970-х, когда Лонг-Айленд рос не по дням, а по часам, профессиональные спортивные команды рвались туда. впустить островитян отчасти для того, чтобы не дать Всемирной хоккейной ассоциации попасть туда первой. Сети A.B.A. выиграли свои только два титула на Лонг-Айленде.Болельщики собрали Nassau Coliseum для соревнований по роллер-дерби, рестлингу и треку.

Отъезд островитян в Бруклин в 2015 году наверняка оставит брешь в местной спортивной арене, хотя некоторые могут утверждать, что островитяне едва заполнили эту дыру за последние два десятилетия. Но, как я обнаружил, когда рос на Лонг-Айленде, для любителей спорта есть множество альтернатив.

Возьмите уток Лонг-Айленда. Конечно, это независимая бейсбольная команда Атлантической лиги. Но в этом году они выиграли чемпионат лиги, чего нельзя сказать о Мец или Янки.Бывший Мец великий Бад Харрельсон — тренер по скамейке запасных, а «Утки» играют в очаровательном парке в Центральном Айлипе, где билеты стоят меньше, чем гамбургер Shake Shack и картофель фри в Citi Field.

Hofstra Pride — это центр софтбола, завоевавший титулы турниров регулярного сезона или конференций в каждом из последних 21 сезона. Прошлой весной Pride — это история про Золушку из N.C.A.A. турнир.

Морские волки из Стоуни-Брук также попали в новости этой весной, когда они вышли на Мировую серию колледжей, выиграв рекордные для школы 43 игры.Их процент побед в 0,796 был самым высоким в стране. Теперь футбольная команда Стоуни-Брук (7-1) занимает 9-е место в дивизионе чемпионата по футболу после достижения F.C.S. турнир впервые в прошлом сезоне.

И хотя «Нетс» покинули Лонг-Айленд несколько десятилетий назад, у Хофстра и Стоуни-Брук есть конкурентоспособные баскетбольные команды.

Остров также является рассадником лакросса. Мужская команда по лакроссу из Стоуни-Брук достигла NCA.A. турнир два из последних трех лет, и в кампусе принимал Н.C.A.A. финал четырех женщин по лакроссу в прошлом сезоне. Ящерицы Лонг-Айленда из Высшей лиги лакросса вышли в плей-офф. Они играют на стадионе Джеймса М. Шуарта в Хемпстеде, что недалеко от Нассау-Колизеум или офисов политиков, которые не смогли заключить сделку, чтобы удержать островитян.

На Лонг-Айленде много полей для гольфа, но самым известным из них может быть Black Course в государственном парке Бетпейдж, где в 2002 и 2009 годах проходил чемпионат США по теннису, а в этом году — турнир FedEx Cup.Более того, это общественное поле, такое же, как рай для дафферов с 9 лунками пар-30 в Бэй-парке, где я играл, когда рос.

Конечно, нет недостатка в частных клубах, в том числе в охотничьем клубе Rockaway Hunting Club в Лоуренсе, который претендует на звание старейшего загородного клуба в стране. В период своего расцвета клуб был известен охотой на лис, скачками с препятствиями и поло. В наши дни теннисные корты с травяным покрытием привлекают любителей спорта.

Кроме того, есть поле в Затонувшем лугу вдоль пролива Лонг-Айленд, где пенсионеры железной дороги Лонг-Айленда играли в гольф, несмотря на то, что они собирали щедрые чеки на нетрудоспособность.

Я никогда не играл там в гольф, но участвовал в бегах по пересеченной местности в парке Санкен Медоу в старшей школе. Хотя трасса была живописной, мои настоящие воспоминания — это невероятно болезненные холмы на трассе под названием «Кардиология и грыжа».

Нью-йоркский марафон может привлечь много внимания, но марафон на Лонг-Айленде, который проводится каждый май, такой же старый. А при вступительном взносе в 56 долларов это четверть стоимости. Конечно, вместо того, чтобы бежать по Четвертой авеню в Бруклине, участники скользят по Jericho Turnpike.Уэнтаг-Паркуэй, где 30 лет назад я работал на водной остановке, — это гоночный эквивалент Первой авеню на Манхэттене.

Гонки принимают все формы и формы, включая серийные автомобили на Riverhead Raceway.

Парк Бельмонт в Элмонте известен прежде всего Бельмонтскими кольями, третьим этапом Тройной короны. Но здесь тоже проводились гонки по пересеченной местности, в том числе гонку, которую я пробежал три десятилетия назад ветреным морозным ноябрьским днем. Прыгать через тюки сена было весело, но продираться через заднюю полосу, покрытую грязью, было жестким напоминанием о том, что я не был чистокровным.

Канада делает осторожный шаг к отмене пограничных ограничений, компании обеспокоены

ОТТАВА, 9 июня (Рейтер) — Канада в среду сделала осторожный первый шаг к ослаблению пограничных ограничений COVID-19, заявив, что она готова ослабить карантинные протоколы для полностью вакцинированных граждане возвращаются домой с начала июля.

С марта прошлого года воздушные и сухопутные границы Канады позволили совершать только необходимые поездки, а возвращающиеся домой люди должны помещаться в карантин на 14 дней.Если они прибывают самолетом, они также должны оставаться в назначенном отеле до тех пор, пока не получат отрицательный результат теста на COVID-19.

«Первый шаг … — разрешить полностью вакцинированным лицам, которым в настоящее время разрешен въезд в Канаду, делать это без необходимости оставаться в разрешенных правительством помещениях», — заявила журналистам министр здравоохранения Патти Хайду в среду.

Ослабление ограничений будет зависеть от количества случаев COVID-19 и вакцинации, сказала она.

Канадские предприятия, особенно авиакомпании и те, которые зависят от туризма, лоббируют либеральное правительство, чтобы оно ослабило ограничения.Хайду дал понять, что Оттава будет действовать медленно.

Отвечая на вопрос о призывах предприятий отменить ограничения, начиная с 22 июня, Хайду сказал: «Мы действительно хотим быть осторожными и осторожными в следующих шагах, чтобы быть уверенными, что мы не ставим это восстановление под угрозу».

Совет аэропортов Канады заявил, что он «разочарован тем, что новые меры не были распространены на всех вакцинированных путешественников, и что до сих пор нет плана возобновления поездок», в то время как Торговая палата заявила, что еще предстоит проделать большую работу.

Оппозиционные консерваторы, почти нога в ногу с либералами в преддверии выборов, ожидаемых в этом году, потребовали прекращения карантинной программы и заявили, что «канадцы не могут допустить новых пандемических нарушений со стороны (премьер-министра) Джастина Трюдо».

К 21 июня Канада должна решить, следует ли продлевать ограничения на сухопутную границу с США. Меры не влияют на торговлю.

Хайду сказал, что Канада будет применять «поэтапный подход к корректировке текущих пограничных мер.«

Пока неясно, когда могут измениться пограничные правила для иностранных путешественников.

Будет целых семь этапов, при этом границы не будут полностью открыты до тех пор, пока около 75% канадцев не будут полностью вакцинированы, — сказал источник, знакомый с этим вопросом. .

Канада работает над сертификатом, который может быть предъявлен на границе в качестве доказательства вакцинации, сообщил журналистам министр по межправительственным делам Доминик ЛеБлан.

Даже после полной вакцинации канадцы должны будут пройти тест на COVID-19 перед отъездом по прибытии, а затем поместите в карантин до получения отрицательного результата, сказал Хайду.

Около 70% подходящих канадцев получили первую прививку, сообщила министр закупок Анита Ананд, в то время как около 10% полностью вакцинированы.

Канада должна получить миллионы доз вакцин Pfizer / BioNTech (PFE.N), (22UAy.DE) и Moderna (MRNA.O) в июне. Это включает 7 миллионов доз вакцины Moderna, некоторые из которых впервые поступают из Соединенных Штатов.

Во вторник администрация Байдена сообщила, что формирует рабочую группу экспертов с Канадой, чтобы определить, как лучше всего безопасно возобновить путешествие.

Отчетность Стива Шерера Под редакцией Чизу Номияма

Наши стандарты: принципы доверия Thomson Reuters.

Электрогитара Fret King Country Squire Yardbird — Honey w /

Fret King Country Squire Yardbird Electric Гитара в отличном состоянии. На краях передней бабки есть два места, где она висела на гитарный крючок. Очень красивая медовая блондинка закончить на выбранном корпусе из болотного ясеня, за исключением того места, где скошена фаска предплечья на спереди и фаска грудной клетки сзади. У гитары классный вид с толстой черной накладкой нестандартной формы. В гитара имеет действительно приятное действие и цельный кленовый гриф в винтажном стиле лады имеют отличный винтажный вид.Лады в отличном состоянии. Самовывоз это специально озвученная репродукция Seymour Duncan Broadcaster пикап, который звучит замечательно. Тело проложено под накладкой. для звукоснимателя грифа (как и у оригинальных Esquires).

Электроника простой, но эффективный. Трехпозиционный переключатель в положении шеи обходит регулятор тембра и включает предустановленные басы тон. В среднем положении звук и громкость работают в обычном режиме. На мосту положение звук отключен, переводя звукосниматель в прямой режим.Green Label включает в себя Wilkinson Бридж WT3 с компенсированным латунным стволом седла и тюнеры в винтажном стиле. У этого инструмента есть настоящие индивидуальные ощущения и очень резонансный звук, исходящий от избранных пород дерева. и качественная сборка. Включает красивый лад Сумка King Gig.

Серийный номер: 01687

Вес: 6 фунтов. 9 унций.

Обзор продукта

«После просмотра Джеффа Бека и` Yardbirds ‘ в 60-х его Esquire® был гитару я хотел больше, чем любую другую.»Наглость человека, взявшего кофемолку на пластинчатую гитару ‘Holy Grail’ было просто здорово! «
» Эта настоящая гитара теперь живет у моего друга Сеймура. Коллекция Дункана, но у меня была возможность провести с ней некоторое время, и в результате получился Fret-King Green Label Country Squire Yardbird. «
» Общеизвестно, что передняя часть гитары была очерчена фаской на предплечье, но если вы на самом деле не держали и не играли оригинальная гитара, вы никогда не догадались бы, что на спине также была фаска грудной клетки контур в.»
» Король ладов Ярдберд загружен Сеймуром Дунканом © Broadcaster © repro пикап, озвученный самим мужчиной, а тело даже направлено вперед пикап, если вы захотите установить его позже, как и оригинал. «
» Так же, как оригинал Esquire, трехходовой селектор звукоснимателей на Yardbird фактически является селектором тона. В переднем положении регулятор тембра отключен и предустановленные басы тон, создаваемый пропусканием датчика через два конденсатора и резистор, доступ.»
» С переключателем в среднее положение и тон, и громкость работают как обычно; находясь на последней позиции регулировка тембра отключена, что позволяет звукоснимателю работать напрямую со всеми его мощность и тон. «
» Больше не бывает реальный! »

Технические характеристики

Цвет: Медовая блондинка
Body: Swamp ясень
Гриф: 1шт клен на болтах
Царапина: Есть
Палец Доска: Maple
Масштаб: 25,5 «/ 648 мм
Лады: 22 средних jumbo
Вставки: Черная точка
Ширина верхнего порожка: 1.67 дюймов / 42,5 мм номинал
Гайка: Wilkaloid
Тюнеры: Винтажный стиль
Бридж: Wilkinson WT3
Звукосниматели: 1 шт. Seymour Duncan Broadcaster
Регуляторы: громкость, тон, 3-полосный selector
Включает: Оригинальная сумка Fret-King Gig Bag

Green Label ™

Классический тон дерева, классический тон, классические гитары.

Гитары и бас-гитары Fret-King Green Label изготавливаются вручную под руководством Трева. Под личным наблюдением Уилкинсона в мастерских Fret-King в Великобритании до кропотливости, безупречные стандарты совершенства.

Выпускаемая в очень ограниченном количестве серия Fret-King Green Label олицетворяет совершенство гитарного строительства мирового класса.

Оживленные мастерами-строителями на ощупь и изящество, Green Label представляет собой квинтэссенцию роскоши, зенит качества сборки и воплощение безупречного тона.

Процесс начинается с ручного выбора и сопоставления корины, красное дерево, клен, палисандр, ясень болотный и ольха, классические породы древесины, из которых фундаментальный вклад в стабильность и звучание инструмента.

А если это дерево душа гитары, звукосниматели — это голос. Сыграйте в Fret-King Green Ярлык, и вы узнайте, как каждый звукосниматель и его конфигурация тщательно сочетаются с конструкция каждой гитары для получения максимальной комбинации мощности, тона и ясность.

Большое внимание уделяется выбору компонентов, используемых в схема. Соответствие значений потенциометра и использование качественных переключателей и проводов одинаково важен для любого из процессов, используемых для создания окончательного гитара.

И последнее, но не менее важное: оборудование. Имея великолепный вид, отличное звучание гитары просто недостаточно, и после целой жизни, потраченной на исследования тонких различия, мельчайшие детали, материалы и производство могут сделать функциональности, тону и эргономике, Трев Уилкинсон создал то, что признано лучшим оборудованием в мире.

В приборах Green Label каждая часть оборудования была разработана и выбрано для повышения удобства игры, для максимального удобства использования и предназначен для выступления в реальном мире на сцене окружающая среда — все сделано для создания лучших «игроков» гитары в мире.

В Fret-King мы называем Green Label «современный винтаж», все, что вы можно ожидать от самой лучшей винтажной гитары, которую вы только можете найти, с невидимые современные атрибуты, благодаря которым Green Label работает безупречно инструменты.

Как подобрать конкретный рисунок ладов для горных цимбалов — Folkcraft Instruments

Какой лад выбрать?

Еще в ранние годы существования горных цимбалов люди играли в основном в стиле «нотер / дрон». Они часто использовали нотер (небольшую деревянную палочку), чтобы трогать струны мелодии, и играли среднюю и басовую струны всегда «открытыми».Открытый означает «не давить на струну до лада».

Когда преобладал этот стиль игры, лады часто были (едва) достаточно широкими, чтобы проходить под струнами мелодии. Лады не пересекали гриф и не доходили до средней и басовой струн.

В какой-то момент люди начали играть более сложные аккорды и нажимать на среднюю и басовую струны. Поэтому, чтобы приспособить этот более современный стиль «аккорд / мелодия», лады были расширены на всю ширину грифа.

В этот момент широко использовалось множество различных строев, в основном CGG или DAA (первая нота, указывающая на басовую струну).

В 1980-х годах стало популярным играть в настройку DAD. Но … С настроенной мелодической струной, папа, когда играешь первые восемь нот инструмента (начиная с открытой струны), это не мажорная гамма. Таким образом, дополнительный лад был помещен между ладом 6 и ладом 7. Мы называем этот лад 6 1/2 (иногда обозначается как 6.5, 6 * или 6+). Лад на 6 1/2 становился все более и более популярным и к 1990-м годам стал стандартом почти для всех инструментов.

Теперь перенесемся в 2000-е. По мере того, как репертуар игроков становился все более разнообразным, они хотели играть современные песни — популярные произведения, написанные после 1940-х годов. Джаз, блюз, рок, кантри. На инструменте потребовалась еще одна нота, чтобы легко приспособить этот новый репертуар.

Итак, теперь мы добавили лад между 1 и 2. Мы называем его 1 1/2 ладом. Это позволяет нам играть (на струнах D) фа естественно. 95 процентов инструментов, производимых в Folkcraft, имеют 1,5 лада, и с каждым годом он становится все более популярным.

Многие из «профессиональных» игроков имеют 1 1/2 лад (почти у всех сейчас 6 1/2), и их классы онлайн и на фестивалях очень часто включают лад 1 1/2. Во многих выпускаемых книгах и учебных материалах также используется 1 1/2 лад. (Чтобы быть предельно ясным, некоторые из «профи» не приняли лада 1 1/2, а некоторые из них все еще сопротивляются ладу 6 1/2.)

В Folkcraft Instruments мы настоятельно рекомендуем приобрести ваш инструмент. с «лишними» ладами — 1 1/2 и 6 1/2.В наши дни это «стандарт». Если вы не уверены в получении «лишних» ладов, просто сделайте это. Играть на цимбалах не труднее, и вы даете себе больше возможностей для будущей игры.

Когда мы создаем инструмент с ладом 1 1/2, мы автоматически включаем ту же ноту F в верхние октавы с ладами 8 1/2 и 15 1/2. Мы также включаем лад верхней октавы для лада 6 1/2, который является ладом 13 1/2. Мы часто говорим о ладах 1 1/2 и 6 1/2, но «соответствующие» лады верхней октавы автоматически включаются в наши инструменты.

Другой вариант лада — это «полностью хроматический». В этот момент мы играем тот же лад, что и гитара, банджо или гавайская гитара. История создания цимбал начинается с «без лишних ладов», затем добавляется 6 1/2, а затем добавляется 1 1/2, и, кажется, идет устойчивый марш к добавлению все большего и большего количества ладов.