Отзывы о товаре

Обзоры

Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

e6c625dd3ef6f34ec3f5d10ef1675de4

Добавление в корзину

Код для заказа:

Доступно для заказа:

Кратность для заказа:

Отменить

Товар успешно добавлен в корзину

!

В вашей корзине на сумму

Закрыть

С 21 по 25 сентября автомобили LADA будут представлены на XI Тольяттинском автосалоне

Автомобили LADA будут представлены на объединенном стенде дилеров ОАО »АВТОВАЗ» площадью 500 кв.м. Таким образом, в экспозиции примут участие более тридцати тольяттинских предприятий сервисно-сбытовой сети.

На закрытой площадке посетители смогут увидеть все модели семейства LADA KALINA, седан и хэтчбек LADA PRIORA, спортпрототип LADA Revolution, автомобиль LADA 110 в комплектации »люкс», LADA 112 COUPE и две тюнинговые модификации LADA 112.

Закрытую экспозицию дополняет открытая площадка, на которой будут представлены специальные автомобили на базе моделей LADA. Дочернее предприятие АВТОВАЗа ОАО ПСА »БРОНТО» выставит внедорожники »МАРШ» и »МАРШ-2», а также бронированный мини-вэн LADA 2120 ИНКАС и автомобиль повышенной защищенности LADA 21218 ФОРС. Кроме того, партнер автозавода — ООО »Моторика» — представит полноприводный пикап LADA 2329 и медицинский автомобиль LADA 2131 »Скорая помощь». Также посетители увидят два автомобиля, собранные в опытно-промышленном производстве ОАО »АВТОВАЗ», — пятидверную LADA NIVA и мини-вэн LADA 2120.

В 2004 году в юбилейном X автосалоне приняли участие 109 компаний из 20 городов страны. Выставку посетили более 17 000 человек.

Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.

Стеклоподъемник ВАЗ 21218-6104008-82 4х4 Urban, 21213, 2131 перед. правый. с мотор. реечный. СБ ДЗС

Стеклоподъемник ВАЗ 21218-6104008-82 4х4 Urban, 21213, 2131 перед. правый. с мотор. реечный. СБ ДЗС

Купить Стеклоподъемник ВАЗ 21218-6104008-82 4х4 Urban, 21213, 2131 перед. правый. с мотор. реечный. СБ ДЗС
Рассчитать стоимость доставки по России или получить консультацию 
Вы можете по телефону (495) 960 94 60 или в онлайн консультанте на сайте https://lada-autodetal.ru/

Нива удлиненная 3 х дверная 21218

Каждый автомобиль имеет свою историю. ВАЗ-21218, детище фирмы Бронто из Тольятти, в этом смысле не исключение, а обстоятельства, при которых эта машина появилась на свет, весьма интересны.

Я рисую, я тебя рисую.

Все началось ровно пять лет назад. Теплым летним вечером два приятеля, работавшие в одном из подразделений ВАЗа, собрались обсудить некоторые производственные проблемы. Дело было вот в чем. При изготовлении ходовых макетов новой Нивы остались бесхозными два кузовных обрезка. Макеты задумывались длиннее стандартного автомобиля, и поэтому кузова для них сваривались из двух серийных половинок. Вещь, которая явно «плохо лежала», не давала друзьям покоя и требовала достойного применения.

Совершенно случайно один из героев нашего рассказа вспомнил, что в истории авиации был случай, когда фюзеляж очень хорошо зарекомендовавшего себя самолета Douglas DC-8 удлинили на целых 7 метров, создав тем самым новую модификацию. Если удлиняют самолеты, почему бы не попытаться «раздвинуть» серийный джип?

Масла в огонь подлила только что привезенная из Германии модель-копия автомобиля Matra Simca Rancho — она-то и послужила идеологическим прототипом будущей конструкции.

Надо сказать, что наши герои не относились к разряду трепачей и поэтому сразу же взялись за эскизную проработку своего проекта.

Номерной знак «проба» говорит сам за себя: перед вами —один из первенцев семейства «горбушек»

Я ТЕБЯ СЛЕПИЛА ИЗ ТОГО, ЧТО БЫЛО

Колесную базу серийной Нивы решили удлинить на 300 мм. Этим «убивались» сразу два зайца: во-первых, увеличение длины салона позволяло выдвинуть заднее сиденье из зоны колесных арок и получить возможность размешать на нем троих пассажиров. А во-вторых, автоматически решалась проблема с комфортом: сидяшие сзади имели теперь в своем распоряжении гораздо больше места. Вырос и багажник.

Для увеличения объема кузова крышу за линией передних сидений сделали более высокой, и дабы максимально эффективно использовать то, что получилось, было решено сделать машину семиместной, снабдив ее двумя откидными сиденьями — как на УАЗе. Крыша приподнятой части кузова должна была быть съемной, а взамен стандартных бамперов на машину установили два оригинальных «кенгурятника».

Слова «спонсор» в те времена еще не знали, а организацией, решившейся сделать серьезные вложения в новый проект, стал только что созданный Ладабанк. Заручившись его поддержкой, весной 1991 года ребята приступили к работе с металлом.

Первый кузов нового автомобиля имел двойные двери задка распашного типа, которые раскрывались до самого пола. Позже от этой конструкции, так же как и от идеи семиместного автомобиля, отказались, решив остановиться на пятиместном варианте.

Из-за характерного внешнего вида машины стали называть «горбушками» и за два года их было создано шесть. При регистрации (первые машины по документам проходили как самоделки) встал вопрос о названии. Вариантов было несколько, а первые служебные автомобили Ладабанка (он то и приобрел «горбушки») были зарегистрированы в ГАИ под именем Сахара. За это время машины набегали не один десяток тысяч километров, причем по самым разным дорогам и главное, что именно эти самые «горбушки» стали родоначальниками нового семейства Нив самой различной дчины — начиная от ВАЗ-2129 и заканчивая Консулами.

ОТ «ГОРБУШКИ» К ВАЗ-21218

Как вы уже наверное догадались, при создании машины ВАЗ-21218 были использованы ключевые конструктивные особенности «горбушек»: удлиненный салон, более вместительный багажник, трехместное заднее сиденье, высокая съемная крыша в задней части кузова. А еще у кузова новой машины увеличили размер дверного проема.

Конструктивная преемственность не случайна: один из создателей «горбушек» стал руководителем производства специальных автомобилей на фирме Бронто и решил выпускать свое детище на более высоком технологическом уровне. Кроме этого, на основе шасси нового автомобиля был создан инкассаторский броневик — ВАЗ-212182.

Как мы уже сказали, кузов здесь раздвинут на 300 мм, причем за счет дверного проема. Облицовка двери цельноштампованная, а крыша в задней части кузова имеет большой вырез, усиленный расфланцовками. Закрыт этот вырез специальной съемной панелью, похожей на большой люк.

Силовой агрегат машин — серийный, «двеститринадцатый», однако на броневик устанавливается и дизель Peugeot.

Единственное отличие в трансмиссии — карданный вал. По понятным причинам его пришлось делать оригинальным: к длинной трубе приварили серийные фланцы.

Подвеска «двестивосемнадцатой» стандартная, а броневик имеет более жесткие пружины и амортизаторы с измененными характеристиками.

Из особенностей комплектации обеих машин отметим наличие защитных дуг, декоративных бамперов, автоматической системы пожаротушения и кондиционера в салоне.

СНАРУЖИ И ВНУТРИ

С первого взгляда отличие от стандартной машины найти трудновато. Какое-то изменение чувствуется, но вот уловить его непросто. И только детально «ощупав» машину взглядом, начинаешь понимать, что весь дизайнерский «удар» взяла на себя дверь: нюансы внешнего вида автомобиля часто определяются именно габаритами дверного проема.

Приподнятая крыша в задней части кузова является удачной находкой — она здорово скрадывает вытянутость кузова.

О «кенгурятнике» разговор особый. Сделан он из. пластика и своим видом без сомнения добавляет машине солидности. Особенно эффектно он смотрится на броневике, удачно сочетаясь с разделенным на две половинки ветровым стеклом. Применительно к бронемашине на «кенгурятник» может устанавливаться элемент дополнительного бронирования моторного отсека.

Вроде бы та же Нива. Тем не менее, внешний вид машины стал заметно интересней

Запасное колесо у ВАЗ-21218 может располагаться как на откидном кронштейне заднего бампера, так и на своем штатном месте; запаска броневика размещается в небольшом пространстве между задней бронированной плитой и дверью задка. Здесь же уместились дублирующая аккумуляторная батарея и инструмент.

Теперь — внутрь. Вход (именно так здесь можно называть процесс проникновения в зону задних пассажиров) здесь ощутимо удобнее, при этом сидящие впереди могут не покидать своего места — им достаточно немного отклониться вперед.

Но вот у водителя и переднего пассажира появилась небольшая проблема: мало того, что за ремнем безопасности теперь приходится сильно тянуться, пользоваться им могут только высокие люди, с «дальней» посадкой; в противном случае длины штатного ремня просто не хватает. Решение этой проблемы уже найдено — нижняя точка крепления ремней будет располагаться на специальной плавающей скобе.

На броневике из положения вышли еще оригинальнее — ремень крепится прямо на двери.

ПО ДОЛИНАМ И ПО ВЗГОРЬЯМ

Наш первый заезд на машинах фирмы Броню состоялся по разбитой, ухабистой дороге.

Плавность хода оказалась на голову выше, чем у серийной «коротышки»: машина идет заметно мягче, плавней, не «козлит». Казалось бы, всего-навсего 300 миллиметров, а какая разница! Нет, Ниву в этой машине не узнать. Уверенно пересекаем под острым углом мелкую, скользкую колею, при этом никаких тебе рысканий и рывков задней осью в сторону. Замечательно!

Теперь посмотрим, как автомобиль преодолеет земляной вал под углом. Встали! Все правильно — «диагональные» колесики буксуют. Бесплатных пряников не бывает: увеличение колесной базы не могло не сказаться на геометрической проходимости.

Наличие кондиционера в инкассаторском броневике продиктовано спецификой эксплуатации

Внешний вид ВАЗ-212182 после обстрела на полигоне. Крепость не сдалась

Н екоторые технические характеристики автомобилей (данные производителя)

Теперь — на асфальт.

И здесь нас поджидали сюрпризы. По плавности хода «двести восемнадцатую» можно смело приравнивать к легковому автомобилю. Исчезла продольная раскачка кузова, при проезде неровностей не стало характерных для Нивы резких толчков на заднем сиденье.

А что с управляемостью? Типичные для Нивы реакции на управляющие действия в принципе остались, но они как бы растянулись, размазались. Надо сказать, что машина очень здорово держится в повороте, а-в критических режимах начинает ровно сползать всеми колесами наружу. При добавлении газа в повороте автомобиль «распрямляет» траекторию, а при сбросе легко «заныривает» внутрь. Происходит это все мягко, ровно, а главное — прогнозируемо.

На разгонной и тормозной динамике автомобиля останаливаться не будем — здесь все на уровне серийного BA3-21213.

Машина понравилась. Если зрительно она почти не отличима от Нивы, то по управляемости и плавности хода она ушла вперед. При этом автомобиль обладает весьма незаурядной проходимостью, отставая от серийной Нивы только в вопросах, связанных с предельными внедорожными ситуациями.

Это своеобразный экспресс-отчет о новинке. В ближайшее время мы постараемся провести сравнительный тест трех вариантов Нивы — короткой BA3-21213, средней — 21218 и длинной — 2131 и рассказать об их основных потребительских отличиях.

П. АБСОЛЮТОВ. Фото и рисунки из архива автора

Видео

Нива — советский и российский легковой автомобиль повышенной проходимости. Это внедорожник с несущим кузовом и постоянным полным приводом получил популярность не только у нас, но и за рубежом. Автомобиль выделяется невысокой стоимостью, высокой проходимостью и простотой обслуживания.

Показать на фото все модификации Нивы очень тяжело, т.к. список очень широкий, а часть модификаций вообще не получили своего дальнейшего развития. Далее вы можете увидеть все популярные модели Нивы на фото:

1. ВАЗ 21212. Экспортная Нива главная особенность которой — правый руль.
2. ВАЗ 2122.600 «Река». Нива с герметичным в нижней части кузовом. По непонятным причинам автомобиль на конвейер не попал.
3. ВАЗ 21215. Нива с дизелем от Peugeot модели XUD 9SD. Выпуск автомобиля был с 1999 по 2008 год.
4. ВАЗ 2121Ф. Отличительные особенности этой Нивы в том, что спереди располагались два кресла, а сзади цельнометаллический фургон.
5. ВАЗ 21218 Фора. Удлиненная на 300 мм версия ВАЗ-21213. Мелкосерийно производилась с 1996 до 2005 года фирмой «ПСА БРОНТО». Отличается от базовой модели увеличенными по ширине дверьми и дверными проёмами, приподнятой за счёт пластиковой надстройки задней частью крыши и более широким задним трехместным сиденьем типа 2108. Колёса увеличенного диаметра, поэтому запаска вынесена из моторного отсека и закреплена над задним бампером.
6. ВАЗ 212182 Форс. Нива для инкассаторов. В ходе модификаций масса кузова была увеличена на 430 кг, поэтому пришлось усиливать подвеску. Также автомобиль имел автоматическую систему пожаротушения, а также защищенный топливный бак.
7. ВАЗ 212183 Ландоле. Особенность модели в наличии силового каркаса безопасности. Дверей нет, а задний борт откидывается вниз. Салон из кожзама, а на полу линолеум, что позволяло мыть салон из садового шланга.
8. ВАЗ 2131. Модификация ВАЗ-21213, отличающаяся удлинённой на 500 мм. колёсной базой и 5-дверным кузовом с дополнительной парой задних боковых дверей.
9. ВАЗ 2329. Четырехместный пикап на базе ВАЗ 2129 имеет 2700 мм. в колесной базе и обладает грузоподъемностью в 650 кг. Имеет оригинальный задний диван, который складывается «в пол». Имеет дополнительный топливный бак.
10. ВАЗ-21213 Тайга. Особенность этой Нивы в длинной крышке багажника. Также установлена новые задние фонари, карбюратор «Солекс» и бесконтактное зажигание. Мотор 1,7 литра.
11. ВАЗ 2328 Волк. Двухместный пикап, созданный на базе популярного внедорожника ВАЗ 2121. Годы выпуска: 1995 — 1997.
12. Lada 4×4 «Tsarina» ‘2012. Данный автомобиль имел ограниченную серию для рынка Франции в честь 35-летия модели.
13. Lada 4?4 Niva «St-Tropez». Первое поколение Lada Niva Saint-Tropez выпускалось с 1984 по 1987 год и получило обвес весьма своеобразного дизайна под авторством Patrick Giraud. Второе поколение отличалось другим обвесом.
14. ВАЗ-2121 Auviga. В начале 90-х годов ХХ века литовской фирмой Auviga был изготовлен необычный автокемпинг на базе «Нивы». Изюминка конструкции заключалась в ее модульности – жилая надстройка имела собственную ось и вся эта конструкция жестко при помощи болтового соединения крепилась к базовому шасси, легко от него отстыковываясь в случае необходимости. Отсоединенный жилой модуль опирался спереди на специальные опоры, придававшие ему устойчивость.

Напомним, что в настоящее время выпускается очередная модификация Нивы — Нива Урбан.

Ключевые слова: лада нива урбан

Компания «Бронто» занималась производством специальных автомобилей. Фирма разрабатывала бронированные машины для нужд инкассаторов. Назывались они «Форс» и были изготовлены на базе ВАЗ-2121. Бронто-мобили тогда были в автопарках всех уважающих себя банков. Но компания на этом не остановилась и после успешной разработки машины для банков занялась расширением гаммы. Был выпущен снегоболотоход под названием «Марш» и удлиненная на 300 мм «Нива Фора». Вместе с «Маршем» и «Форсом» «Фору» в 1997 году показывали на автосалоне в Москве. Модель тогда очень заинтересовала любителей внедорожников. После этого «Бронто» получает сертификат на продажу «Форы». Если кратко, то «Фора» представляет собой тот же «Форс», но без брони на кузове (так называемая гражданская версия). Рассмотрим особенности этого автомобиля.

Так в чем же «Фора» способна дать фору традиционной «Ниве»? Прежде всего — в комфорте. Если ее передние сиденья остались на своем месте, то задние благодаря возросшей длине кузова сместились на 150 мм назад. Еще 150 мм дополнил багажный отсек, который у «Нивы» вызывал много нареканий из-за малой вместимости. Колесные арки у «Форы» «уехали» назад дальше заднего сиденья и теперь не стесняют его пассажиров по бокам. Это позволило установить в автомобиле вместо стандартного двухместного полноценный трехместный диван, заимствованный у «восьмерки», а заодно было решено взять от нее и передние сиденья, избавившись тем самым от менее удобных, применяемых на «Нивах». Более того, задние пассажиры «Форы» ощутят дополнительный простор не только в локтях, но и над головой.

Дело в том, что в процессе удлинения кузова в крыше над его задней частью вырезается довольно большой люк, накрываемый сверху увеличенной по высоте пластиковой накладкой. В общем, пространство для задних пассажиров увеличено в «Форе» в трех измерениях. Более того, для задних пассажиров облегчен процесс посадки-высадки за счет более крупного дверного проема. Конечно, это не приравнивает «Фору» к моделям со второй парой дверей, но все же облегчает доступ к заднему сиденью.

Впрочем, неверно было бы утверждать, что комфорт ВАЗ-212180 в сравнении с «Нивой» повышен только за счет «восьмерочных» сидений и увеличения пространства для головы и ног. Теория, подтвержденная практикой, гласит, что у автомобилей с большей колесной базой лучше плавность хода. Этот закон автомобилестроения верен и для «Форы», обскакавшей «Ниву» настолько, что этого оказалось достаточно, чтобы, как говорится, почувствовать разницу. Кроме этого, возросшее расстояние между передним и задним мостами автомобиля улучшило его устойчивость и управляемость, а это дополнительный балл в копилку пассивной безопасности. Конечно, удлинение колесной базы не могло не повлечь увеличения радиуса поворота и некоторого снижения вездеходных качеств, однако можно смело утверждать, что эти изменения несущественны по сравнению с приобретенными достоинствами.

Автомобиль этот очень интересен. И несмотря на то, что его больше не выпускают, модель пользуется спросом у любителей.

Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK, исследованных с разрешением

Мембранные микродомены («липидные рафты»), обогащенные гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) -зависимыми белками, гликосфинголипидами и холестерином, участвуют в событиях, варьирующихся от переноса через мембрану до передачи сигнала. Хотя существуют биохимические доказательства наличия таких микродоменов мембран, они не были визуализированы с помощью световой или электронной микроскопии.Чтобы исследовать микродомены, обогащенные GPI-заякоренными белками в интактных клеточных мембранах, мы использовали новую форму цифровой микроскопии, визуализацию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), которая расширяет разрешение флуоресцентной микроскопии до молекулярного уровня (<100 Å). Мы обнаружили значительную передачу энергии между меченными донорами и акцепторами антителами против GPI-заякоренного протеина 5'-нуклеотидазы (5'-NT) на апикальной мембране клеток MDCK. Эффективность передачи энергии сильно коррелировала с поверхностной плотностью меченного акцептором антитела.Данные FRET соответствовали теоретическим предсказаниям для двумерного FRET между случайно распределенными молекулами и не соответствовали модели, в которой 5'-н.э. Хотя мы не можем полностью исключить возможность того, что некоторые 5'-NT находятся в кластерах, данные подразумевают, что большинство молекул 5'-NT случайным образом распределяются по апикальной поверхности клеток MDCK. Эти находки ограничивают существующие модели липидных рафтов и мембранную организацию GPI-заякоренных белков.

Гликозилфосфатидилинозит (GPI) ¹ -якорные белки прикреплены к бислою мембраны с помощью комплексного якоря, состоящего из фосфоэтаноламина, гликанов и липида фосфатидилинозитола (Low, 1989).В биологических мембранах GPI-заякоренные белки, как полагают, находятся в микродоменах мембран (также известных как «рафты» или нерастворимые в детергенте, обогащенные гликолипидом комплексы), которые обогащены гликосфинголипидами (GSL) и холестерином (обзоры см. В Simons and van Meer , 1988; Лисанти и Родригес-Булан, 1990; Саймонс и Вандингер-Несс, 1990; Хардер и Саймонс, 1997; Саймонс и Иконен, 1997). Было высказано предположение, что эти микродомены важны для апикальной сортировки GPI-заякоренных белков в поляризованных клетках (Brown et al., 1989; Лисанти и др., 1989; Lisanti and Rodriguez-Boulan, 1990) и для внутриклеточной передачи сигналов после перекрестного связывания GPI-заякоренных и трансмембранных белков (Lisanti et al., 1994; Field et al., 1997; Harder and Simons, 1997; Simons and Ikonen, 1997). .

Доказательства мембранных микродоменов получены в биохимических экспериментах, в которых дифференциальная растворимость мембранных белков и липидов в детергенте используется в качестве критерия для определения микродомена (Стефанова и др., 1991; Браун и Роза, 1992; Sargiacomo et al., 1993; Arreaza et al., 1994). Однако другие исследования показывают, что белки и липиды, обладающие общим свойством нерастворимости детергентов, не обязательно связаны в интактных клеточных мембранах (Kurzchalia et al., 1995; Mayor and Maxfield, 1995; Schnitzer et al., 1995, 1996; Hannan and Edidin). , 1996). Кроме того, электронная и флуоресцентная микроскопия интактных клеток обычно не обнаруживают мембранные микродомены, обогащенные GPI-заякоренными белками. В ранних работах, визуализирующих кластеры GPI-заякоренных белков, использовались вторичные антитела (Rothberg et al., 1990), которые сами по себе могли вызывать перекрестное связывание (Mayor et al., 1994; Fujimoto, 1996). Исследования также показывают, что в стабильном состоянии, в отсутствие перекрестного связывания, GPI-заякоренные белки случайным образом распределяются в плазматической мембране (Parton et al., 1994; Rijnboutt et al., 1996). Этот результат согласуется с работой нашей лаборатории с использованием биофизического метода флуоресцентной резонансной микроскопии с переносом энергии (FRET). Хотя FRET может обнаруживать близость молекул, мы не нашли доказательств наличия FRET между мечеными GPI-заякоренными белками в стационарных условиях (Hannan et al., 1993). Недавно Хардер и Саймонс (1997) попытались разрешить эти несопоставимые результаты, предположив, что нерастворимые домены, выделенные экстракцией детергентом, представляют собой слитые микродомены неизвестного размера, морфологии и состава. С этой точки зрения, методы, основанные на микроскопии, не могут обнаружить микродомены в неповрежденных клеточных мембранах, потому что домены представляют собой небольшие динамические структуры, которые находятся ниже предела разрешения микроскопа.

Продолжающееся несоответствие между очевидным обогащением GPI-заякоренных белков мембранными микродоменами, о котором сообщают биохимические методы, и случайным стационарным распределением этих белков, полученным с помощью микроскопии, привело нас к использованию нового метода, визуализации FRET, для критического пересмотра устойчивого -состояние мембранной организации GPI-заякоренного белка.Визуализация FRET сочетает в себе цифровую иммунофлуоресцентную микроскопию с FRET, феноменом, который сообщает о близости между молекулами в масштабе 1–10 нм. Таким образом, визуализация FRET увеличивает разрешение обычной иммунофлуоресцентной микроскопии до молекулярного уровня и, таким образом, позволяет количественно оценить молекулярную близость в интактных клеточных мембранах (Herman, 1989; Jovin and Arndt-Jovin, 1989 a , b ; Tsien et al. ., 1993; Uster, 1993; Selvin, 1995). Визуализация FRET отображает передачу энергии между интересующими молекулами по отдельности, что является значительным прогрессом по сравнению с нашим предыдущим микроскопическим методом FRET, который измерял средний FRET для популяции клеток (Hannan et al., 1993). Сравнивая экспериментальные значения FRET с теоретическими предсказаниями для случайно распределенных молекул, визуализация измерений FRET может использоваться для вывода об организации молекул — сгруппированных или случайно распределенных — в клеточных мембранах. Следовательно, визуализация FRET должна быть способна обнаруживать обогащение GPI-заякоренных белков в мембранных микродоменах, слишком малых для разрешения световой микроскопии, пока GPI-заякоренные белки в домене находятся в пределах <100 Å друг от друга.

В этом исследовании мы оцениваем стационарное распределение GPI-заякоренного белка, 5′-нуклеотидазы (5′-NT), в апикальной плазматической мембране трансфицированных клеток MDCK.Нерастворимые в детергенте комплексы, содержащие GPI-заякоренные белки и GSL, были впервые идентифицированы в клетках MDCK (Brown and Rose, 1992), и эта клеточная линия широко использовалась в исследованиях сортировки белков (Simons and Ikonen, 1997). 5′-NT (CD73) представляет собой эктофермент массой 70 кДа, который катализирует гидролиз 5′-АМФ до аденозина (для обзора см. Zimmermann, 1992). 5′-NT обогащен нерастворимыми в детергенте комплексами в нескольких различных клеточных системах (Mescher et al., 1981; Schnitzer et al., 1995; Strohmeier et al., 1997), иногда обнаруживается кластерами с помощью иммуноэлектронной микроскопии (Howell et al., 1987), и при перекрестном связывании антител может запускать внутриклеточные сигнальные события в некоторых типах клеток (Airas et al., 1997; Resta and Thompson, 1997). .

Чтобы увидеть, распределяется ли 5′-NT случайным образом на апикальной мембране клеток MDCK, или он обогащен мембранными микродоменами, мы объединили визуализацию FRET с теорией, ранее разработанной для двумерной FRET.FRET между мечеными молекулами 5′-NT должен быть обнаружен независимо от того, сгруппированы ли они в микродомены мембраны, поскольку FRET может также возникать между случайно распределенными молекулами, имеющими высокую поверхностную плотность. Однако теория FRET между донорами и акцепторами в мембране позволяет нам различать сгруппированные молекулы 5′-NT, случайно распределенные молекулы 5′-NT и их смеси. Как и ожидалось, мы обнаружили FRET в стационарных условиях. Взаимосвязь между степенью FRET, поверхностной концентрацией 5′-NT и пропорциями донорных и акцепторных меток указывает на то, что большинство, если не все 5′-NT-молекулы распределены случайным образом и не группируются или не ограничиваются липидными рафтами.

Полноразмерная кДНК 5′-NT из печени крысы (клон pcNT341) была щедрым подарком д-ра Я. Икехары (Misumi et al., 1990). pcNT341 был вставлен в сайт EcoRI pCB6 (Brewer, 1994), модифицированный так, чтобы он содержал часть сайта мультиклонирования Bluescript. Клетки MDCK (тип II) трансфицировали с использованием метода осаждения фосфатом кальция (Weisz et al., 1992) и отбирали в среде, содержащей 500 мкг / мл G418 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).Положительные клоны выделяли с использованием колец для клонирования и проверяли с помощью непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии. Затем один из положительных клонов субклонировали путем сортировки клеток с последующим посевом при предельном разведении нетрансфицированными клетками.

После клонирования клетки поддерживали в DME (GIBCO BRL, Гейтерсбург, Мэриленд) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (INTERGEN Co., Purchase, NY), заменимых аминокислот (GIBCO BRL) и 300 мкг / мл G418.Семена размножения пассировали при разведении 1:50 каждые 4–6 дней. Клетки для экспериментов высевали на стерильные покровные стекла в разведении 1: 5 (~ 1 × 10 ⁶ клеток / 10-см планшет, шесть покровных стекол / планшет, переносили в шестилуночные чашки на следующий день) и выращивали до слияния (2 –5 г). Для экспериментов по биотинилированию клетки высевали на фильтры (вставки для культур клеток Falcon HD, шестилуночный формат, размер пор 0,4 мкм; Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) при плотности ~ 1 × 10 ⁶ клеток.Там, где указано, экспрессия 5′-NT усиливалась инкубацией в течение ночи в среде, содержащей 10 мМ бутирата натрия, перед экспериментом.

Клетки на покровных стеклах метили в течение 15 мин при 4 ° C с помощью 100 мкл смеси антител, меченных донором (Cy3) и акцептором (Cy5). Во всех экспериментах антитела разводили в PBS с добавлением 0,9 мМ CaCl ₂ , 0,52 мМ MgCl ₂ и 0.16 мМ MgSO ₄ (PBS ⁺⁺ ), содержащий 1% BSA. Клетки промывали дважды в течение 5 мин в PBS ⁺⁺ при 4 ° C. Затем клетки фиксировали в течение 30 мин при комнатной температуре в 4% формальдегиде в PBS ⁺⁺ , свежеприготовленном из 16% раствора формальдегида (Electron Microscopy Sciences, Форт Вашингтон, Пенсильвания). Наконец, покровные стекла помещали на предметные стекла в PBS, используя куски ленты толщиной 50 мкм, чтобы удерживать покровные стекла от предметного стекла, а затем закрывали лаком для ногтей.Обратите внимание, что мы решили зафиксировать клетки перед измерениями под микроскопом, чтобы предотвратить потенциальную реорганизацию белков в ходе экспериментов. К этому моменту в экспериментах, в которых клетки метили конъюгированными с флуорофором первичными антителами (IgG), а затем переводили на 37 ° C на 30 мин, метка выглядела более «пятнистой», чем в контроле, который фиксировали немедленно.

Если не указано иное, концентрацию Cy3-конъюгированного антитела поддерживали постоянной на уровне 50 мкг / мл в каждой смеси, и Cy5-конъюгированное антитело добавляли для получения указанного молярного отношения донора к акцептору (D: A).В контрольных экспериментах концентрация насыщающих антител была определена как ~ 200 мкг / мл. Таким образом, в экспериментах FRET общая концентрация антител варьировалась от субнасыщающей до насыщающей. Экспериментально измеренное отношение флуоресценции донора к акцептору было прямо пропорционально D: A, нанесенному на клетки.

В экспериментах по измерению FRET между первичными и вторичными антителами клетки метили 50 мкг / мл Cy3-5NT4-2 IgG, как указано выше, дважды промывали в PBS ⁺⁺ в течение 5 минут при 4 ° C, инкубировали в течение 15 минут при 4 ° C. 4 ° C с 5 или 50 мкг / мл вторичного антитела, меченного Cy5 (ослиные антимышиные H + L, соотношение краситель / белок ∼1.6; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), снова промыли и сразу же зафиксировали. Количество связавшегося вторичного антитела Cy5 увеличивалось только примерно в два раза в зависимости от его относительной интенсивности флуоресценции, несмотря на 10-кратную разницу в концентрации.

Когда вторичное антитело использовали для перекрестного связывания меченого 5′-NT, клетки метили указанным D: A IgG 5NT4-2, как указано выше, а затем дважды промывали PBS ⁺⁺ в течение 5 минут при 4 ° C.Затем клетки инкубировали в течение 15 минут при 4 ° C в присутствии или в отсутствие 10 мкг / мл немеченого вторичного антитела (ослиные антимышиные H + L; Jackson ImmunoResearch Laboratories). После промывки, как и раньше, клетки, меченные без вторичных антител, немедленно фиксировали. Клетки, меченные в присутствии вторичных антител, либо фиксировали сразу, либо инкубировали при 37 ° C в течение 15 мин перед фиксацией.

В экспериментах по экстракции детергента клетки метили в течение 15 минут при 4 ° C с помощью 1: 1 D: A 5NT4-2 IgG, после чего следовала 30-минутная инкубация при 4 ° C либо в PBS ⁺⁺ , либо в PBS. ⁺⁺ , содержащий 1% Triton X-100.Затем клетки кратковременно промывали холодным PBS ⁺⁺ и фиксировали в 4% формальдегиде, как указано выше.

FRET широко используется в качестве спектроскопического инструмента для обнаружения молекулярных взаимодействий и молекулярной близости в растворе, а также в мембранах. {6}].\ end {уравнение *}

Например, когда r = R _o , E составляет 50%, а когда r = 2 R _o , E составляет 1,5%. Значение R _o зависит от относительной ориентации донора и акцептора, интервала перекрытия между спектром излучения донора и спектром возбуждения акцептора и квантового выхода флуоресценции донора.В наших экспериментах в качестве донора использовался Cy3, а в качестве акцептора — Cy5. R _o для этой пары донора и акцептора было рассчитано как 50 Å (Bastiaens and Jovin, 1996), принимая фактор ориентации κ ² , равный 2/3 (Dale et al., 1979). Для этого значения R _o , когда r = 50 Å, E составляет 50%, а когда r = 100 Å, E составляет 1,5%.

Экспериментально FRET можно обнаружить несколькими способами.Перенос энергии вызывает тушение донорной флуоресценции и сенсибилизированной флуоресценции акцептора. Это также сокращает срок жизни донора и снижает скорость необратимого фотообесцвечивания донора (Clegg, 1995, 1996). Для измерения всех этих событий были разработаны методы визуализации FRET. Описанные на сегодняшний день методы измерения передачи энергии после фотообесцвечивания доноров (Kubitscheck et al., 1991, 1993; Hannan et al., 1993; Damjanovich et al., 1995; Gadella and Jovin, 1995; Jurgens et al., 1996), вариации на флуоресценцию сенсибилизированных акцепторов (Uster, Pagano, 1986; Adams et al., 1991; Bacskai et al., 1993; Kam et al., 1995), тушение донора (Kindzelskii et al., 1994; Xue et al., 1994; Bastiaens, Jovin, 1996; Bastiaens et al., 1996; Kindzelskii et al., 1996) и продолжительность жизни донора ( Oida et al., 1993).

В настоящем исследовании FRET был измерен с использованием метода, разработанного для лазерного конфокального микроскопа (Bastiaens and Jovin, 1996; Bastiaens et al., 1996), модифицированного нами для использования с обычным микроскопом с дуговой лампой (Kenworthy and Edidin, 1997). .В этом методе образцы метят смесью антител, конъюгированных с донором и акцептором, и перенос энергии детектируется как увеличение флуоресценции донора (уменьшение гашения) после полного фотообесцвечивания акцепторного флуорофора. Преимущество этого метода заключается в том, что все параметры, необходимые для количественного определения E , могут быть получены из одной и той же области клеток, что устраняет необходимость корректировать различия в количестве донорских антител, связанных в образцах, отдельно помеченных донором и акцептором (или только с донором) или для определения спектральных поправочных коэффициентов, необходимых для количественной оценки измерений флуоресценции сенсибилизированного акцептора (Jovin and Arndt-Jovin, 1989, a , b ).Достоверность использования декхеншинга донора для количественной оценки FRET зависит от того факта, что единственный фактор, который может привести к различию в флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора, — это перенос энергии.

Чтобы количественно измерить E с помощью этого метода, акцептор должен быть достаточно фотолабильным, чтобы его можно было полностью обесцветить, а флуоресценция донора не должна значительно исчезать, пока изображения получаются в присутствии и в отсутствие акцептора.Клетки, меченные Cy5-конъюгированным IgG, использовали для определения минимального времени, необходимого для полного обесцвечивания Cy5. Обычно Cy5 полностью фотообесцвечивается за 7 минут или меньше непрерывного возбуждения дуговой лампы с использованием набора фильтров Cy5 и дополнительного длиннопроходного фильтра 570 нм в тракте возбуждения. В этих условиях обесцвечивалось более 97% Cy5, и ни один Cy3 не отбеливался в контрольных образцах, меченных только Cy3 IgG. (В отсутствие длиннопроходного фильтра небольшое количество Cy3 было обесцвечено во время отбеливания Cy5.Это показывает, что Cy3 достаточно стабилен, чтобы позволить количественное сравнение флуоресценции донора до и после фотообесцвечивания акцептора. Обратите внимание, что в этих экспериментах Cy5 был обесцвечен со всего поля клеток.

Для проведения эксперимента по визуализации FRET образцы метили антителами, конъюгированными с Су3 и Су5, в указанных молярных соотношениях, как описано выше. Первоначальное изображение флуоресценции Cy3 (в присутствии антител, конъюгированных с Cy5) получали с использованием набора фильтров Cy3.Изображение флуоресценции Cy5 получали с использованием набора фильтров Cy5 и дополнительного длиннопроходного фильтра 570 нм в тракте возбуждения, а затем образец непрерывно освещали в течение 7 мин. Затем было получено изображение флуоресценции Cy5 после фотообесцвечивания (<3% от начальной интенсивности), длинный фильтр был удален и другое изображение флуоресценции Cy3 было получено с использованием набора фильтров Cy3. Данные были собраны для четырех-пяти различных полей из одного покровного стекла. Интенсивности флуоресценции указаны в произвольных единицах и сопоставимы в рамках данного эксперимента, но их нельзя сравнивать напрямую между экспериментами.

Изображения, отображающие FRET между мечеными молекулами 5′-NT, были рассчитаны по увеличению флуоресценции донора после фотодеструкции акцептора на

\ begin {уравнение *} {\ mathit {E}} (\%) {\ times} 100 = 10 000 {\ times} [(Cy3 \; postbleach-Cy3 \; prebleach) / Cy3 \; postbleach] \ end { уравнение *}

после вычитания вклада темнового тока и корректировки регистрации изображений с использованием алгоритма регистрации индекса Пратта Isee.Коэффициент масштабирования 10 000 использовался для расширения E (который масштабируется от 0–1) до масштаба 12-битных изображений (0–4 096). Таким образом, значение 4096 соответствует E , равному 0,4096, или 40,96%. Для клеток, меченных только донором (D: A = 1: 0), значительного переноса энергии не наблюдалось ( E <2–3%).

Изображения эффективности передачи энергии потенциально можно анализировать попиксельно.Однако, поскольку вариации от ячейки к ячейке в E содержат информацию о распределении 5 ′ NT (см. Ниже), для дальнейшего анализа мы усреднили по интересующим областям размером 40 × 40 пикселей (17,64 мкм ² при 63 × , или 6,97 мкм ² при 100 ×), выбранных из клеток, которые были в фокусе. Для каждой ячейки была выбрана одна интересующая область, и эти области были выбраны так, чтобы они избегали краев ячеек, где иногда возникали артефакты на изображениях эффективности передачи энергии. Средние интенсивности флуоресценции и E были рассчитаны для идентичных представляющих интерес областей для зарегистрированных изображений Cy3 prebleach, Cy5 prebleach, Cy3 postbleach и E изображений.От 10 до 30 представляющих интерес областей были выбраны из каждого поля клеток, так что были взяты образцы клеток, покрывающих полный диапазон уровней экспрессии 5′-NT. В экспериментах, где кластеризация 5′-NT индуцировалась вторичным антителом, данные также собирали с представляющими интерес квадратными областями размером 5 × 5 пикселей для областей на клетках, которые были либо лишены 5′-NT, либо обогащены кластерами. Из-за небольшого размера выборки эти данные были более зашумленными и разбросаны вокруг среднего значения E , полученного с использованием областей выборки размером 40 × 40 пикселей (данные не показаны).

Мы измерили FRET по уменьшению флуоресценции донора после полного фотообесцвечивания акцепторного флуорофора. Данные типичного эксперимента по визуализации FRET показаны на рис. 1. Изображение исходного донора (Cy3) представляет флуоресценцию донора в присутствии акцептора Cy5 (рис. 1, a ). Как и ожидалось, изображение Cy5, полученное до фотообесцвечивания (рис. 1, b ), было идентично изображению Cy3, поскольку для донорной и акцепторной меток использовалось одно и то же антитело.После полного обесцвечивания акцептора (Cy5) (рис. 1, d ) было получено изображение второго донора (Cy3) (рис. 1, c ). Флуоресценция донора (Cy3) в некоторых клетках увеличилась (рис.1, a и c , стрелки ), в то время как в других клетках флуоресценция донора практически не изменилась (рис. 1). , a и c , наконечники стрел ). Повышенная флуоресценция донора после разрушения акцептора указывает на то, что флуоресценция донора гасится в присутствии акцептора из-за передачи энергии.В общем, наибольшее снижение гены наблюдалось в клетках, экспрессирующих наибольшее количество белка.

Изображения E были рассчитаны на основе изображений доноров, полученных до и после фотодеструкции акцептора, с использованием формулы. 2. Вычисленное изображение E для данных фиг. 1 показано на фиг. 2, a . Между мечеными молекулами 5′-NT происходил значительный перенос энергии. Как показано на рис.2 a , E существенно варьировала от клетки к клетке, в этом эксперименте от 10% до более 30%, и была высокой в ​​клетках, экспрессирующих высокие количества 5′-NT на апикальной плазматической мембране.

Вариация от клетки к клетке в E содержит информацию о распределении молекул 5 ‘NT на поверхности клетки (см. Таблицу I, тест 3 ). Чтобы получить эту информацию, мы взяли образцы средних значений E , интенсивности флуоресценции акцептора и интенсивности флуоресценции донора после фотодеструкции акцептора из представляющих интерес квадратных областей размером 40 × 40 пикселей на отдельных клетках (рис.1, c , ящик ). Эта площадь составляет ∼1 / 5 при 63 × или 1/15 при 100 × проекции площади поверхности ячейки ∼100 мкм ² . Взаимосвязь между E и акцепторной флуоресценцией для клеток, показанных на фиг. 1, показана графически на фиг. 2, b . Каждая величина представляет собой среднее значение E и флуоресценцию акцептора, взятую из одной из клеток в поле. Поскольку флуоресценция акцептора (хотя и выражается в произвольных единицах) пропорциональна относительной поверхностной плотности (количеству белков на единицу площади) 5 ′ NT, рис.2 b показывает, что E увеличивается в зависимости от увеличения поверхностной плотности молекул 5 ‘NT.

В зависимости от распределения молекул, меченных донорами и акцепторами, E может зависеть от поверхностной плотности донора и / или акцепторов, степени мечения и D: A (Таблица I и Приложение). В наших экспериментах поверхностная плотность 5′-NT варьировалась от клетки к клетке, поскольку клетки различались по экспрессии белка (рис.1). Поверхностная плотность доноров и акцепторов может быть изменена путем изменения D: A, соотношения меченных донором и акцептором антител, используемых для мечения клеток. Мы ожидали, что для 5′-NT, случайно распределенных на поверхности клетки, передача энергии между помеченными 5′-NT будет масштабироваться с поверхностной плотностью акцептора, независимо от того, как изменялась поверхностная плотность акцептора. То есть мы ожидаем схожие значения передачи энергии для клеток с высокой поверхностной плотностью 5′-NT, но меченных низкой концентрацией конъюгированных с акцептором антител, и для клеток с низкой поверхностной плотностью 5′-NT, но меченных высокой концентрация акцепторного антитела при условии, что поверхностная плотность акцептора одинакова в каждой группе клеток (таблица I, рис.1, 2). Не ожидалось, что передача энергии будет масштабироваться с поверхностной плотностью, если 5 ‘NT были распределены исключительно в кластерах (Таблица I).

На рис. 3 показана экспериментальная зависимость E от D: A, поверхностной плотности донора и поверхностной плотности акцептора. Когда клетки были помечены постоянной молярной концентрацией меченного донором IgG, с увеличением концентрации меченного акцептором IgG для получения D: A в диапазоне от 1: 0.5 к 1: 5. Можно видеть, что для одного D: A перенос энергии увеличивается с увеличением поверхностной плотности 5 ′ NT, измеренной в терминах донорной (рис. 3, a ) или акцепторной (рис. 3, b ) флуоресценции. , и стремилась к нулю в пределе малых поверхностных плотностей. Эта зависимость E от поверхностной плотности несовместима с моделью, в которой вся поверхность 5 ′ NT находится в кластерах (Таблица I).

Для заданной поверхностной плотности донора (рис.3, a ), E увеличилось по мере увеличения D: A с 1: 0,5 до 1: 5. Это видно по раздвоению кривых данных на рис. 3, и . Напротив, для данной поверхностной плотности акцептора (рис. 3, b ) значение E было примерно одинаковым для всех исследованных D: A. Отметим также, что форма экспериментальных кривых была аналогична той, которая была предсказана для случайно распределенных молекул (рис.2), хотя их нельзя здесь напрямую сравнивать, поскольку поверхностная плотность акцептора и r неизвестны (см. Оценку ниже. ).

Сильная зависимость E от поверхностной плотности акцептора, но не от поверхностной плотности донора, согласуется с теоретическим предсказанием для доноров и акцепторов, случайно распределенных в плоскости мембраны (рис. 2). Однако эта независимость E от поверхностной плотности донора сохраняется только в том пределе, когда в возбужденном состоянии мало доноров по сравнению с числом присутствующих акцепторов (Fung and Stryer, 1978).В соответствии с этим мы обнаружили, что если клетки были помечены постоянной концентрацией акцептора (50 мкг / мл) и различными количествами донора для получения указанного D: A, передача энергии фактически уменьшалась, когда концентрация донора увеличивалась, давая D : A из 5: 1 (рис. 3, c ). Для образцов, меченных низкими концентрациями донора (D: A 0,5: 1 и 1: 1), данные были аналогичны описанным выше (фиг. 3 b ). Поэтому во всех наших экспериментах образцы для FRET были помечены постоянной низкой концентрацией донора (50 мкг / мл) и различными концентрациями акцептора.

Мы рассмотрели возможность того, что двухвалентный IgG, используемый для метки 5′-NT, может нарушить его нормальное мембранное распределение. Чтобы проверить это, мы повторили эксперименты на фиг. 3, a и b , используя клетки, меченные одновалентным Fab. На рис. 4 показаны результаты такого эксперимента. Как указано выше, клетки метили постоянным количеством донора и увеличивающимся количеством акцептора. Картина иммунофлуоресцентного мечения была аналогичной для клеток, меченных IgG и Fab (данные не показаны).Как мы наблюдали для образцов, меченных IgG, E как функция поверхностной плотности акцептора была примерно одинаковой для всех D: A (рис. 4 b ). Однако для образцов, меченных Fab, наблюдалось небольшое, но систематическое увеличение E с увеличением концентрации акцептора. В эксперименте, в котором мы напрямую сравнивали величину E при данной интенсивности флуоресценции акцептора для образцов, меченных IgG, по сравнению с Fab, мы обнаружили, что E была выше для Fab-меченных образцов (данные не показаны).Скорее всего, это связано с различиями в соотношении краситель / белок для молекул, меченных акцепторами (4,1 для Fab против 1,7 для IgG), но это также может быть связано с различиями в размере и / или относительной гибкости Fab и IgG. (Кам и др., 1995; Матко, Эдидин, 1997). Эти факторы могут также объяснить увеличение E с увеличением концентрации акцепторного Fab.

Мы также провели измерения FRET в клетках, которые не были инкубированы с бутиратом, но которые, тем не менее, показали обнаруживаемые количества 5 ‘NT.Эти эксперименты проводились по двум причинам. Во-первых, мы хотели дополнительно проверить зависимость E от поверхностной плотности 5 ′ NT, чтобы увидеть, экстраполировано ли E к нулю при низких поверхностных плотностях (Таблица I). Во-вторых, обработка бутиратом, используемая для индукции высокой экспрессии 5′-NT, может создавать артефакты из-за сверхэкспрессии белка. Например, обогащение 5′-NT микродоменами в обработанных бутиратом клетках может быть ограничено доступностью других компонентов предполагаемых микродоменов.В соответствии с более низкими поверхностными плотностями 5 ‘NT, мы обнаружили, что E было соответственно ниже на необработанных клетках (данные не показаны и на фиг. 6 и 7). Как мы обнаружили для клеток, обработанных бутиратом, при данной поверхностной плотности акцептора E было одинаковым для всех исследованных D: A (данные не показаны). Это говорит о том, что на распределение 5 ‘NT не влияет уровень экспрессии белка.

В описанных выше экспериментах поверхностная плотность акцепторов выражалась в условных единицах; следовательно, мы не могли напрямую сравнивать экспериментальные данные с теоретическими предсказаниями.Чтобы сравнить экспериментальные данные с теоретическими предсказаниями, мы оценили абсолютную поверхностную плотность акцепторов на клеточных мембранах по измеренным интенсивностям флуоресценции с использованием набора калибровочных стандартов, шариков диаметром 8 мкм с известной способностью связывания антител. На рис.5 сравниваются экспериментальные значения E , построенные как функция абсолютной поверхностной плотности акцепторов (рис.5, a ), с теоретическими значениями E для случайно распределенных доноров и акцепторов (рис.5, б ). По нашим оценкам, максимальная поверхностная плотность акцепторов составляет 20 000 на 1 мкм ² (рис. 5, a ). Эти значения высоки и могут быть завышены, но они не беспрецедентны (Rothberg et al., 1990; Hille, 1992). Теоретические кривые (рис. 5 b ) были рассчитаны для значений максимального сближения, r , в диапазоне от r = 0, где донор и акцептор находятся в физическом контакте, до r = 2 R . _o , где максимально возможное сближение донора и акцептора ограничено 100 Å.Если r приблизительно соответствовать диаметру меченных донорами и акцепторами молекул (Zimet et al., 1995), r = 1,5 R _o будет примерно сопоставимо с размером Fab, который оценивается как цилиндр диаметром 80 Å и высотой 70 Å (Kubitscheck et al., 1993).

Сравнение рис. 5, a и b показывает, что общие формы экспериментальных и теоретических кривых аналогичны, и что экспериментальные данные попадают в диапазон теоретических предсказаний.Экспериментальные данные аналогичны теоретическим кривым для r = 0 при низких поверхностных плотностях и r = 1,5 R _o при высоких поверхностных плотностях. Хотя это изменение r в зависимости от поверхностной плотности может отражать биологию 5 ′ NT, оно также может быть результатом ошибок в оценке поверхностной плотности акцептора и того факта, что теоретические расчеты предполагают наличие одного флуорофора на молекулу белка. , в то время как наши метки Fab и IgG несут два или более флуорофоров на молекулу.

В качестве прямого теста того, может ли наш метод обнаруживать сгруппированные молекулы, мы измерили передачу энергии от меченных донором анти-5 ‘NT Ig к меченным акцептором анти-Ig антителам. Прямое связывание вторичных антител с первичными антителами должно приводить к относительно высоким значениям E , а E должно отражать комбинированный вклад «сгруппированных» (непосредственно связанных) и случайно распределенных молекул (Приложение).Мы ожидаем, что эта система должна вести себя как смесь случайно распределенных и сгруппированных молекул, где f _{сгруппировано} является постоянным (таблица I, рис. A3, a и b ). Хотя сначала может показаться, что, поскольку акцепторы связывают доноров, это должно быть эквивалентно модели, представленной на рис. 3 c , это не так, потому что в нашем эксперименте соотношение первичных и вторичных антител, связанных с любым для данной ячейки, и, следовательно, f _{сгруппировано} , является постоянным.

Как и ожидалось, для образцов, меченных донор-конъюгированными первичными и акцепторно-конъюгированными вторичными антителами, количество вторичных антител, связанных с любой данной клеткой, было прямо пропорционально количеству связанных первичных антител и, таким образом, пропорционально поверхностной плотности 5 ‘ NT (данные не показаны). По сравнению с контрольным образцом, меченным первичными антителами, конъюгированными с донором и акцептором, значительно более высокие значения E наблюдались для образцов, меченных первичными антителами, конъюгированными с донором, и вторичными антителами, конъюгированными с акцептором (рис.6). Более того, в сгруппированных образцах E увеличивалось по мере увеличения концентрации конъюгированного с акцептором вторичного антитела, используемого для мечения клеток. В этом эксперименте E увеличивалось с максимума ∼20% до максимума, близкого к 40%, поскольку D: A увеличивалось с номинального отношения 1: 0,1 до 1: 1. Для сравнения, E , равное 28%, было измерено между A- и B-субъединицами интактной структуры холерного токсина, молекулами в молекулярном контакте (Bastiaens et al., 1996).

Увеличение E , наблюдаемое при увеличении концентрации акцептора в D: A, могло отражать увеличение доли доноров, с которыми были связаны акцепторы ( f _{кластеризовались} в уравнении A5), увеличение количество акцепторов (вторичных антител), связанных с донором ( E, , _{, кластер} в уравнении A5), или оба. E для кластеризованных молекул также показала некоторую зависимость от поверхностной плотности акцептора.Вероятно, это связано с межкластерной передачей энергии. Особо обратите внимание на то, что при наименьшей наблюдаемой поверхностной плотности E для контрольного образца составляло менее 5% по сравнению с> 10% или> 20% для образцов, меченных 5 или 50 мкг / мл вторичного антитела, меченного акцептором, соответственно.

GPI-заякоренных белков на поверхности клетки можно кластеризовать путем перекрестного связывания с вторичным антителом (Mayor et al., 1994; Fujimoto, 1996) или экстракцией клеток детергентом (Mayor and Maxfield, 1995). Если эта кластеризация также происходит в масштабах молекулярной длины, это должно вызывать заметное изменение в передаче энергии между мечеными молекулами 5′-NT.

Для кластеризации 5′-NT с вторичным антителом клетки метили антителом, конъюгированным с донором и акцептором, с последующим вторичным антителом против IgG и короткой инкубацией при 37 ° C.При такой обработке метка группируется в большие точечные структуры (Fig. 7, c ). Для данной поверхностной плотности акцептора более высокие значения E наблюдались в клетках, меченных вторичным антителом, чем в контрольных клетках (фиг. 7, e ). Эта разница была не очень большой, отчасти потому, что для кластерного образца E является средним значением для областей, обедненных и обогащенных 5 ′ NT (рис. 7 d ). Этот результат согласуется с сообщением о том, что среднее значение E для клеток, меченных донорским и акцепторным меченым конканавалином A, было сходным в условиях, когда метка была окрашена кольцом и когда она была исправлена ​​(Dale et al., 1981).

5 ‘NT обнаруживается в микродоменах мембран низкой плотности, не растворимых в детергентах, в эпителиальных клетках кишечника (Strohmeier et al., 1997) и эндотелиальных клетках легких крыс (Schnitzer et al., 1995). Чтобы увидеть, изменила ли экстракция Triton X-100 организацию 5′-NT в интактных клеточных мембранах MDCK, живые клетки метили при 4 ° C антителами, меченными донорами и акцепторами, а затем инкубировали на льду с 1% Triton X-100 для 30 мин до фиксации.Как сообщалось для других GPI-заякоренных белков (Mayor and Maxfield, 1995), 5’-NT не был значительно солюбилизирован в этих условиях, поскольку интенсивность и характер его мечения были очень похожи на контрольные клетки (фиг. 8). Однако в некоторых клетках были очевидны темные немеченые области в мембране (предположительно отверстия), что указывало на то, что другие компоненты мембраны были солюбилизированы (фиг. 8, c , стрелка ). E , измеренное после экстракции детергента, было систематически выше, чем в контроле, что согласуется со сдвигом к частично кластерному распределению 5 ‘NT после экстракции детергента (рис.8 и ).

Эти результаты предполагают, что не все 5′-NT были сгруппированы после вторичного мечения антител или экстракции детергентом, а вместо этого присутствовали как смесь случайно распределенных и сгруппированных молекул. К этому моменту важно отметить, что изменения (или их отсутствие) в видимой организации белка на световом или даже электронно-микроскопическом уровне могут не коррелировать напрямую с изменениями, обнаруженными FRET, поскольку они измеряют расстояния на разной длине. весы (ок.ф., Дамьянович и др., 1995).

Мембранные микродомены, обогащенные GPI-заякоренными белками, GSL и холестерином, были оперативно определены в терминах нерастворимых в детергентах мембранных фракций с низкой плотностью; однако эти микродомены не были обнаружены другими методами (для обзора см. Harder and Simons, 1997). В настоящем исследовании мы использовали визуализацию FRET, метод, который увеличивает разрешение иммунофлуоресцентной микроскопии до молекулярного масштаба, чтобы исследовать микродомены, обогащенные GPI-заякоренным белком, в апикальной плазматической мембране клеток MDCK.Мы ожидали, что если большая часть GPI-заякоренного белка 5′-NT находится в микродоменах мембраны, то мы сможем обнаружить FRET между 5′-NT молекулами, что согласуется с кластеризацией (Таблица I).

Используя визуализацию FRET, мы получили изображения, которые показали значительные различия от клетки к клетке в эффективности передачи энергии между мечеными молекулами 5′-NT. E сильно коррелировал с поверхностной плотностью 5 ′ н.т. и приближался к нулю при низких поверхностных плотностях (рис.3–6). Эти наблюдения предполагают, что большая часть 5′-NT не находится в кластерах на апикальной мембране клеток MDCK; если бы это было так, мы бы ожидали получить высокие значения E даже при низкой поверхностной плотности (Таблица I). Эти наблюдения не были связаны с неспособностью метода обнаружить кластеры, поскольку мы обнаружили сгруппированные доноры и акцепторы в простой модельной системе, вторичные антитела, связанные с первичными антителами (рис. 6).

Отчетливая зависимость E от поверхностной плотности 5 ′ NT (рис.3–6) согласуется либо с полностью случайным распределением белка, либо со смесью случайно распределенных и сгруппированных 5′-NT (Таблица I). Если некоторые 5 ‘NT находятся в кластерах, а некоторые распределены случайным образом, мы ожидаем, что E не обязательно будет стремиться к нулю в пределе низкой поверхностной плотности, а E будет чувствительным к D: A (Таблица I). Если в кластерах мало или совсем нет 5 ′ NT, то мы ожидаем, что E упадет до нуля в пределе низкой поверхностной плотности, чтобы быть нечувствительным к D: A.

Мы обнаружили, что E приближается к нулю в пределе низких поверхностных плотностей 5 ′ НТ (рис. 3–6), а форма экспериментальных кривых аналогична теоретически предсказанной для случайного распределения (рис. 5). E сильно зависит от поверхностной плотности акцептора, а не от поверхностной плотности доноров при относительно низких концентрациях донорного флуорофора. Независимо от D: A, данные отдельного эксперимента имели тенденцию попадать на одну кривую при построении графика как функции поверхностной плотности акцепторов в клетках, экспрессирующих широко варьирующие концентрации белка (рис.3). Однако в некоторых экспериментах (рис. 4) мы наблюдали небольшие сдвиги в E для образцов, помеченных разными соотношениями D: A, что указывает на то, что некоторые кластеры могут присутствовать. Таким образом, мы не можем полностью исключить возможность того, что, хотя большинство из них распределено случайным образом, некоторые молекулы 5′-NT объединяются в кластеры. Мы ожидаем, что при некоторых обстоятельствах FRET для смесей случайно распределенных и сгруппированных молекул будет казаться похожим на FRET для чисто случайного распределения, особенно в пределе, когда f _{с кластерами} и / или E _{с кластерами} мало, и f _random и / или E _random является большим (см. Приложение).Это могло бы объяснить, например, почему мы не наблюдали большего эффекта на E в клетках, где мы индуцировали кластеризацию GPI-заякоренных белков путем вторичного перекрестного связывания, индуцированного антителами, или путем экстракции детергентом интактных клеток (рис. 7 и 8). ). Мы подсчитали, что если 10% молекул будут сгруппированы, данные для смешанной популяции будут выглядеть очень похожими на чистое случайное распределение (при условии, что r = R _o ). Однако большие различия ожидаются, когда f _{сгруппированы} = 50% (см. Приложение).Основываясь на этих наблюдениях, простейшая интерпретация наших данных состоит в том, что 5 ′ NT в условиях наших экспериментов преимущественно распределены случайным образом.

Важно подчеркнуть, что наш вывод о том, что 5′-NT преимущественно распределен случайным образом, зависит от наличия FRET, а не его отсутствия. В предыдущем исследовании нашей лаборатории не было обнаружено FRET между мечеными молекулами gD1-DAF в стационарных условиях, что означает, что gD1-DAF был диспергирован, т.е.е., распределены случайным образом (Hannan et al., 1993). Однако отсутствие FRET не обязательно исключает возможность объединения молекул в кластер, поскольку среди других возможностей расстояние, разделяющее их в кластере, может быть больше, чем может быть обнаружено FRET. В настоящем исследовании мы смогли обнаружить FRET между мечеными молекулами 5 ‘NT; это указывает на то, что в среднем белки уже находятся в пределах 10 Å друг от друга. Это является дополнительным доказательством того, что FRET может обнаруживать обогащение 5’-NT в микродоменах, т.е.е., липидные рафты. Повторное изучение латеральной организации gD1-DAF с использованием нашего текущего метода FRET показывает, что перенос энергии обнаруживается между мечеными молекулами gD1-DAF в стационарных условиях и коррелирует с поверхностной плотностью белка, аналогично нашим результатам для 5 ‘NT (Nguyen, Т., А. Кенуорти, М. Эдидин, неопубликованные наблюдения). Разница между нашими прошлыми и настоящими результатами может быть связана с более низкими концентрациями (поверхностной плотностью) меченых антител в наших предыдущих экспериментах и ​​чувствительностью текущего метода к межклеточным вариациям в E .Это дополнительно подчеркивает наиболее важное преимущество визуализации FRET по сравнению с экспериментами без визуализации FRET, которые обычно дают средние значения E для популяции клеток (Hannan et al., 1993; Matko and Edidin, 1997): визуализация FRET генерирует изображения, отображающие передачу энергии эффективность. Хотя в текущем исследовании мы сосредоточились на гомоассоциациях белков, визуализация FRET также уникально подходит для выполнения «визуализации биохимии» белок-белковых и белок-липидных гетеро-взаимодействий в интактных клетках.

Для дальнейшей проверки нашего вывода о том, что большая часть 5′-NT распределена на поверхности клетки случайным образом, потребуется количественное сравнение наших данных с теоретическими предсказаниями. Варианты применяемого нами здесь аналитического подхода использовались для количественной интерпретации данных FRET в различных мембранных системах (например, Holowka и Baird, 1983, a , b ; Dewey and Datta, 1989; John and Jähnig, 1991; также см. более полный список в Mátyus, 1992 и Clegg, 1996).Однако наши возможности расширить наш текущий анализ с качественного на количественный ограничены несколькими факторами. Во-первых, существует некоторый разброс в кривых зависимости передачи энергии от поверхностной плотности акцептора, который может скрывать различия в наборах данных. Факторы, способствующие этой вариабельности, включают неоднородности возбуждения в поле зрения, небольшие локальные вариации в тушении донора и присущую неоднородность рисунка флуоресцентного мечения на поверхности клетки из-за присутствия микроворсинок и кривизны самой апикальной мембраны. .Во-вторых, нижний предел обнаруживаемости FRET с помощью нашего метода составляет консервативно 5%, хотя во многих экспериментах мы измеряли кажущееся E для отрицательных контролей (помеченных только донором) всего на 2–3% (рис. 4). Это можно улучшить дополнительным вычитанием фона. В текущих экспериментах, поскольку мы визуализировали конфлюэнтные монослои клеток, единственное вычитание фона, которое мы включили, было для так называемого темнового тока, постоянного вклада из-за шума от камеры CCD.При более высокой чувствительности мы могли с большей уверенностью оценить экстраполяцию E и поверхностную плотность акцептора к нулю. В-третьих, есть пределы нашему сравнению экспериментальных результатов с теорией и с самими теоретическими расчетами. Наша способность строго проверять теоретические предсказания была бы улучшена за счет более точных оценок поверхностной плотности акцептора и r . Физически обоснованное приближение r , например, потребует более подробной структурной информации о 5′-NT, включая положение эпитопа и ориентацию связанного антитела.К этому моменту отметим, что был разработан ряд сложных анализов, которые включали подробную информацию об экспериментальной системе, такую ​​как положение донорного флуорофора на интересующей молекуле (например, Zimet et al., 1995). Этот вид информации может быть с успехом применен при анализе данных FRET для получения более качественных экспериментальных систем. Анализ также может быть улучшен за счет более совершенных теоретических моделей для смешанных популяций, включая конкретные перекрестные члены между случайно распределенными и сгруппированными молекулами.

Хорошо известно, что распределение GPI-заякоренных белков в клеточных мембранах чувствительно к условиям фиксации и мечения. Например, сообщалось, что GPI-заякоренный рецептор фолиевой кислоты сгруппирован (Rothberg et al., 1990), но впоследствии было показано, что это индуцируется перекрестным связыванием вторичных антител (Mayor et al., 1994). Кластеризация самого 5′-NT также была показана после перекрестного связывания антител (Howell et al., 1987). В наших экспериментах мы наблюдали очень похожие диспергированные паттерны мечения, продуцируемые либо моновалентным Fab, либо двухвалентным IgG, когда клетки фиксировали непосредственно после мечения. Кроме того, организация первичных антител стала более пунктированной (сгруппированной) в присутствии вторичных антител (фиг. 7 и данные не показаны). Таким образом, наши результаты аналогичны предыдущим отчетам в этом отношении (Rothberg et al., 1990; Mayor et al., 1994). Однако совсем недавно проведенная работа предполагает, что определенные условия фиксации могут действовать для рассеивания ранее существовавших кластеров рецептора фолиевой кислоты (Wu et al., 1997), вновь открывая вопрос о том, как лучше всего стабилизировать нативное распределение GPI-заякоренных белков. Этот вопрос потребует дальнейшего изучения. Тем не менее, наши текущие результаты согласуются с сообщениями (Parton et al., 1994; Mayor and Maxfield, 1995; Fujimoto, 1996; Rijnboutt et al., 1996) о преимущественно случайных стационарных распределениях GPI-заякоренных белков, измеренных в уровень разрешения электронного микроскопа. По сравнению с электронной микроскопией, визуализация FRET имеет преимущества более высокой эффективности маркировки, большего размера образца и, что наиболее важно, повышенного разрешения до молекулярного уровня.

Первым экспериментальным доказательством существования мембранных микродоменов, обогащенных GPI-заякоренными белками, было выделение в виде плавучих комплексов нерастворимых в детергенте мембранных фракций, обогащенных GPI-заякоренными белками, GSL и холестерином из клеток MDCK (Brown and Rose, 1992). Было обнаружено, что GPI-заякоренный белок PLAP становится детергентом, нерастворимым в Golgi, свойство, которое сохраняется даже после того, как белок достигает апикальной мембраны (Brown and Rose, 1992).Позже было показано, что дополнительные компоненты нерастворимых в детергенте мембранных микродоменов включают трансдуцирующие сигналы липид-модифицированные белки, такие как нерецепторные тирозинкиназы и кавеолярный маркер кавеолин (Стефанова и др., 1991; Саргиакомо и др., 1993; Арреаза и др., 1994; Мелконян и др., 1995). Недавно ряд исследований помог прояснить взаимосвязь между мембранными микродоменами, обогащенными GPI-заякоренными белками, комплексами, не растворимыми в детергенте, и кавеолами, 70–100-нм инвагинациями плазматической мембраны, которые украшены белком кавеолином (Fra et al. ., 1994; Schroeder et al., 1994; Городинский и Харрис, 1995; Мэр и Максфилд, 1995; Schnitzer et al., 1995, 1996; Смарт и др., 1995; Ханнан и Эдидин, 1996; Ахмед и др., 1997). Эти исследования показывают, что белки и липиды, которые обладают общим свойством нерастворимости детергента, не обязательно связаны в интактных клеточных мембранах, но оставляют открытым вопрос о размере и природе микродоменов до экстракции детергента (Kurzchalia et al., 1995; Edidin, 1997; Harder and Simons, 1997; Weimbs et al., 1997). Очевидно, что существует потребность в более точном определении того, что составляет функциональный мембранный микродомен в интактных клеточных мембранах.

Наши результаты, полученные с использованием техники визуализации с высоким разрешением, начинают налагать четкие ограничения на структуру микродоменов, обогащенных GPI-заякоренными белками в интактных клеточных мембранах. Мы сообщаем здесь, что GPI-заякоренный белок 5′-NT, который, как известно, ассоциируется с нерастворимыми в детергенте комплексами (Mescher et al., 1981; Шнитцер и др., 1995; Strohmeier et al., 1997), также устойчив к экстракции Triton X-100 в клетках MDCK. Тем не менее, похоже, что большинство 5 ‘NT распределены случайным образом и не сгруппированы по шкале длины <100 Å измерений FRET. Это накладывает ограничения на способы, которыми GPI-заякоренные белки могут связываться с липидными рафтами. Например, наши данные выступают против модели, в которой 5 'NT преимущественно связаны с конечным числом рафтов, поскольку мы ожидали измерить относительно высокий перенос энергии из-за кластеризации белка в рафтах даже при низкой поверхностной плотности 5 ′ Экспрессия NT (рис.3). Ограничения наших текущих измерений не позволяют нам исключить возможность того, что FRET между 5 ′ NT возникает из-за смеси большой доли случайно распределенных и небольшой фракции сгруппированных (связанных с плотом) молекул. Однако интересно рассмотреть последствия чисто случайного распределения 5'-NT для структуры липидных рафтов. Если бы это было так, то эти микродомены мембраны должны быть либо исчезающе малыми (в соответствии с современной моделью [Harder and Simons, 1997]), либо альтернативно должны охватывать всю апикальную мембрану.Наши результаты также имеют значение для мембранной организации GPI-заякоренных белков во время мембранного транспорта и сортировки, поскольку предполагается, что биохимические свойства мембранных микродоменов, участвующих в сортировке, и стационарная организация GPI-заякоренных белков схожи. Это может быть дополнительно проверено путем непосредственного изучения мембранной организации GPI-заякоренных белков и других апикально предназначенных белков и липидов в Golgi. Дальнейшая работа будет также необходима, чтобы определить, могут ли функциональные ассоциации др. Липид-модифицированных белков и GSL быть визуализированы в клеточных мембранах, и опосредуются ли эти ассоциации липид-липидными или белково-липидными взаимодействиями.Визуализация FRET станет мощным инструментом для дальнейшего исследования этих вопросов в интактных клетках.

Для случайно распределенных доноров и акцепторов в мембранах эффективность передачи энергии E _random является функцией R _o , r, и поверхностной плотности акцепторов (Shaklai et al., 1977; Fung и Страйер, 1978; Вольбер и Хадсон, 1979; Дьюи и Хаммс, 1980; Снайдер и Фрейре, 1982; Игерабид, 1994).Здесь r определяется как расстояние наибольшего потенциального сближения доноров и акцепторов. При этом учитывается тот факт, что доноры и акцепторы прикреплены к молекулам, белкам или липидам, которые имеют некоторый конечный размер. Типичное значение r для передачи энергии между маленькими липидными зондами составляет ∼10 Å (Dewey and Hammes, 1980). Для белок-белковых взаимодействий r можно приблизительно определить диаметром белка, например, ∼40 Å для кальциевой АТФазы (Dewey and Datta, 1989; Zimet et al., 1995).

Уравнение, связывающее E _{случайный} , r , R _o и поверхностную плотность акцептора, находится в форме, которую необходимо решать численно, и, таким образом, был разработан ряд аналитических приближений этого уравнения ( Shaklai et al., 1977; Wolber and Hudson, 1979; Dewey and Hammes, 1980; Snyder and Freire, 1982; Yguerabide, 1994). Два приближения, которые вместе точно охватывают полезный диапазон значений r , взяты из Dewey and Hammes (1980) и Wolber and Hudson (1979).{- {\ mathit {k}} _ {2} {\ mathit {c}} _ {A}}), \ end {формула *}

, где c _A — это так называемая приведенная поверхностная плотность акцептора, безразмерный параметр, равный R _o ² , умноженный на поверхностную плотность акцептора, и A _1,2 и k _1,2 — константы, которые различаются для разных значений r .{-1}. \ End {формула *}

Здесь снова c _A — это уменьшенная поверхностная плотность акцептора, как определено выше. Уравнение A1 действительно для r <1,3 R _o и уравнения. A2 действительно для r ≥ R _o . Другими ограничивающими условиями являются: ( a ) Количество доноров должно быть достаточно небольшим, чтобы перевод донор-донор был незначительным; ( b ) количество доноров в возбужденном состоянии должно быть небольшим по сравнению с количеством в основном состоянии, чтобы доноры не конкурировали за перенос на данный акцептор; ( c ) r не должен изменяться за время жизни возбужденного состояния донора; и ( d ) все донорно-акцепторные пары должны иметь одинаковые R _o (Fung and Stryer, 1978; Wolber and Hudson, 1979; Zimet et al., 1995).

На рис. A2 мы построим уравнения. A1 и A2 как функция поверхностной плотности акцептора для различных значений r . E _{случайный} зависит от r , достигая своего максимального потенциального значения, когда r приближается к нулю. Для любого заданного значения r , E _random равно нулю в пределе очень низких поверхностных плотностей акцепторов и монотонно увеличивается с увеличением поверхностной плотности акцепторов (рис.А2). Это связано с тем, что по мере увеличения поверхностной плотности расстояние между соседними молекулами, меченными донорами и акцепторами, уменьшается (рис. A1, a и b ). Хотя E _random зависит от поверхностной плотности акцептора, он не зависит от поверхностной плотности донора (уравнения A1 и A2), поскольку каждый донор испытывает одинаковую среднюю поверхностную плотность акцептора. (Как указано выше, это верно только в пределе, когда поверхностная плотность донора достаточно мала, чтобы доноры возбужденного состояния не конкурировали за акцепторы.) Например, если два образца с одинаковой поверхностной плотностью белка были помечены разными D: A (рис. A1, b и c ), E _random будет выше для образца, помеченного более высокая концентрация акцепторов (рис. A1, c ). Отметим также, что поскольку E _random чувствителен только к поверхностной плотности молекул с акцепторной меткой, присутствие немеченых молекул не влияет на E _random .Используя эту информацию, можно оценить E _random для молекул на рис. A1, присвоив модели масштаб. Например, если диаметр частицы установлен равным 50 Å ( r = R _o ), то поверхностная плотность акцептора на рис. A1 c составляет 2500 / мкм ² , что дает E _{случайный} из 7% (уравнение A1).

Была получена простая модель для прогнозирования эффективности передачи энергии для сгруппированных молекул, E _{сгруппированных} , в случае, когда кластеры представляют собой небольшие четко определенные олигомеры, такие как димеры и тримеры (Veatch and Stryer, 1977; Adair and Энгельман, 1994).Эта модель делает несколько упрощающих предположений, включая предположение, что нет зависимых от поверхностной плотности взаимодействий между олигомерами, и что все представляющие интерес молекулы олигомеризованы. {{\ mathit { n}} — 1}).\ end {формула *}

Здесь n — количество звеньев в олигомере, f _DU — общая мольная доля представляющих интерес молекул, меченных донорами и немеченых, а E _{олигомера} — эффективность передачи энергии для олигомер. В случае димеров ( n = 2) это упрощается до

\ begin {уравнение *} {\ mathit {E}} _ {clustertered} = {\ mathit {E}} _ {dimer} {\ mathit {f}} _ {A}, \ end {уравнение *}

, где E _димер — эффективность передачи энергии димера, меченного одним донором и одним акцептором, а f _A — мольная доля молекул, меченных акцептором ( f _A + f _D + f _U = 1).Эта модель предсказывает, что E, , _{сгруппированы,} будет зависеть как от D: A, так и от степени мечения интересующих молекул. Например, для двух образцов с одинаковой поверхностной плотностью белка (рис. A1, e и f ), если принять димер E = 50% и указанный D: A, то E _{сгруппировано} = (50%) (. 25) = 12,5% для рис. A1, e , а E _{сгруппировано} = (50%) (0,75) = 37,5% для рис.A1, f . Модель кластера также предсказывает, что E, , _{кластеризованный} не будет зависеть от поверхностной плотности меченых молекул, представляющих интерес. Таким образом, E _{сгруппированы} = (50%) (0,25) = 12,5% для двух образцов с разной поверхностной плотностью, но помеченных одним и тем же D: A (рис. A1, d и e ). Основываясь на этом прогнозе, можно ожидать, что E _{с кластерами} будет отличным от нуля даже при низких поверхностных плотностях интересующей молекулы.Эти свойства контрастируют с предсказаниями для случайно распределенных молекул (рис. A1, a – c ), где E _random масштабируются строго в соответствии с поверхностной плотностью акцептора (уравнения A1 и A2).

Хотя эта модель может быть чрезмерно упрощена, она предоставляет полезный инструмент для размышления о том, как E _{с кластеризацией} зависит от D: A, степени маркировки и поверхностной плотности доноров и акцепторов для молекул, ограниченных кластерным распределением.Хотя представленная выше модель приравнивает «сгруппированные» молекулы к «связанным» молекулам, это, конечно, не всегда так. В общем, для прогнозирования E _{с кластерами} для более сложных кластерных распределений потребуется более конкретная информация о геометрии сгруппированных молекул, например о размере и форме кластеров, а также о положении флуоресцентного зонда (ов). на интересующие молекулы. E _{кластеризованный} в конечном итоге будет зависеть от вероятности маркировки соседних членов отдельного кластера на расстоянии FRET друг от друга донорами и акцепторами.

Простая модель кластеров, представленная выше, предполагает, что все интересующие молекулы объединены в кластеры. Если присутствует смесь мономерных, случайно распределенных молекул и сгруппированных молекул, мы ожидаем два вклада в E _смесь , один от случайно распределенной фракции доноров и акцепторов, а другой от кластеризованных молекул:

\ begin {уравнение *} {\ mathit {E}} _ {смесь} = {\ mathit {f}} _ {random} {\ mathit {E}} _ {random} + {\ mathit {f}} _ {кластеризованный} {\ mathit {E}} _ {кластеризованный}, \ end {уравнение *}

, где f _{случайный} и f _{сгруппированный} — это молярные доли случайно распределенных и сгруппированных доноров, соответственно. E _{случайный} — это эффективность передачи энергии для случайно распределенных молекул (уравнение A1 или A2), а E _{сгруппированных} — эффективность передачи энергии кластеризованных молекул (например, из уравнения A4 для димеров) . Из этого уравнения немедленно следует, что, поскольку E _random является функцией от поверхностной плотности акцептора (уравнения A1 и A2), смесь E также будет зависеть от поверхностной плотности акцептора. Обратите внимание, что для простоты эта модель не включает каких-либо терминов, которые учитывают FRET между кластерами или между кластерами и случайно распределенными молекулами.Такие взаимодействия в дальнейшем будут зависеть более сложным образом от f _{сгруппированных} , f _{случайных} и поверхностной плотности интересующих молекул.

Мы рассмотрим два предельных случая для смешанной совокупности, описываемой уравнением. А5. Первый случай, когда независимо от общей поверхностной плотности интересующих молекул мольная доля случайно распределенных и сгруппированных молекул остается постоянной, другими словами, f _{сгруппированы} , f _{случайные} и E , _{сгруппированы,} считаются константами.На рис. A3, a показана смесь E _{, рассчитанная для двух разных значений: f с кластерами , предполагая, что E с кластерами = 37,5% (аналогично примеру, приведенному для рис. A1, f ) . Результаты этого расчета показывают, что для одного D: A, когда 10% молекул сгруппированы, смесь} E _{лишь немного больше, чем предсказано для чисто случайного случая, но когда 50% молекул сгруппированы , E смесь существенно увеличена по сравнению с E random .Величина разницы между E смесью и E random будет зависеть от размера r , поскольку для данной поверхностной плотности акцептора E random становится меньше по мере увеличения r (Рис. A2). Однако, когда кластеры присутствуют, E с кластерами доминирует E смесь при низких поверхностных плотностях акцепторов, где вклад от случайно распределенных молекул наименьший.Таким образом, в этом случае E смесь не обязательно будет экстраполирована до нуля при низких поверхностных плотностях, тогда как E случайная будет. Более того, поскольку E сгруппированный является функцией D: A (уравнения A3 и A4), смесь E также будет чувствительна к D: A. Это проиллюстрировано на рис. A3, b , который показывает, что для смеси случайно распределенных мономеров и димеров, E смесь увеличивается как функция увеличения мольной доли акцептора в смеси D: A (рис.A3 b ).}

Второй предельный случай, который мы рассмотрим для смешанных популяций, имеет место, когда доля сгруппированных по сравнению со случайно распределенными молекулами зависит от поверхностной плотности интересующих молекул. Чтобы исследовать этот эффект, мы будем использовать четко определенную модель, в которой акцепторы напрямую связываются со случайно распределенными донорами (Wolber and Hudson, 1979). Хотя эта модель несколько отличается от других, которые мы обсуждали (поскольку она предполагает, что доноры и акцепторы находятся на двух разных типах молекул, которые образуют гетеродимеры), мы представляем ее здесь, потому что это наглядный пример кластеризации, зависящей от поверхностной плотности. . E _смесь для этого случая можно рассчитать по формуле. A5, позволяя f _random и E _random описывать несвязанные доноры, а f _{сгруппированный} и E _{сгруппированный} описывать связанные с акцептором доноры. Модель предполагает, что одна молекула, меченная донором, связывается с одной молекулой, меченной акцептором, таким образом, что f _{сгруппированы в кластеры} = c _A / c _D .Таким образом, f _{сгруппированный} , f _{случайный} и E _{случайный} все зависят от поверхностной плотности донора, поверхностной плотности акцептора или того и другого. На рис. A3, c показана смесь E , рассчитанная для нескольких значений поверхностной плотности донора c _D , при этом E _{кластеризованы,} = 50% для гетеродимера. Эти модельные расчеты показывают, что вклад кластеров в смесь E мал при низких поверхностных плотностях, но становится большим с увеличением поверхностной плотности акцепторов (рис.A3, c ). Это контрастирует со случаем, рассмотренным выше (постоянная f _{сгруппированная} ), где E _смесь отлична от нуля даже в пределе низких поверхностных плотностей (рис. A3, a и b ). Наконец, поскольку c _D и c _A пропорциональны D: A, опять же в этом случае E _смесь зависит от D: A.

Sein-off превращается в невидимый TV Finale: балтиморцы волнуются, поскольку электрические и кабельные сбои прерывают финал Seinfeld.’

Тысячи жителей Балтимора, которые просто устраивались, чтобы посмотреть грандиозный финал «Сайнфельда» прошлой ночью, в конечном итоге с недоверием и яростью направили свои кликеры на пустые телеэкраны, когда в городе произошло отключение электричества в самый неподходящий момент.

Около 17 000 потребителей коммунальных услуг на севере, северо-востоке и северо-западе Балтимора отключили электричество около 18:00. — затем снова потерял его после того, как телевизоры ожили для 20-минутного трепа примерно с 8:20 p.м. до 8:40 вечера

Специальный 75-минутный «Сайнфельд» начался в 20:45.

Неизвестное количество жителей Балтимора сохранили электроэнергию, но лишились кабельного телевидения и, вместе с тем, своих планов смотреть получившую широкую огласку программу.

«Я обезумела», — простонала 44-летняя Дениз Кэролан из Чарльз-Виллидж. «Это то, о чем все думали сегодня вечером: прийти домой, посмотреть« Сайнфельд »и расслабиться.

« Все будут говорить об этом завтра, и я не хочу слышать все изюминки.

Тони Рид, житель Вест-Лейк-авеню, сказал после того, как его телеграмма отключилась во второй раз: «Я пытался позвонить в TCI не менее 12 раз, и номер был занят. Я стою здесь и смотрю на черный экран ».

Телефонные линии к TCI Communications of Baltimore, городской кабельный провайдер, вчера вечером оставались затопленными, и связаться с представителем не удалось.

сообщила, что ее система сообщений забита звонками и больше никаких жалоб принимать не будет.

Кэтлин Нолан, пресс-секретарь Baltimore Gas and Electric Co., сообщила, что справочная служба BGE была забита звонками по поводу отключения электроэнергии.

Главная претензия: нет «Сайнфельда».

«Коммутатор в наших офисах в центре города зажег что-то ужасное, — сказала она.

Нолан не знал, почему у некоторых жителей не было электричества, а у других остался только кабель, но осталось электричество. Она сказала, что бригады работают над устранением проблемы, которая возникла в результате отказа трех фидерных линий на двух подстанциях, на проспекте Либерти-Хайтс в Форест-парке на северо-западе Балтимора и на Центральной улице в центре города.

Затронутые районы города включали в себя несколько основных районов, где можно было наблюдать за Сайнфелдом: Чарльз-Виллидж, Гилфорд, Роланд-Парк и Гамильтон. Отключения были спорадическими — многие дома в почтовом индексе 21218 в Северном Балтиморе обесточились, но Университет Джона Хопкинса, который имеет этот почтовый индекс, не пострадал.

Некоторые жители позвонили друзьям и родственникам и попросили их записать шоу на пленку, но другие решили, что «телеканал обязательно посмотреть» означает именно это.

Кевин Макгоуэн, 40 лет, школьный учитель, выбежал из своего дома в ближайший ресторан Rootie Kazootie’s на углу Чарльз и 27-й улицы, который не пострадал от отключения электричества.

Тем не менее, он посетовал: «Это катастрофа».

Другие посетители сжимали фонарики, готовясь к повторному входу в темные дома, и сочувствовали друг другу, глядя в несколько телевизоров ресторана.

Другим предприятиям повезло меньше.

Официантка Энн Крейг из закрытого паба Charles Village в квартале 3100 по улице Сент-Пол сказала, что люди звонили весь день, чтобы убедиться, что в пабе будет показывать «Seinfeld», и ожидалось большое скопление людей.

«Мы потеряли [силу] в середине Суперкубка год или два назад», — с сожалением добавил Крейг.

Хотя ожидалось, что количество просмотров вчерашнего шоу «Сайнфелд» не превысит последний эпизод «M * A * S * H» в 1983 году, опрос Eisner & Associates Inc. из Балтимора предсказал, что 44 процента всех взрослых по всей стране — или около 110 миллионов зрителей — настроились бы.

Нил Гэбби был среди тех, кого не позабавило, узнав, что программа, разрекламированная как «шоу ни о чем», действительно была ни о чем прошлой ночью.

«Это» Кто стрелял в Дж.Р.? «Этого поколения? «сказал 27-летний учитель в Gilman School.

«Мы с женой сидим здесь и читаем в общей комнате, но мы все еще можем слышать жужжание телевизора на всякий случай. Но я теряю надежду. Как наблюдатель с первого шоу, я невероятно раздражен. »

Для некоторых сага о сбоях закончилась так, как могла бы закончиться, если бы все это была просто очередным эпизодом «Сайнфельда».

Телевидение Кэролан было среди тех, кто вовремя включил титры.

По словам Нолана, большинство клиентов вернулись к электросети примерно в 9:40 вечера. Около 3500 других все еще были отключены в 23:00, но ожидалось, что электричество будет восстановлено к полуночи — через два часа после выхода «Сайнфельда».

Дата паба: 15.05.98

15 Charlcote Pl, Baltimore, MD, 21218

Входя в этот величественный классический дом возрождения, можно почти услышать звон бокалов, почувствовать тепло огня, горящего в домашнего очага и услышите смех гостей на одной из многочисленных вечеринок, проводимых в этом доме.Джон Рассел Поуп, один из ведущих архитекторов первой половины 20-го века, был заказан Джеймсом Суанном Фриком для проектирования Дома Шарлкота. Поуп также спроектировал такие достопримечательности, как Мемориал Джефферсона, Метрополитен-музей и Художественный музей Балтимора. Фрик купил шесть участков земли в недавно созданном поселке Гилфорд, имеющем форму щита и полностью окруженном кирпичной стеной, увитой плющом, с деталями из кованого железа. Каретный дом находится напротив главного входа и двора.Этот величественный дом, внесенный в Национальный реестр исторических мест, имеет классические пропорции и детали, симметричную планировку и элегантные материалы. Дом прямоугольной формы расположен на оси восток-запад. В традиционных комнатах на главном уровне, 13 футов в высоту, есть коринфские колонны, филигранные потолки и декоративная лепнина. Отделка стен, потолка и пола выполнена в строгом стиле с акцентом на стыке стен и потолка и декоре с урнами, гирляндами, завитками, ладами и консолями.Чрезвычайный простор и формальность были в высшей степени необычными для пригородов Балтимора начала 20-го века. Основные помещения расположены вокруг Т-образного входа и поперечного холла, вымощенного мраморной плиткой. Французские двери из красного дерева высотой 12 футов открываются в каждую комнату. Библиотека с дровяным камином полностью отделана красным деревом с ручной инкрустацией. Большая гостиная с газовым камином выходит окнами на территорию на юг, в сторону Чарльз-стрит. Это передний и главный фасад дома с огибающей террасой, летом затененной навесом.Карманные двери из красного дерева отделяют гостиную от столовой. Столовая с газовым камином соединяется с кухней через стеклянные французские двери, а также через скрытую служебную дверь. Семейный номер, первоначально представлявший собой гостиную, привносит удобства 21 века, с большим телевизором с плоским экраном, дровяным камином и прилегающей дамской комнатой. Полностью обшитый панелями кабинет с освещенными шкафами по бокам газового камина выходит на северный двор. Восточный конец вестибюля ведет к лифту, который обслуживает все уровни дома, черную лестницу, прихожую, вторую дамскую комнату, кладовую дворецкого и кухню.Карманные ставни обрамляют все окна на первом этаже, кроме зала для завтрака и кухни, где карманные железные решетки выдвигаются для дополнительной безопасности на большом пространстве окон. На солнечной веранде пол выложен классическим кирпичом в елочку. Просторный основной люкс с несколькими гардеробными и роскошной ванной с двумя туалетными столиками, ванной, туалетом и паровым душем находится на втором уровне с тремя дополнительными спальнями с ванными комнатами, кедровым шкафом, прачечной и оригинальным шкафом для белья.Третий уровень был преобразован из помещений для персонала в 2006 году в отмеченную наградами семейную зону площадью 2 500 квадратных футов. Новое пространство, спроектированное Бенджамином Эймсом, включает в себя неформальную медиа-гостиную, художественную студию, игровую комнату, офис, дополнительную дамскую комнату, тренажерный зал и гостевую спальню с ванной. Третий этаж имеет выход на верхнюю террасу. Эймс включил в пространство потолочное окно из матового стекла, чтобы обеспечить естественный свет, и сохранил длинный центральный коридор от оригинального дизайна. Предлагая лучшее из обоих миров, этот отель представляет собой «умный дом», подходящий тем, кто ценит историческую архитектуру, но при этом пользуется современными удобствами.Всей домашней электроникой можно управлять издалека, включая встроенные динамики, воспроизводящие музыку по всему дому, новую печь, водонагреватели и многое другое. Системы были обновлены, чтобы учесть эту современную технологию. Редко можно найти такой замечательный исторический дом, как Дом Шарлькота, который подходит для современного образа жизни.

Характеристики объекта

Спальни

• Спальни: 5
• Уровень главной спальни: Верхний 1
• Спальня 2 Уровень: Верхний 1
• Спальня 4 Уровень: Верхний 1
• Спальня 5 Уровень: Верхний 2
• Характеристики главной спальни : Камин — Дрова, Полы — Ковер
• Спальня 2 Особенности: Встроенные, Камин — Дровяные, Полы — Ковер
• Спальня 4 Особенности: Камин — Дровяное сжигание, Полы — Ковер
• Спальня 5 Особенности: Полы — Твердые породы

Ванных комнат

• Всего ванных комнат: 8
• Полных ванных комнат: 5
• 1/2 Ванных комнат: 3
• Уровень главной ванной: Верхний 1
• Ванная комната 1 Уровень: Верхний 1
• Характеристики главной ванной: Камин — Дерево Горение, пол — плитка, ванна, гардеробная
• Характеристики ванной комнаты 1: двойная раковина, душевая кабина

Элементы интерьера

• Дополнительная лестница way
• Встроенные
• Кладовая для дворецких
• Ковер
• Кедровый шкаф (и)
• Молдинги в виде короны
• Лифт
• План этажа — Традиционный
• Официальный / Отдельная столовая
• Кухня — Еда
• Кухня — Еда — Gourmet
• Кухня — Остров
• Кухня — Место стола
• Основная ванна (и)
• Встроенное освещение
• Мансардный люк
• Ванна для замачивания
• Душевая кабина
• Ванна для душа
• Модернизированные столешницы
• в шкафу (ах)
• Бар для влажной / сухой уборки
• Подвал

Приборы

• Встраиваемая плита
• Варочная панель
• Посудомоечная машина
• Утилизация
• Сушильная машина — с двойной загрузкой
• — Вытяжной вентилятор
• Духовка — самоочистка
• Духовка — стенка
• Вытяжка
• Холодильник
• Приборы из нержавеющей стали
• Стиральная машина с фронтальной загрузкой
• Диспенсер для воды

Отопление и охлаждение

• Характеристики охлаждения: центральный кондиционер, зональное охлаждение
• Функции обогрева: радиант, программируемый термостатный обогрев, принудительное воздушное отопление, зональное отопление, радиатор
• Отопление: Да

Другие помещения

• Уровень помещения: Главный
• Дополнительный уровень помещения-2: Главный
• Флорида Уровень помещения: Главный
• Уровень гостиной: Главный
• Уровень медиа-комнаты: Верхний 2
• Офис / Уровень кабинета: основной
• Den Характеристики: карниз, камин — газ, пол — твердое дерево, обработка окон, гардеробная (и)
• Дополнительная комната-2 Характеристики: встроенные, кладовая
• Florida Характеристики комнаты: Полы — прочее
• Характеристики гостиной: каркас, камин — газ, пол — твердое дерево, обработка окон
• Характеристики мультимедийной комнаты: встроенные
• Характеристики офиса / кабинета: встроенные , Камин — газ, пол — древесина, отделка окон

Информация о земельном участке

• Площадь участка в сотках: 1.45
• Размер участка Квадратные футы: 63162

Гараж и парковка

• Функции парковки: Подъездная дорога, Off Street

Ассоциация домовладельцев

• Ассоциация: Да
• Сбор за ассоциацию: 3098
• Сбор за ассоциацию
Частота: ежегодно
• Расчетные общие ежемесячные взносы ассоциации: 258

Информация о школе

• Школьный округ: ГОСУДАРСТВЕННЫЕ ШКОЛЫ БАЛТИМОР-СИТИ

Другая информация о собственности

• Муниципалитет: Балтимор
• Годовая сумма налога: 40213.0
• Статус исходного листинга: Активный
• Округ: BALTIMORE CITY
• Заявление об отказе от ответственности: Standard
• Владелец: Fee Simple
• Район: BALTIMORE CITY
• Район источника: GUILFORD
• Почтовый индекс 9104: 10029 Подразделение
Plus 4: 10029
• Название исходной системы: C2C

Строительство и строительство

• Всего квадратных футов Жилая: 12861
• Год постройки: 1914
• Высшая законченная площадь: 12861
• Строительные материалы: Кирпич
• Возраст собственности: 107
910 Уровни или истории: 4
• Тип структуры: Отдельно стоящая
• Стиль дома: Традиционный
• Площадь Общая площадь: 12861
• Лифт: Да

Узнайте больше об этой собственности.Связаться с агентом

21218 Дома для продажи в Балтиморе, Мэриленд | Харлан К. Уильямс Ко.

Войдя в этот величественный дом, построенный в стиле классицизма, можно почти услышать звон бокалов, почувствовать тепло огня, горящего в очаге, и услышать смех гостей на одной из многочисленных вечеринок, проводимых в этом доме. Джон Рассел Поуп, один из ведущих архитекторов первой половины 20-го века, был заказан Джеймсом Суанном Фриком для проектирования Дома Шарлкота. Поуп также спроектировал такие достопримечательности, как Мемориал Джефферсона, Метрополитен-музей и Художественный музей Балтимора.Фрик купил шесть участков земли в недавно созданном поселке Гилфорд, имеющем форму щита и полностью окруженном кирпичной стеной, увитой плющом, с деталями из кованого железа. Каретный дом находится напротив главного входа и двора. Этот грандиозный дом имеет классические пропорции и детали, симметричную планировку и элегантные материалы. Дом прямоугольной формы расположен на оси восток-запад. В традиционных комнатах на главном уровне, 13 футов в высоту, есть коринфские колонны, филигранные потолки и декоративная лепнина.Отделка стен, потолка и пола выполнена в строгом стиле с акцентом на стыке стен и потолка и декоре с урнами, гирляндами, завитками, ладами и консолями. Чрезвычайный простор и формальность были в высшей степени необычными для пригородов Балтимора начала 20-го века. Основные помещения расположены вокруг Т-образного входа и поперечного холла, вымощенного мраморной плиткой. Французские двери из красного дерева высотой 12 футов открываются в каждую комнату. Библиотека с дровяным камином полностью отделана красным деревом с ручной инкрустацией.Большая гостиная с газовым камином выходит окнами на территорию на юг, в сторону Чарльз-стрит. Это передний и главный фасад дома с огибающей террасой, летом затененной навесом. Карманные двери из красного дерева отделяют гостиную от столовой. Столовая с газовым камином соединяется с кухней через стеклянные французские двери, а также через скрытую служебную дверь. Семейный номер, первоначально представлявший собой гостиную, привносит удобства 21 века, с большим телевизором с плоским экраном, дровяным камином и прилегающей дамской комнатой.Полностью обшитый панелями кабинет с освещенными шкафами по бокам газового камина выходит на северный двор. Восточный конец вестибюля ведет к лифту, который обслуживает все уровни дома, черную лестницу, прихожую, вторую дамскую комнату, кладовую дворецкого и кухню. Карманные ставни обрамляют все окна на первом этаже, кроме зала для завтрака и кухни, где карманные железные решетки выдвигаются для дополнительной безопасности на большом пространстве окон. На солнечной веранде пол выложен классическим кирпичом в елочку.Просторный основной люкс с несколькими гардеробными и роскошной ванной с двумя туалетными столиками, ванной, туалетом и паровым душем находится на втором уровне с тремя дополнительными спальнями с ванными комнатами, кедровым шкафом, прачечной и оригинальным шкафом для белья. Третий уровень был преобразован из помещений для персонала в 2006 году в отмеченную наградами семейную зону площадью 2500 квадратных футов. Новое пространство, спроектированное Бенджамином Эймсом, включает в себя неформальную медиа-гостиную, художественную студию, игровую комнату, офис, дополнительную дамскую комнату, тренажерный зал и гостевую спальню с ванной.Третий этаж имеет выход на верхнюю террасу. Эймс включил в пространство потолочное окно из матового стекла, чтобы обеспечить естественный свет, и сохранил длинный центральный коридор от оригинального дизайна. Предлагая лучшее из обоих миров, этот отель представляет собой «умный дом», подходящий тем, кто ценит историческую архитектуру, но при этом пользуется современными удобствами. Всей домашней электроникой можно управлять издалека, включая встроенные динамики, воспроизводящие музыку по всему дому, новую печь, водонагреватели и многое другое.Системы были обновлены, чтобы учесть эту современную технологию. Редко можно найти такой замечательный исторический дом, как Дом Шаркота, который подходит для современного образа жизни.

Дифференциальные эффекты рибосомных белков и ионов Mg2 + на конформационный переключатель во время сборки 5′-домена 30S рибосомы

1. Санджая К. Абейсиригунавардена1 и
2. Сара А. Вудсон

1. Т.К. Дженкинс, Департамент биофизики, Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21218, США

1. Автор, ответственный за переписку: swoodson {at} jhu.edu

• №1 Нынешний адрес: Кафедра химии и биохимии, Государственный университет Кента, Кент, штат Огайо 44242, США

Аннотация

Рибосомный белок S4 является ядром сборки 5 ‘и центральных доменов 30S рибосомы, что имеет решающее значение для выживания клеток.Белок S4 изменяет структуру своего сайта связывания 16S рРНК, проходя через ненативный промежуточный комплекс перед образованием нативные контакты S4-рРНК. Ансамбль FRET был использован для измерения термодинамической стабильности ненативных и природных комплексов S4. в присутствии ионов Mg ²⁺ и других 5′-доменных белков. Равновесное титрование Cy3-меченной 5′-доменной РНК с Cy5-меченным белком S4 показало что ионы Mg ²⁺ предпочтительно стабилизируют нативный комплекс S4-рРНК.Напротив, рибосомные белки S20 и S16 действуют путем дестабилизации ненативный комплекс S4-рРНК. Для полного кооперативного переключения на собственный комплекс требуются S4, S16 и S20, и это достигается в меньшей степени S4 и S16. Полученная термодинамическая модель сборки тела 30S иллюстрирует, как рибосомные белки избирательно смещают равновесие между альтернативными конформациями рРНК, увеличивая кооперативность сворачивания рРНК сверх того, что может быть достигнуто одними ионами Mg ²⁺ .

• Поступила 05.02.2015.
• Принята к печати 4 августа 2015 г.

15 Charlcote Place, Балтимор, Мэриленд, США | TTR Sotheby’s International Realty

Предоставлено Monument Sotheby’s International Realty

Данные предоставлены BRIGHT MLS

Новый инструмент для определения четвертичной структуры белка в живых клетках

олигомеров, эта область исследований все еще быстро развивается.

Детальные исследования еще предстоит провести на

многочисленных других белках, чтобы определить их количество протомеров и четвертичных структур суб-

единиц. При этом,

особое внимание необходимо уделить производству

надежных тестов для различения, например,

тетрамерных структур и комбинаций олигомеров

различных размеров или даже комбинаций димеров и

мономерных доноров.Все эти ситуации могут быть

, охарактеризованными широким распределением E

app

с многочисленными пиками

или более сложными характеристиками, относительные расположения

из которых должны быть тщательно оценены с помощью статистических тестов

.

Интересная возможность состоит в том, чтобы объединить информацию о четвертичной структуре

, полученную из исследований FRET-спектрометрии

, с результатами моделирования молекулярной динамики

(47) таких моделей четвертичной структуры для определения границ связывания между протомерами в пределах комплекса. и

помогают понять функцию олигомера.Для этого конца

можно начать с позиционирования и ориентирования протомеров

(с известной третичной структурой) внутри олигомера так, чтобы флуорофоры

флуоресцентных меток примерно соответствовали ограничениям по дисбалансу

, полученным из спектрометрии FRET.

Поскольку относительная ориентация флуоресцентных меток

неизвестна, этот первый шаг неявно предполагает ориентировочное среднее значение по цилиндру

, которое будет действительным для мембранных белков

, к которым метки прикреплены линкерами

, которые обеспечивают высокую степень свободы вращения меток.

Если, напротив, вращательной диффузии меток препятствуют стерические или другие ограничения

, следует добавить второй этап в

, который моделирует крупнозернистую молекулярную динамику

вращательной диффузии флуоресцентных меток и их

известных линкеров используются для определения наиболее вероятной

ориентации диполей перехода флуоресцентных меток.

Таким образом, фактор ориентации в FRET или k

2

из

молекул (см.g., соответствующие исследования в литературе

(5–7,48) для определения k

2

и его влияния на эффективность FRET

), могут быть вычислены, и тогда эти значения могут быть

используется на третьем этапе для получения более точного значения

парной эффективности FRET с использованием моделирования методом Монте-Карло

FRET в комплексе (44,47,48) и для определения новых

терпротомерных расстояний из спектрограмм FRET. . Затем

новых значений расстояния можно использовать для корректировки положения и

ориентации протомеров, и весь процесс может повторяться итеративно до тех пор, пока моделирование молекулярной динамики

не сойдется к олигомерной структуре с

наименьшая потенциальная энергия, которая также подчиняется расстоянию, ограниченному

деформациями от FRET.

Хотя этот подход, несомненно, представит исследования

тигров со своим собственным набором проблем,

представляется возможным при использовании существующих мощных компьютеров. Мы

предполагаем, что конечный результат — идентификация интерфейсов связывания

между протомерами внутри комплекса — оправдывает усилия

, так как это облегчит понимание функциональной роли таких комплексов

в живых клетках.

Авторы благодарят Майка Стоунмана за предоставленные данные для рис.3 и

Ашишу Мишре и Супарне Патовари за обсуждение смесей

димеров и мономерных доноров.

Эта работа частично финансировалась грантами Национального научного фонда (NSF)

(PHY-1058470, IIP-1114305 и PHY-1126386) и грантом Aurora Spectral

Technologies (MIL-107359) для V.R.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Цзянь Р. Ю. 1998. Зеленый флуоресцентный белок. Анну. Rev. Biochem.

67: 509–544.

2.Липпинкотт-Шварц Дж. И Дж. Х. Паттерсон. 2003. Разработка и

использование флуоресцентных белковых маркеров в живых клетках. Наука. 300: 87–91.

3. Мидзуно, Х., А. Савано,., А. Мияваки. 2001. Красный флуоресцентный белок

из Discosoma в качестве слитого тега и партнера для резонансной передачи энергии флуоресценции

. Биохимия. 40: 2502–2510.

4. Поршневой Д. В., Кремерс Г. Дж. 2007. Флуоресцентный белок FRET:

хорошее, плохое и уродливое.Trends Biochem. Sci. 32: 407–414.

5. Клегг Р. М. 1996. Флуоресцентный резонансный перенос энергии. В области флуоресцентной спектроскопии и микроскопии. X. F. Wang и

B. Herman, редакторы. John Wiley & Sons, Хобокен, Нью-Джерси.

6. Селвин П. Р. 1995. Флуоресцентный резонансный перенос энергии. Методы

Enzymol. 246: 300–334.

7. Лакович Дж. Р. 2006. Принципы флуоресцентной спектроскопии.

Спрингер, Нью-Йорк.

8.Парсонс, М., Б. Войнович и С. Амир-Бег. 2004. Визуализация взаимодействий белков

в подвижности клеток с использованием флуоресцентного резонанса

передачи энергии (FRET). Biochem. Soc. Пер. 32: 431–433.

9. Lle

` res, D., J. James,., A. I. Lamond. 2009. Количественный анализ уплотнения хроматина

в живых клетках с помощью FLIM-FRET. J. Cell Biol.

187: 481–496.

10. Альбизу, Л., М. Котте,., Т. Дюрру. 2010. FRET

с временным разрешением между лигандами GPCR выявляет олигомеры в нативных тканях.Nat.

Chem. Биол. 6: 587–594.

11. Chen, L., J. Placone,., K. Hristova. 2010. Внеклеточный домен

рецептора 3 фактора роста фибробластов ингибирует лиганд-независимую димеризацию

. Sci. Сигнал. 3: ra86.

12. Stoneman, M. R., S. Patowary,., V. Raicu. 2012. Количественная оценка эффективности различных конструкций FRET

с использованием методов OptiMiS

TM

.Bio-

. 52: 191–195.

13. Селвин, П. Р.2000. Возрождение флуоресценции резонансной передачи энергии

. Nat. Struct. Биол. 7: 730–734.

14. Райку В. и Попеску А. И.. 2008. Интегрированная молекулярная и клеточная

Биофизика. Спрингер, Лондон.

15. Райку, В. 2007. Эффективность резонансного переноса энергии в гомо-

олигомерных комплексах белков. J. Biol. Phys. 33: 109–127.

16. Райку, В. 2010. Определение структуры белкового комплекса

на основе FRET на нанометровом масштабе в живых клетках.В наноскопии

и многомерной оптической флуоресцентной микроскопии. А. Диаспро, редактор

. CRC Press, Бока-Ратон, Флорида.

17. van Rheenen, J., M. Langeslag, and K. Jalink. 2004. Корректировка конфокального захвата

для оптимизации изображения резонанса флуоресценции

Передача энергии посредством сенсибилизированного излучения. Биофиз. J. 86: 2517–2529.

18. Хоппе А., К. Кристенсен и Дж.