Заридатул, факультет

Заридатул. Медицина, Малайский университет, Куала-Лумпур, Малайзия

ДЖАМУНА ВАДИВЕЛУ

¹ Кафедра медицинской микробиологии, Медицинский факультет, Малайский университет, Куала-Лумпур, Малайзия

¹ Кафедра медицинской микробиологии, Медицинский факультет, Малайский университет, Куала-Лумпур, Малайзия

Центр токсикологии и исследований рисков для здоровья (CORE), факультет медицинских наук, Universiti Kebangsaan Malaysia, Куала-Лумпур, Малайзия

³ Школа фармацевтики, Университет Тейлора, кампус Лейксайд, Селангор, Малайзия

⁴ Департамент фармакологии, Медицинский факультет Малайского университета, Куала-Лумпур, Малайзия

Джамуна Вадивелу, кафедра медицинской микробиологии, медицинский факультет, Малайский университет, Куала-Лумпур 50603, Малайзия.Тел .: +603 79676662 ym.ude.mu@anumaj

Поступила 10 мая 2021 г .; Принято в 2021 году 18 июня.

Авторские права 2021, Международный институт противоопухолевых исследований

Резюме

Предпосылки / цель: Изониазид — это антибиотик, используемый для лечения туберкулеза. Ранее мы обнаружили, что производное изониазида (E) -N ’- (2,3,4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразид (ITHB4) может быть разработано как новый антимикобактериальный агент путем оптимизации. Мы дополнительно исследовали способность этого соединения по сравнению с зерумбоном подавлять рост клеток рака молочной железы MCF-7.Материалы и методы. Цитотоксичность измеряли с помощью анализа МТТ и дополнительно подтверждали с помощью анализов апоптоза, ROS, клеточного цикла, фрагментации ДНК и цитокинов. Результаты: ITHB4 продемонстрировал более низкую IC ₅₀ по сравнению с зерумбоном в ингибировании пролиферации клеток MCF-7. ITHB4 не проявлял токсичности в отношении нормальных иммунных клеток молочной железы и человека. Анализ апоптоза показал, что ITHB4 в концентрации, равной IC _50, индуцирует апоптоз клеток MCF-7 и остановку клеточного цикла в фазах sub-G1 и G ₂ / M.ITHB4 запускал накопление внутриклеточных АФК и фрагментацию ядерной ДНК. Секреция провоспалительных цитокинов вызывает воспаление и потенциально иммуногенную гибель клеток. Заключение: ITHB4 обладает почти такими же химиотерапевтическими свойствами, что и зерумбон, в ингибировании роста MCF-7 и, следовательно, обеспечивает основу для дальнейших экспериментов на животных моделях.

Ключевые слова: Апоптоз, синтетическое соединение, активные формы кислорода, цитокин, зерумбон, изониазид, клетки рака молочной железы

Рак молочной железы — наиболее частый вид рака среди женщин, поражающий 2.1 миллион женщин ежегодно (1). В 2020 году в отчете GLOBOCAN указано, что 24,5% случаев рака среди женщин связаны с раком груди, и по оценкам, 684 996 женщин умерли от рака груди (1). Хотя заболеваемость раком груди выше среди женщин в более развитых регионах, прогнозируется рост заболеваемости почти во всех регионах мира. Ранняя диагностика и агрессивные стратегии лечения / профилактики, такие как хирургическое вмешательство в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией, являются текущими клиническими подходами к борьбе с этим заболеванием (2).Однако рецидив опухоли остается серьезной проблемой при лечении рака груди. Более того, действия широкого спектра химиотерапевтических и лучевых агентов, которые не являются селективными в отношении уничтожения раковых клеток, вызывают у пациентов множество нежелательных побочных эффектов (3). Следовательно, они призвали к неотложным мерам и инновациям в противораковой терапии для эффективного лечения этого заболевания.

В последние годы появляются новые исследования по разработке новых синтетических соединений свинца из различных видов растений и животных, а также неморских и морских микробов в качестве многообещающих методов лечения рака (4).Эти синтетические противораковые соединения воспроизводятся на молекулярном уровне, чтобы имитировать встречающиеся в природе соединения, с лучшими свойствами, в том числе более устойчивыми, рентабельными и с более высокой селективностью против рака, чем нормальные клетки (5). Некоторые из синтетических противораковых агентов, включая сорафениб и метотрексат, действуют как ингибиторы тирозинкиназы и антиметаболиты, соответственно, которые используются в клинической практике (6). Также появились новые данные, указывающие на то, что антибиотики эффективны не только для лечения бактериальных инфекций, но и для уничтожения раковых стволовых клеток, не нанося вреда нормальным клеткам (7,8).Например, доксициклин — это антибиотик, используемый для лечения бактериальных инфекций, таких как инфекции мочевыводящих путей и акне, и текущие результаты показывают, что он также подавляет рост раковых стволовых клеток (7). Благодаря этим экспериментальным данным in vitro и , а также дальнейшим исследованиям в ближайшем будущем будет разработано множество новых противораковых методов лечения. Это привело нас к исследованию потенциальных противораковых свойств одного из синтезированных нами производных изониазида. В нашем предыдущем исследовании мы оценили антимикобактериальную активность нескольких аналогов изониазида (9).Мы определили, что одно из производных изониазида, (E) -N ’- (2,3,4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразид (ITHB4), может быть разработано как новый антимикобактериальный агент путем оптимизации исследований. Это же соединение было также протестировано на линии клеток рака толстой кишки человека HCT 116, показав многообещающие цитотоксические эффекты (10). В этом исследовании мы стремились изучить потенциальные противораковые свойства ITHB4 в отношении клеток рака молочной железы и выяснить возможные молекулярные механизмы, с помощью которых это может происходить в клетках карциномы молочной железы MCF-7.Мы сравнили активность ITHB4 с природным фитохимическим зерумбоном, выделенным из субтропического семейства цветковых растений Zingiberaceae. Зерумбон обладает различными биомедицинскими свойствами, такими как антиоксидантные, противовоспалительные и антипролиферативные (11). Подобно ITHB4, зерумбон также ингибирует рост колоний Mycobacterium tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена (12). Кроме того, известно, что зерумбон проявляет избирательную токсичность в отношении различных линий раковых клеток, включая рак груди (13).Таким образом, мы исследовали, может ли ITHB4 также служить противораковым агентом, подобным зерумбону.

Материалы и методы

Синтез и очистка исследуемых соединений. ITHB4 был приготовлен по методике, описанной в нашей предыдущей работе (14). Структуры аналогов изониазида и пути реакции приведены в и. Соединение свинца получали реакцией 2,3,4-тригидроксибензальдегида (1,0 экв.) С изониазидом (1,0 экв.) В смеси этанол / вода.После перемешивания в течение 1-3 часов при комнатной температуре полученную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток, очищенный промыванием холодным этанолом и этиловым эфиром, давал чистое производное. Монокристаллы коричневого цвета, пригодные для рентгеноструктурного анализа, были получены перекристаллизацией из этанола. Химическая структура соединения свинца была охарактеризована с использованием различных спектроскопических методов, а окончательная структура была подтверждена рентгеновской кристаллографией (12).

Структуры (E) -N ’- (2, 3, 4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразида (ITHB4).

Синтетический путь, используемый для получения (E) -N ’- (2, 3, 4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразида (ITHB4).

Соединение свинца состоит из молекулы ITHB4 и двух кристаллизационных молекул воды (). Молекула основания Шиффа существует в E-конфигурации по отношению к ациклической связи C7 = N3 [C7 = N3 = 1,2921 (10) Å; торсионный угол N2 — N3 — C7 — C8 = 178,85 (7)]. Внутримолекулярная водородная связь O2-h2O2 ··· N3 образует шестичленное кольцо, образуя мотив кольца S (6).Пиридиновое кольцо с последовательностью атомов C1 / C2 / N1 / C3 / C4 / C5 по существу является плоским, с максимальным отклонением 0,0119 (8) Å при атоме C5. Между пиридиновым и бензольным кольцами имеется небольшой наклон, на что указывает двугранный угол, образованный 7,30 (4). Все длины связей и углы соответствуют тем, которые наблюдаются в близкородственных изониазидных структурах.

В кристаллической упаковке молекулы воды играют важную роль в формировании структуры с водородными связями. Соседние молекулы соединены в двумерные массивы, параллельные плоскости (101), межмолекулярными O3 — h2O3 ··· N1, O4 — h2O4 ··· O1W, N2 — h2N2 ··· O2W, O1W — h2W1 ··· O1, Водородные связи O2W — h3W2 … O4 и C7 — H7A … O2W.Эти массивы дополнительно связаны межмолекулярными водородными связями O1W-h3W1 ··· O2W, O2W-h2W2 ··· O2 и C4-h5A ··· O1 в трехмерную протяженную структуру. Слабые межмолекулярные π – π ароматические стэкинг-взаимодействия с участием пиридинового и бензольного колец [Cg1 ··· Cg2 = 3,5627 (5) Å, код симметрии: –x + 2, –y + 1, –z + 2] стабилизируют кристалл. состав.

ITHB4 спектральные данные: бледно-коричневое твердое вещество; УФ (λmax): 331 нм, ИК (см-1; KBr) 3383 (OH), 3256 (NH), 1659 (C = O), 1618 (C = N). 1H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) d: 12.18 (с, 1H, –CONH), 11,29 (с, 1H, –OH), 9,58 (с, 1H, –OH), 8,80-8,78 [дд, 2H, J = 5,92 Гц, 2,2 Гц, (Pr – a –CH)], 8,56 (с, 1H, OH), 8,49 (с, 1H, N = CH), 7,84–7,82 [дд, 2H, J = 5,88 Гц, 2,2 Гц, (Pr – α – CH)], 6,85–6,82 [д, 1H, J = 11,4 Гц (Ar – H)], 6,42–6,39 [д, 1H, J = 11,28 Гц, (Ar – H)]. 13С ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ; 162,50, 152,36, 151,14, 149,97, 148,58, 141,05, 133,70, 122,23, 111,81, 108,76. МС – ESI m / z (%) — [M + Na] + 296,10 (100). Анальный. Расчетное для C13h21 N3 O4 (273,07): C 57,14; H 4,06; N 15,38; найдено: C 57,11; Н, 4.09; N 15,36.

Химия и реактивы. Для синтеза ITHB4 2,3,4-тригидроксибензальдегид и изониазид были получены от Millipore Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Для реакции использовали растворители чистоты для ВЭЖХ. Реагенты и все растворители были аналитически чистыми и использовались без дополнительной очистки. Предварительно покрытые алюминиевые листы силикагель 60 F254 (Merck, Дармштадт, Германия), пластины ТСХ использовали для контроля за ходом реакции, используя дихлорметан / метанол в качестве подвижной фазы.Все использованные химические вещества и растворители были наивысшего доступного аналитического качества. Расходные материалы и среды для клеточных культур, фетальная бычья сыворотка (FBS), пируват натрия, заменимые аминокислоты, пенициллин / стрептомицин и ДМСО были получены от Sigma Aldrich (Малайзия). Зерумбон (положительный контроль) и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), использованные в этом исследовании, были приобретены у Sigma Aldrich (Малайзия).

Культура клеток. Клеточная линия эстроген-зависимой карциномы молочной железы (MCF-7) и линия неканцерогенных эпителиальных клеток (MCF10A) были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд, США).Клетки MCF10A культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) / F12 Ham’s, с добавлением 10% FBS (Sigma), 10 нг / мл эпидермального фактора роста (Sigma), 10 мкг / мл инсулина (Sigma), 0,5 мг. / мл гидрокортизона (Sigma), 100 нг / мл холерного токсина (Sigma), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Между тем, клетки MCF-7 размножали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.Все эти клетки размножали в инкубаторе, увлажненном при 37 ° C с 5% CO ₂ .

Выделение и поддержание мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Выделение PBMC из лейкоцитов проводили, как описано ранее (15). Вкратце, от каждого здорового человека получали 10 мл цельной крови в пробирках с гепарином лития BD Vacutainer (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США), и PBMC выделяли центрифугированием в градиенте плотности над Ficoll-Paque TM (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).Клетки ресуспендировали в замораживающей среде (10% ДМСО в 90% эмбриональной бычьей сыворотке (FBS) (Gibco, Карлсбад, Калифорния, США) и криоконсервировали в жидком азоте до использования. Эта часть исследования была проведена после одобрения Комитет по медицинской этике (MEC) Медицинского центра Университета Малайи (каталожный номер 938.42). Письменное согласие было получено от всех участников перед включением в исследование.

Первичная культура клеток. PBMC размножали в среде RPMI1640 с добавлением HEPES буфер (25 мМ), L-глутамин (2 мМ), пенициллин (100 Ед / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), пируват натрия (1 мМ), гентамицин (1 мг / мл) (все закуплено у Life Technologies, Виктория, Австралия) и 10% FBS (Gibco).IL-2 был добавлен к культуре PBMC для увеличения пролиферации клеток. Эти клетки размножали в инкубаторе, увлажненном при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 24 часов.

Анализ цитотоксичности in vitro ITHB4 в клетках MCF-7 и MCF10A. Половинную максимальную ингибирующую концентрацию IC ₅₀ (, т.е. концентрации, при которых рост клеток снижался наполовину) ITHB4 на клетках MCF-7 определяли с использованием анализа МТТ. Клетки высевали в трех экземплярах в 96-луночный планшет при плотности 2 × 10 ⁵ клеток / мл в 100 мкл культуральной среды.ITHB4 растворяли в ДМСО в концентрации 1 мг / мл, из чего готовили рабочие растворы в полной культуральной среде перед обработками. Эти рабочие растворы готовили серийным разведением как таковых 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50 и 25 мкг / мл. Необработанные клетки MCF-7 использовали в качестве отрицательного контроля в этом эксперименте. Клетки инкубировали в течение 24 и 48 часов соответственно, после чего их жизнеспособность оценивали, добавляя к клеткам 20 мкл МТТ, 5 мг / мл, в темноте. Затем планшеты накрывали алюминиевой фольгой и инкубировали еще 4 часа.Затем все среды удаляли и к клеткам добавляли 100 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана. Впоследствии оптическую плотность считывали при длине волны 570 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Способность ITHB4 к ингибированию роста клеток определялась в терминах IC ₅₀ . Зерумбон использовался на протяжении всего этого исследования в качестве положительного контроля для сравнения активности ITHB4 в ингибировании роста клеток MCF-7. Кроме того, был определен IC ₅₀ зерумбона. Аналогичный протокол был повторен с MCF10A.

Анализ цитотоксичности ITHB4 in vitro на культуре PBMC. Для тестирования уровня токсичности 97,55 мкг / мл ITHB4 на иммунных клетках человека РВМС высевали из расчета 1 × 10 ⁵ клеток / лунку в 96-луночный планшет и инкубировали в течение ночи. На следующий день клетки культивировали с ITHB4 при концентрации IC ₅₀ в течение 48 часов. МТТ добавляли к клеткам в темноте за 4 ч до прекращения эксперимента путем добавления ДМСО. Оптическую плотность считывали при длине волны 570 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.Цитотоксичность зерумбона при концентрации IC ₅₀ исследовали с использованием аналогичных протоколов.

Обнаружение апоптоза. Апоптотический эффект ITHB4 и зерумбона на клетки MCF-7 при концентрациях IC ₅₀ определяли с использованием набора Tali ^® Apoptosis Kit, содержащего аннексин V Alexa Fluor ^® 488 и йодид пропидия (PI) от ThermoFisher Scientific ( Уолтем, Массачусетс, США). Вкратце, перед анализом клетки обрабатывали IC ₅₀ ITHB4 и зерумбоном в течение 48 часов.Клетки собирали с 6-луночных планшетов с использованием трипсина, центрифугировали при 300 × g в течение 10 мин, ресуспендировали в ABB (связывающий буфер аннексина V) и инкубировали с аннексином V Alexa Fluor 488 при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин. После центрифугирования при 300 × g в течение 5 минут клетки снова ресуспендировали в ABB и инкубировали с PI при комнатной температуре в темноте в течение 5 минут. Клетки немедленно исследовали с использованием цитометра на основе изображений Tali ^® (ThermoFisher). Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FCS Express Research Edition (версия 4.03; De Novo Software, Нью-Джерси, Нью-Джерси, США) и выражается как процент клеток в каждой популяции, такой как живые, мертвые и апоптотические клетки. Также был получен визуальный результат, при котором апоптотические клетки окрашивались в зеленый цвет из-за Аннексина V Alexa Fluor ^® 488, мертвые клетки окрашивались как красным PI, так и зеленым Аннексином V Alexa Fluor ^® 488, а живые клетки не окрашивались ни одним из них. PI или аннексин V Alexa Fluor ^® 488.

Анализ клеточного цикла. Влияние ITHB4 и зерумбона на распределение клеток MCF-7 в клеточном цикле изучали с помощью BD BrdU FITC Assay.Их обрабатывали 97,60 мкг / мл и 126,7 мкг / мл ITHB4 и зерумбона, соответственно, в течение 48 часов с последующей инкубацией с 10 мкМ бромдезоксиуридина (BrdU) в течение 30 минут. Затем клетки отделяли трипсином и инкубировали с 20 мкл анти-BrdU-FITC в течение 20 минут, а также с 2,5 мкл 7-аминоактиномицина D (7-AAD) в течение 15 минут в соответствии с инструкциями производителя (BrdU Flow Kit, BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, США). Анализ выполняли с использованием проточного цитометра BD FACSCanto II (BD Biosciences) и FlowJo v7.6.5 64-битное программное обеспечение (Treestar, Ashland, OR, США).

Анализ активных форм кислорода (АФК). Определение уровней ROS после инкубации клеток MCF-7 с IC ₅₀ ITHB4 или zerumbone выполняли в соответствии с инструкциями производителя (Mitosciences, DCFDA Cellular ROS Detection Assay Kit; Mitoscience / Abcam, Cambridge, UK). В наборе используется 2 ’, 7’-дихлорфлуоресцеиндиацетат (DCFDA) — реагент, проникающий в клетки, — флуорогенный краситель, который измеряет гидроксил, пероксил и любые другие внутриклеточные ROS.После диффузии в клетку DCFDA деацетилируется клеточными эстеразами до нефлуоресцентного соединения, которое впоследствии окисляется внутриклеточными ROS до DCF. DCF обладает высокой флуоресценцией и может быть обнаружен с помощью флуоресцентной спектроскопии при 495 нм (возбуждение) и 529 нм (эмиссия). Вкратце, клетки MCF-7 высевали в течение ночи в 96-луночный планшет в 100 мкл культуральной среды в темноте. В день эксперимента клетки инкубировали с IC ₅₀ ITHB4 и зерумбоном в течение 48 часов.На следующий день клетки инкубировали с 25 мкМ DCFH-DA в темноте в течение 45 мин. Позже DCFH-DA удаляли, а клетки промывали 1 × буферным раствором. Флуоресценцию, исходящую от клеток каждой лунки, измеряли и записывали при 485 нм (возбуждение) и 535 нм (испускание) с использованием устройства для считывания микропланшетов Varioskan Flash (Thermo-Scientific).

Анализ фрагментации ДНК. Чтобы определить влияние ITHB4 и zerumbone на целостность ДНК раковых клеток, был проведен анализ фрагментации ДНК, при котором клетки MCF-7 обрабатывали 97.60 мкг / мл и 126,7 мкг / мл ITHB4 или зерумбона соответственно в течение 48 часов. Затем клетки собирали и центрифугировали при 650 × g в течение 5 минут при 4 ° C. Полученные осадки собирали, и ДНК экстрагировали с использованием коммерческого мини-набора QIAamp DNA (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Количество ДНК в каждом образце измеряли и 10 мкг ДНК подвергали электрофорезу в 1,2% (мас. / Об.) Агарозном геле. Гель визуализировали с использованием источника УФ-света и отображали с помощью системы документации геля Gel Doc XR (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK).

Анализ цитокинов Th2 / Th3 / Th27. Для исследования секреции различных цитокинов в супернатанте клеток MCF-7, обработанных IC ₅₀ концентрацией ITHB4 или зерумбона, коммерчески доступный набор BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Th2 / Th3 / Th27 Cytokine kit (BD Biosciences ) использовался в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, супернатант культуры собирали и фильтровали через фильтр Steriflip ^® с размером пор 0,22 мкм (Millipore, Billerica, MA, USA).Супернатанты необработанных клеток использовали в качестве отрицательного контроля. Анализ определяет уровни IL-2, IFN-, γ , TNF-, α , IL-6, IL-10, IL-4 и IL-17A. Образцы были получены на FACSCanto II (BD Biosciences) и проанализированы с использованием программного обеспечения для массивов FCAP (BD Biosciences).

Статистический анализ. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), а n относится к количеству независимых экспериментов. Уровни значимости для сравнений между двумя или более независимыми выборками определяли с использованием двустороннего непарного критерия Стьюдента t .Различия считались достоверными при * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001. Группы сравнивали с помощью одностороннего или двустороннего дисперсионного анализа, и для исследования значимости применяли апостериорный тест Бонферрони с использованием GraphPad Prism Version 8.0 (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США).

Результаты

Уровень цитотоксичности ITHB4. Анализ МТТ проводили для определения цитотоксичности синтезированного соединения против линии клеток рака молочной железы MCF-7 в два разных момента времени, 24 часа и 48 часов ().ITHB4 значительно ингибировал рост клеток MCF-7 при всех концентрациях. Однако было обнаружено, что IC ₅₀ ITHB4 ниже через 48 часов (97,55 мкг / мл) по сравнению с 24 часами (142 мкг / мл), и он был статистически значимым при значении p , равном 0,0072, что указывает на то, что ITHB4 более эффективно ингибировал клетки MCF-7 в более длительный момент времени (рис. 3А). Между тем, зерумбон подавлял рост клеток MCF-7 при более низком значении IC ₅₀ через 48 часов (126,7 мкг / мл) по сравнению с 24 часами (IC ₅₀ : 127 мкг / мл), однако статистической разницы не было. значительный с p -значение 0.0649 (Рисунок 3B). На основании этих данных для дальнейшего анализа был выбран период лечения в 48 часов для ITHB4 и zerumbone. Более низкая концентрация ITHB4 по сравнению с зерумбоном требовалась для снижения роста клеток MCF-7 наполовину (97,55 против ,126,7 мкг / мл) и статистической значимости разницы между выживаемостью клеток MCF-7 после 48-часовой обработки ITHB4. и zerumbone был маргинальным с p -значение 0,048 (Рисунок 3C). И ITHB4, и зерумбон не проявляли цитотоксичности в отношении нормальных клеток молочной железы и PBMC при их соответствующей концентрации IC ₅₀ (фигура 3D, E, F и G).

Сравнительная цитотоксическая активность ITHB4 и зерумбона на MCF-7, MCF10A и культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) через 24 и 48 часов. (A) Дозозависимое ингибирование выживания клеток MCF-7, обработанных ITHB4, как определено с помощью анализа MTT. Различные периоды лечения по-разному влияют на эффективность ITHB4 in vitro. (B) Дозозависимое ингибирование выживаемости клеток MCF-7, обработанных зерумбоном, как определено с помощью анализа MTT. Различные периоды лечения по-разному влияют на эффективность лечения зерумбоном in vitro.(C) Дозозависимое ингибирование выживания клеток mCF-7 после обработки ITHB4 или зерумбоном в течение 48 часов. (D) Дозозависимый эффект обработки ITHB4 в течение 48 часов на выживаемость клеток MCF10A, как определено с помощью анализа МТТ. ITHB4 не обнаружил явного ингибирования роста клеток MCF10A. (E) Дозозависимый эффект обработки ITHB4 в течение 48 часов на выживаемость PBMC, как определено с помощью анализа MTT. ITHB4 не показал очевидного ингибирования пролиферации PBMC. (F) Дозозависимый эффект обработки зерумбоном в течение 48 часов на выживаемость клеток MCF10A, как определено с помощью анализа МТТ.Zerumbone не показал очевидного ингибирования роста клеток MCF10A. (G) Дозозависимый эффект лечения зерумбоном в течение 48 часов на выживаемость PBMC, как определено с помощью анализа MTT. Zerumbone не продемонстрировал явного ингибирования пролиферации культуры PBMC. Кривые «доза-ответ» получали с использованием модели логистического нелинейного регрессионного анализа. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для повторяющихся образцов по крайней мере двух независимых экспериментов.

ITHB4 индуцирует апоптоз в клетках MCF-7. Для исследования роли апоптоза в противоопухолевом эффекте ITHB4 использовали набор Tali ^® Apoptosis, содержащий аннексин V Alexa Fluor ^® 488 и PI. Результаты показали, что при его концентрации IC ₅₀ ITHB4 индуцировал апоптоз клеток MCF-7 через 48 часов обработки; однако этот эффект не превышал эффект зерумбона, в результате чего обработка зерумбоном с концентрацией IC ₅₀ приводила к скорости апоптоза 35% по сравнению с ITHB 4 (26%) (A и B).

Процент апоптотических клеток в необработанных и обработанных клетках MCF-7. А) ITHB4 индуцирует апоптоз клеток MCF-7 после 48 часов обработки. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение (SD) 3 независимых экспериментов. Статистический анализ считается значимым, если * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001. B) Репрезентативный визуальный результат цитометра на основе изображений Tali®, показывающий апоптотические клетки, окрашенные в зеленый цвет из-за аннексина V Alexa Fluor ^® 488 (a и d), мертвые клетки, окрашенные как красным PI, так и зеленым аннексином V Alexa Fluor ^® 488 (б), и живые клетки, не окрашенные ни PI, ни аннексином V Alexa Fluor ^® 488 (в).

ITHB4 индуцировал G ₂ / M остановку клеточного цикла. Окрашивание BrdU FITC и проточно-цитометрический анализ проводили для исследования распределения фаз клеточного цикла клеток MCF-7, обработанных IC _{50 концентрацией} ITHB4 в течение 48 часов (A). Наблюдалось значительное увеличение на 39,6% доли обработанных ITHB4 клеток в фазе G ₂ / M ( p <0,001), тогда как доля необработанных клеток составляла только 15.2%. Доля клеток, обработанных зерумбоном, немного увеличилась на 20,5% (рис. 5B). Между тем, популяция клеток в S-фазе была уменьшена (3,5%) с помощью ITHB4 и (1,5%) зерумбона по сравнению с необработанными клетками (25%). Напротив, высокая доля обработанных зерумбоном клеток была обнаружена в основном в фазе G0 / G1 (60,2%) по сравнению с необработанными клетками MCF-7 (51%) и клетками, обработанными ITHB4 (50%) ( p <0,001). . Кроме того, доля клеток в фазе суб-G0 / G1, которая косвенно представляет апоптотические клетки, также резко увеличилась с 2% в необработанных клетках до 6.0% и 11,3% в клетках, обработанных 97,60 мкг / мл и 126,7 мкг / мл ITHB4 и зерумбоном, соответственно ( p <0,01). Эти результаты предполагают, что ITHB4 проявляет значительный противоопухолевый эффект и приводит к остановке клеточного цикла MCF-7 в фазе G ₂ / M, тогда как зерумбон, по-видимому, останавливает пролиферацию клеток MCF-7 в фазе G0 / G1.

Распределение клеточного цикла необработанных и обработанных клеток MCF-7. A) График разброса проточного цитометрического анализа необработанных клеток MCF-7, клеток, обработанных концентрацией ITHB4 IC ₅₀ , и клеток, обработанных концентрацией зерумбона IC ₅₀ .B) Количественный анализ показал остановку клеточного цикла MCF-7 в фазе G2 / M после обработки ITHB4. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение 3 независимых экспериментов. Статистический анализ считается значимым, если * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001.

ITHB4 индуцировал фрагментацию ДНК в клетках MCF-7. Деградация ДНК в виде лестницы является признаком гибели клеток, вызванной ROS. Мы наблюдали, что ITHB4 ингибировал пролиферацию MCF-7 в фазе G ₂ / M клеточного цикла и впоследствии увеличивал количество клеток в фазе суб-G1, предполагая индукцию апоптоза.Затем мы определили, индуцирует ли ITHB4 фрагментацию ДНК в клетках MCF-7. Как показано на фиг.4, ITHB4 запускает образование и появление апоптотических фрагментов ДНК на агарозном геле, подтверждая, что цитотоксический эффект ITHB4 на клетки MCF-7 опосредован апоптотическим путем. Точно так же зерумбон также индуцировал фрагментацию ДНК в клетках MCF-7.

Изображение геля 1,2% агарозы, показывающее, что ITHB4 вызывает фрагментацию ДНК. Дорожка 1: лестница ДНК 1000 п.н., Дорожка 2: необработанные клетки MCF-7, Дорожка 3: клетки, обработанные IC _{50, концентрация} ITHB4, Дорожка 4: необработанные клетки MCF-7 и Дорожка 5: обработанные клетки MCF-7 с концентрацией зерумбона IC ₅₀ .

Производство клеточных активных форм кислорода (АФК) в клетках, обработанных ITHB4. Избыточный уровень АФК в клетках может вызвать повреждение белков, нуклеиновых кислот, липидов, мембран и органелл, что может привести к апоптозу. Мы наблюдали значительное увеличение продукции ROS в клетках, обработанных ITHB4, по сравнению с zerumbone (), предполагая, что эффекты ITHB4 могут происходить через активацию событий, инициированных митохондриями.

Генерация активных форм кислорода (АФК) в обработанных клетках MCF-7.Интенсивность флуоресценции после обработки концентрацией ITHB4 или зерумбона IC ₅₀ в течение 48 часов. График показывает, что ITHB4 индуцирует выработку более высоких уровней клеточных АФК. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение (SD) 3 независимых экспериментов. Статистический анализ считается значимым, если * p <0,05.

Дифференциальная секреция цитокинов Th2 / Th3 / Th27 в клетках MCF-7, обработанных ITHB4. Чтобы охарактеризовать профили цитокинов, высвобождаемых из клеток MCF-7 после обработки ITHB4 или зерумбоном, мы измерили экспрессию провоспалительного Th2 (IL-2, IL-6, TNF- α и IFN- γ ), Th3 (IL-4), иммунорегуляторные (IL-10) и Th27 (IL-17A) цитокины в супернатантах культур.показывает, что как ITHB4, так и зерумбон увеличивали уровни IL-2, IL-6, TNF- α , IFN- γ , IL-4, IL-10 и IL-17A по сравнению с необработанными клетками MCF-7. В частности, IL-2, IL-6, IL-17A и TNF- α показали значительное увеличение ( p <0,001). Кроме того, было обнаружено, что IFN-, γ, и IL-10 значительно увеличиваются ( p <0,01 и p <0,05) в культуральном супернатанте обработанных зерумбоном клеток MCF-7. Кроме того, были обнаружены более высокие уровни IL-4, но разница по сравнению с необработанными клетками MCF-7 была незначительной.ITHB4 сильно усиливал экспрессию TNF-α в обработанных супернатантах культур ( p <0,001). Кроме того, уровни IL-6, IL-2 и IFN- γ были значительно увеличены ( p <0,01, p <0,01 и p <0,05, соответственно) в MCF, обработанных ITHB4. 7 сот. Однако повышение уровней цитокинов IL-10 и IL17A в культуральном супернатанте обработанных ITHB4 клеток не было значительным. Эти данные свидетельствуют о том, что ITHB4 и зерумбон по-разному регулируют продукцию цитокинов в клетках MCF-7 и, возможно, активируют разные пути.Тем не менее, повышение уровней TNF-α и IL-6 в клетках MCF-7 позволяет предположить, что ITHB4 и зерумбон индуцировали воспаление и активацию внешнего пути опухолевых клеток.

Лечение ITHB вызывает секрецию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в клетках MCF-7 через 48 часов инкубации. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение (SD) 3 независимых экспериментов. Статистический анализ считается значимым, если * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0.001. ns: Незначительно.

Обсуждение

Поиск эффективных противораковых методов лечения остается серьезной проблемой для исследователей и онкологов. Современные стратегии лечения, такие как химиотерапия, облучение или персонализированные и целевые биологические агенты, часто являются лишь частично эффективными и неизменно сопровождаются нежелательными побочными эффектами, которые могут привести к рецидиву опухоли с более агрессивными фенотипами (16). Для решения этой проблемы в клинической практике может потребоваться увеличение дозировки химиотерапевтических препаратов, чтобы способствовать лучшему уничтожению опухолей, однако это приводит к увеличению токсичности лекарств, что сопровождается множеством нежелательных побочных эффектов, ухудшающих иммунитет организма, а также повышенная восприимчивость к инфекции (17).В доклинических и клинических условиях было проведено множество исследований способности природных соединений лечить рак, некоторые из которых успешно продемонстрировали значительное снижение активности заболевания с меньшим количеством побочных эффектов (18). Однако устойчивость и селективность встречающихся в природе соединений — это самые большие проблемы, которые необходимо решить. Следовательно, были проведены значительные исследования по разработке синтетических соединений, полученных из природных соединений, которые, как было установлено, обладают противораковыми свойствами.Эти синтетические соединения имеют молекулярную структуру, аналогичную природным соединениям, содержат точные активные ингредиенты и имеют гораздо более безопасные профили (19,20).

В этом исследовании мы сравнили противоопухолевую активность нашего синтетического соединения ITHB4 с природным соединением зерумбоном на клетках карциномы молочной железы MCF-7. Что касается его химической структуры, ITHB4 имеет бензольные и пиридиновые кольца, при этом производные пиридина, как известно, обладают множеством биологических активностей, а именно противоастматическим, антибактериальным, противосудорожным, противомалярийным, антимускариновым, антипротозойным, противовоспалительным действием. онкологические, противодиабетические и противовоспалительные (21).Точно так же мы обнаружили, что ITHB4 демонстрирует дозозависимую индукцию гибели клеток в клетках рака груди. В то же время зерумбон оказывал аналогичное дозозависимое действие киллинга клеток на клетки MCF-7. Однако ITHB4 показал более низкий IC ₅₀ после лечения в течение 48 часов по сравнению с zerumbone. Кроме того, оба соединения не оказывали цитотоксического действия на MCF10A и PBMC. В свете этого результаты настоящего исследования могут иметь важное значение в отношении включения синтетических соединений в стандартную противоопухолевую терапию.

Несколько важных результатов этого исследования показывают, что ITHB4 потенциально может использоваться в качестве химиотерапевтического агента для лечения рака груди. Во-первых, ITHB4 показал более низкую IC ₅₀ по сравнению с зерумбоном, что указывает на эффективность синтетического соединения. Предыдущее исследование продемонстрировало, что синтетические соединения с гидроксильной группой в бензольном кольце, такие как ITHB4, могут обладать противораковой активностью (22). Хотя ITHB4 значительно индуцировал апоптоз клеток MCF-7 по сравнению с необработанными клетками, было обнаружено, что это важный механизм, ответственный за цитотоксичность соединения (23), зерумбон более эффективен в уничтожении раковых клеток, что свидетельствует о селективности природного соединения против раковые клетки (11).Мы также подтвердили, что это синтетическое соединение индуцировало гибель клеток через индукцию фрагментации ДНК . Наши результаты показали, что ITHB4 вызывает фрагментацию ДНК, которая потенциально приводит к повреждению ДНК и гибели клеток. Аналогичное наблюдение было сделано на клетках MCF-7, обработанных зерумбоном. Сообщается, что фрагментация ДНК указывает на повреждение ядра на поздних стадиях конденсации хроматина (24). Это связано с тем, что раковые клетки подвергаются окислительному стрессу во время лечения ITHB4 или зерумбоном, что приводит к чрезмерному производству ROS.Тем не менее, более высокая продукция ROS была обнаружена в клетках MCF-7, обработанных ITHB4 и зерумбоном. Эти высокие клеточные уровни АФК могут вызывать повреждение белков, нуклеиновых кислот и органелл, что может привести к активации процессов гибели клеток, таких как апоптоз и, в частности, митохондриальный апоптоз (25). Это также предполагает, что ITHB4 использует собственный путь гибели митохондриальных клеток, чтобы вызвать апоптоз в клетках MCF-7.

Чтобы еще больше подтвердить это, увеличение доли клеток в суб-G0 / G1-фазе клеточного цикла было обнаружено как в обработанных клетках MCF-7, так и в более выраженных в тех, которые лечили зерумбоном.Кроме того, противоопухолевый эффект ITHB4 также приводит к остановке клеточного цикла MCF-7 в фазе G ₂ / M, что может указывать на повреждение внутриклеточной ДНК в раковых клетках, приводящее к апоптозу (26). Напротив, зерумбон остановил пролиферацию раковых клеток в фазе клеточного цикла G ₀ / G ₁ , что указывает на то, что зерумбон может играть роль в ингибировании деления раковых клеток (10). Наши результаты также показали, что обработка клеток MCF-7 с помощью ITHB4 или зерумбона аналогичным образом влияет на секрецию цитокинов.Тем не менее, секреция этих цитокинов была усилена в раковых клетках, обработанных зерумбоном. ITHB4 активировал различные провоспалительные цитокины, особенно TNF-α и IL-6. Это говорит о том, что в обработанных клетках индуцировалось чрезмерное воспаление, которое потенциально могло привести к гибели иммуногенных клеток, посылая сигналы иммунным клеткам, таким как дендритные клетки, для воздействия на обработанные клетки (27,28). Активация IL-6 указывает на активацию опосредованной рецептором гибели клеток, и в то же время секреция ROS может также потенциально индуцировать активацию пути гибели митохондриальных клеток.Увеличение уровней секретируемого IL-10 из клеток, обработанных ITHB4, хотя и не является статистически значимым, усиливает экспрессию провоспалительных цитокинов или активацию иммунного ответа. В подтверждение этого было показано, что слишком много IL-10 может привести к ингибированию пролиферации Т-клеток и роста опухоли (29).

Мы признаем, что это исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, исследование пути апоптоза, связанного с ITHB4-индуцированной остановкой клеточного цикла в клетках MCF-7, может быть дополнительно изучено с помощью нескольких других методов, включая анализ экспрессии генов, связанных с циклом, апоптоза и повреждений ДНК.Это дополнительно подтвердит наши выводы в этом исследовании, касающиеся апоптотических эффектов, вызванных ITHB4, по сравнению с зерумбоном (30). Во-вторых, несколько других типов клеточных линий рака молочной железы, таких как MDA-MB-231, MDA-MB-453 и другие, наряду с клеточными линиями, полученными из разных типов опухолей, также следует использовать в будущих исследованиях для подтверждения того, что противоопухолевый эффект ITHB4 не является специфичным для раковых клеток (31).

Заключение

В этой работе мы сообщаем о цитотоксической активности ITHB4, которая была оценена по отношению к линии клеток MCF-7.По сравнению с зерумбоном, ITHB4 показал более низкую IC ₅₀ в анализе пролиферации клеток, что свидетельствует об эффективности соединения и способности индуцировать апоптоз за счет высвобождения ROS, фрагментации ДНК и остановки клеточного цикла на G ₂ / М фаза. Взятые вместе, это исследование предоставляет доказательства того, что соединения на основе препарата изониазид, которые использовались для лечения туберкулеза, могут быть дополнительно исследованы для открытия новых ведущих соединений против рака груди.

Конфликты интересов

Авторы хотят подтвердить, что нет известных конфликтов интересов, связанных с этой публикацией, и не было значительной финансовой поддержки этой работы, которая могла бы повлиять на ее результат.

Вклад авторов

КМВ, ВМ и НХС разработали проект. МБ провел эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись. AKZ принимал участие в составлении и редактировании рукописей. СП участвовало в получении финансирования, экспериментальном проектировании и составлении рукописей.Все авторы обсудили результаты и внесли свой вклад в рукопись.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой грантов на фундаментальные исследования (FRGS) (FP109-2019A), грантом Министерства образования (MOE) на исследование, озаглавленное «Противораковая активность гиперфорина против клеток рака молочной железы: идентификация гибели клеток. и пути аутофагии ». Muttiah BARATHAN получил финансовую поддержку студентов Университета Малайи от IPPP, UM. Однако спонсоры не играли никакой роли в этом исследовании.

Ссылки

1. Сунг Х., Ферлей Дж., Сигель Р.Л., Лаверсанн М., Сурджоматарам И., Джемаль А., Брей Ф. Глобальная статистика рака 2020: оценки GLOBOCAN заболеваемости и смертности от 36 раковых заболеваний в 185 странах во всем мире. CA Cancer J Clin. 2021. 71 (3): 209–249. DOI: 10.3322 / caac.21660. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Кардосо Ф., Кириакидес С., Оно С., Пено-Льорка Ф., Поортманс П., Рубио ИТ, Закриссон С., Сенкус Э., Комитет по руководствам ESMO. Электронный адрес: Clinicalguidelines @ esmo.org Ранний рак груди: Руководство ESMO по клинической практике по диагностике, лечению и последующему наблюдению † Ann Oncol. 2019; 30 (8): 1194–1220. DOI: 10.1093 / annonc / mdz173. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Пуччи К., Мартинелли С., Чофани Г. Инновационные подходы к лечению рака: текущие перспективы и новые проблемы. Раковая медицина. 2019; 13: 961. DOI: 10.3332 / ecancer.2019.961. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4. Мархольд М., Томасич Э., Шварц М., Удовица С., Хайнцель А., Майер П., Хорак П., Перко П., Крайнер М.Синтетические летальные комбинации малотоксичных лекарств от рака груди идентифицировали in silico с помощью генетического скрининга на дрожжах. Oncotarget. 2018; 9 (91): 36379–36391. DOI: 10.18632 / oncotarget.26372. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Халифа СЭМ, Элиас Н., Фараг М.А., Чен Л., Саид А., Хегази М.Ф., Мустафа М.С., Абд Эль-Вахед А., Аль-Мусави С.М., Мушарраф С.Г., Чанг Ф.Р., Ивасаки А., Суэнага К., Аладжлани М., Йоранссон Ю. El-Seedi HR. Морские натуральные продукты: источник новых противоопухолевых препаратов.Mar Drugs. 2019; 17 (9): 491. DOI: 10.3390 / md170. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Falzone L, Salomone S, Libra M. Эволюция фармакологических методов лечения рака на рубеже третьего тысячелетия. Front Pharmacol. 2018; 9: 1300. DOI: 10.3389 / fphar.2018.01300. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Lamb R, Ozsvari B, Lisanti CL, Tanowitz HB, Howell A, Martinez-Outschoorn UE, Sotgia F, Lisanti MP. Антибиотики, нацеленные на митохондрии, эффективно уничтожают раковые стволовые клетки при различных типах опухолей: лечение рака как инфекционного заболевания.Oncotarget. 2015; 6 (7): 4569–4584. DOI: 10.18632 / oncotarget.3174. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Гао Й, Шан Q, Ли В., Гуо В., Стоядинович А., Маннион С., Ман Ю. Г., Чен Т. Антибиотики для лечения рака: палка о двух концах. J Рак. 2020; 11 (17): 5135–5149. DOI: 10.7150 / jca.47470. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Парумасивам Т., Навин Кумар Х., Ибрагим П., Садикун А., Мохамад С. Противотуберкулезная активность липофильных производных изониазида и их взаимодействия с противотуберкулезными препаратами первой линии.Журнал фармацевтических исследований. 2018; 7 (4): 313–317. DOI: 10.1016 / j.jopr.2013.04.039. [CrossRef] [Google Scholar] 10. Навин Кумар Х., Парумасивам Т., Джумаат Ф., Ибрагим П., Асмави М., Садикун А. Синтез и оценка производных изоникотиноилгидразона в качестве антимикобактериальных и противораковых агентов. Исследования в области медицинской химии. 2020; 23 (1): 269–279. DOI: 10.1007 / s00044-013-0632-2. [CrossRef] [Google Scholar] 11. Гириса С., Шабнам Б., Мониша Дж., Фан Л., Халим С.Э., Арфусо Ф., Ан К.С., Сетхи Г., Куннумаккара А.Б. Потенциал зерумбона как противоракового средства.Молекулы. 2019; 24 (4): 734. DOI: 10,3390 / молекулы24040734. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Лалло С., Касим С., Тайеб Р., Хасан А., Сере Н., Исмаил I, Арифин Т. Анализ Зерумбоне, Далам Зингибер, зерумбет, Дан Активитас, Penghambatannya, Terhadap Bakteri Mycobacterium tuberculosis. Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) (электронный журнал) 2020; 4 (2): 126–132. DOI: 10.22487 / j24428744.2018.v4.i2.11138. [CrossRef] [Google Scholar] 13. E M Eid E, S Alanazi A, Koosha S, A Alrasheedy A, Azam F, M Taban I, Khalilullah H, Sadiq Al-Qubaisi M, A Alshawsh M.Зерумбон индуцирует апоптоз в клетках рака груди, воздействуя на интегрин αvβ3 при совместном введении с пептидом TP5-iRGD. Молекулы. 2019; 24 (14): 2554. DOI: 10,3390 / молекулы24142554. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Naveenkumar HS, Sadikun A, Ibrahim P, Goh JH, Fun HK. Дигидрат (E) -N ’- (2,3,4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразида. Acta Crystallogr Sect E Struct Rep Интернет. 2010; 66 (Pt 11): o3017 – o3018. DOI: 10.1107 / S1600536810043965. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15.Баратан М., Мохамед Р., Вадивелу Дж., Чанг Л.Й., Виньеш Р., Кришнан Дж., Сигамани П., Саиди А., Рам М.Р., Велу В., Ларссон М., Шанкар Е.М. CD8 + Т-клетки пациентов с хронической HCV-инфекцией после стимуляции пептидами HCV экспрессируют несколько отрицательных иммунных контрольных точек. Cell Immunol. 2017; 313: 1–9. DOI: 10.1016 / j.cellimm.2016.12.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Арруэбо М., Вилабоа Н., Саез-Гутьеррес Б., Ламбеа Дж., Трес А., Валладарес М., Гонсалес-Фернандес А. Оценка эволюции методов лечения рака.Раки (Базель) 2011; 3 (3): 3279–3330. DOI: 10.3390 / Cancers3033279. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Маеда Х., Хатами М. Анализ повторных неудач в терапии рака солидных опухолей: плохая доставка лекарств, селективная к опухолям, низкая терапевтическая эффективность и непомерно высокие затраты. Clin Transl Med. 2018; 7 (1): 11. DOI: 10.1186 / s40169-018-0185-6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Хоссейни А., Горбани А. Терапия рака с помощью фитохимических веществ: данные клинических исследований.Авиценна Дж. Фитомед. 2015; 5 (2): 84–97. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19. Атанасов А.Г., Вальтенбергер Б., Пферши-Венциг Е.М., Линдер Т., Ваврош С., Урин П., Теммл В., Ван Л., Швайгер С., Хайсс Э. Х., Роллингер Дж. М., Шустер Д., Брейс Дж. М., Бочков В., Миховилович М. Д., Копп Б., Бауэр Р., Дирш В.М., Ступпнер Х. Открытие и пополнение запасов фармакологически активных натуральных продуктов растительного происхождения: обзор. Biotechnol Adv. 2015; 33 (8): 1582–1614. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2015.08.001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20.Пинто DCGA, Силва AMS. Природные противораковые кумарины как соединения, ведущие к открытию новых лекарств. Curr Top Med Chem. 2017; 17 (29): 3190–3198. DOI: 10,2174 / 1568026618666171215095750. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Шан XF, Моррис-Начке SL, Лю YQ, Guo X, Xu XS, Goto M, Li JC, Yang GZ, Lee KH. Биологически активные хинолиновые и хиназолиновые алкалоиды, часть I. Med Res Rev.2018; 38 (3): 775–828. DOI: 10.1002 / med.21466. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Лев С.К., Малагобадан С., Аршад Н.М., Нагор Нью-Хэмпшир.Обзор взаимосвязи структуры и активности природных и синтетических антиметастатических соединений. Биомолекулы. 2020; 10 (1): 138. DOI: 10.3390 / biom10010138. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Джамалзаде Л., Гафури Х., Агамаали М., Сарири Р. Индукция апоптоза в клетках MCF-7 рака молочной железы человека полусинтетическим производным артемизинина: механизм, связанный с каспазой. Iran J Biotechnol. 2017; 15 (3): 157–165. DOI: 10.15171 / ijb.1567. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24.Факай М.И., Абд Малек С.Н., Карсани С.А. Индукция апоптоза чалепином через экстернализацию фосфатидилсерина и фрагментацию ДНК в клетках рака груди (MCF7) Life Sci. 2019; 220: 186–193. DOI: 10.1016 / j.lfs.2019.01.029. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Pan Z, Zhang X, Yu P, Chen X, Lu P, Li M, Liu X, Li Z, Wei F, Wang K, Zheng Q, Li D. Цинобуфагин вызывает остановку клеточного цикла в фазе G2 / M и способствует апоптозу в клетках злокачественной меланомы. Фасад Онкол. 2019; 9: 853. DOI: 10.3389 / fonc.2019.00853. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Barathan M, Mariappan V, Shankar EM, Abdullah BJ, Goh KL, Vadivelu J. Гиперицин-фотодинамическая терапия приводит к секреции интерлейкина-6 клетками HepG2 и их апоптозу через привлечение агониста смерти взаимодействующего домена Bh4 и каспаз. Cell Death Dis. 2013; 4: e697. DOI: 10.1038 / cddis.2013.219. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Деннис К.Л., Блатнер Н.Р., Гунари Ф., Хазайе К. Текущее состояние интерлейкина-10 и регуляторных Т-клеток при раке.Curr Opin Oncol. 2013. 25 (6): 637–645. DOI: 10.1097 / CCO.0000000000000006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Sun Y, Zhang W, Chen Y, Ma Q, Wei J, Liu Q. Идентификация генов, связанных с лекарственным ответом против рака, с использованием интегративного анализа транскриптомных и геномных вариаций с отклонениями от лекарств на основе клеточных линий. Oncotarget. 2016; 7 (8): 9404–9419. DOI: 10.18632 / oncotarget.7012. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Ван X, Ян Y, An Y, Fang G. Механизм противоракового действия и потенциальное клиническое использование кемпферола при лечении рака груди.Biomed Pharmacother. 2019; 117: 109086. DOI: 10.1016 / j.biopha.2019.109086. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Обзор структуры и их взаимодействия с белками

Углеродные нанотрубки (УНТ) — это аллотропы углерода с наноструктурой, отношение длины к диаметру которой может превышать 1 000 000. Были разработаны методы производства нанотрубок в значительных количествах, включая дуговый разряд, лазерную абляцию и химическое осаждение из газовой фазы. События последних нескольких лет проиллюстрировали потенциально революционное влияние наноматериалов, особенно в области биомедицинской визуализации, доставки лекарств, биочувствительности и дизайна функциональных нанокомпозитов.Методы эффективного взаимодействия белков с наноматериалами для реализации этих приложений продолжают развиваться. Высокое отношение поверхности к объему, обеспечиваемое наночастицами, привело к тому, что концентрация иммобилизованного объекта была значительно выше, чем у других материалов. Также растет интерес к пониманию влияния наноматериалов на структуру и функцию белков. Были разработаны различные методы иммобилизации, и, в частности, особое внимание уделялось специфическому прикреплению ферментов к углеродным нанотрубкам.Поскольку все большее внимание уделяется каскадным ферментативным реакциям, вполне возможно, что коиммобилизация мультиферментов станет одной из следующих целей в будущем. В этой статье мы сосредоточимся на достижениях в методологии иммобилизации ферментов на углеродных нанотрубках.

1. Введение

Алмаз и графит считаются двумя естественными кристаллическими формами чистого углерода. В алмазе происходит гибридизация атомов углерода, при которой четыре связи направлены к углам правильного тетраэдра.Полученная трехмерная сетка (алмаз) чрезвычайно жесткая, что является одной из причин ее твердости. В графите происходит гибридизация, при которой каждый атом равномерно связан с тремя атомами углерода (120 °) в плоскости, а на оси присутствует слабая связь. Комплект образует гексагональную (сотовую) решетку, характерную для листа графита [1]. Новая форма углерода, фуллерен Бакминстера (), была открыта в 1985 году группой, возглавляемой Корто и соавторами [2]. Помимо алмаза, графита и фуллерена (), квазиодномерная нанотрубка является еще одной формой углерода, о которой впервые сообщил Иджима в 1991 году, когда он обнаружил многослойные углеродные нанотрубки (MWCNT) в углеродной саже, полученные методом дугового разряда [3].Углеродные нанотрубки (УНТ) представляют собой аллотропы углерода. УНТ имеют трубчатую форму, изготовлены из графита. Трубки содержали по крайней мере два слоя, часто намного больше, и имели внешний диаметр от примерно 3 нм до 30 нм. Примерно два года спустя он обнаружил однослойные углеродные нанотрубки (ОСУНТ) [4]. Примерно в то же время Dresselhaus et al. синтезировали однослойные углеродные нанотрубки тем же способом получения MWCNT, но с добавлением некоторых частиц переходных металлов к углеродным электродам [5]. Однослойные нанотрубки, как правило, уже, чем многослойные, с диаметром обычно в диапазоне 1-2 нм и имеют тенденцию быть изогнутыми, а не прямыми (рис. 1).За последнее десятилетие был проделан значительный объем работы по выявлению уникальных структурных, электрических, механических, электромеханических и химических свойств УНТ. Недавние исследования были сосредоточены на улучшении качества нанотрубок, полученных каталитическим способом [6, 7].

2. Классификация углеродных нанотрубок

Углеродные нанотрубки подразделяются на следующие два типа: ОСУНТ — одностенные углеродные нанотрубки и МУНТ — многостенные углеродные нанотрубки. Сравнение SWCNT и MWCNT представлено в Таблице 1 [9–11].

SWCNT MWCNT Однослойный графен. Многослойный графен Для синтеза необходим катализатор. Может производиться без катализатора. Массовый синтез затруднен, так как требует надлежащего контроля над ростом и атмосферными условиями. Объемный синтез прост. Не полностью рассредоточены и образуют сгруппированные структуры. Гомогенно диспергированный, без видимого образования пучков. Удельное сопротивление обычно находится в диапазоне 10 −4 –10 −3 Ом · м. Удельное сопротивление обычно находится в диапазоне 1,8 × 10 −5 –6,1 × 10 −5 Ом · м Плохая чистота. Типичное содержание УУНТ в образцах, полученных методом химического осаждения из газовой фазы (CVD), составляет около 30–50 мас.%.Однако сообщалось о высокой чистоте до 80% при использовании метода синтеза дугового разряда. Чистота высокая. Типичное содержание MWCNT в образцах, полученных методом CVD, составляет около 35–90 мас.%. Вероятность дефекта выше при функционализации . Вероятность дефекта меньше, особенно при синтезе методом дугового разряда. Описание и оценка просты. Он имеет очень сложную структуру Он легко скручивается и более гибкий. Его нелегко перекрутить.

3. Структура и морфология

Полностью состоящий из углерода структуру чистого SWCNT можно представить как свернутую трубчатую оболочку из листа графена, состоящего из шестиугольных колец бензольного типа. атомов углерода (рис. 2 (а)). Листы графена представляют собой бесшовные цилиндры, образованные из сотовой решетки, представляющие собой один атомный слой кристаллического графита. MWCNT — это стопка листов графена, свернутых в концентрические цилиндры.Каждая нанотрубка представляет собой отдельную молекулу, состоящую из миллионов атомов, и длина этой молекулы может достигать десятков микрометров при диаметре всего 0,7 нм [11]. ОУНТ обычно содержат всего 10 атомов по окружности, а толщина трубки составляет всего один атом. Нанотрубки обычно имеют большое отношение длины к диаметру (аспектное отношение) около 1000, поэтому их можно рассматривать как почти одномерные структуры [12]. МУНТ больше по размеру и состоят из множества однослойных трубок, уложенных одна внутри другой.Название MWCNT ограничено наноструктурами с внешним диаметром менее 15 нм, выше которых структуры называются углеродными нановолокнами. УНТ отличаются от углеродных волокон, которые представляют собой не отдельные молекулы, а нити листов слоистого графита [13, 14].

Помимо двух различных базовых структур, существует три различных возможных типа углеродных нанотрубок. Эти три типа УНТ представляют собой углеродные нанотрубки кресла, зигзагообразные углеродные нанотрубки и хиральные углеродные нанотрубки.Разница между этими типами углеродных нанотрубок зависит от того, как графит «свертывается» в процессе его создания. Выбор оси качения относительно гексагональной сетки графемного листа и радиуса закрывающего цилиндра позволяет использовать различные типы ОСУНТ.

Хиральный вектор представлен парой индексов, и, где эти два целых числа соответствуют количеству единичных векторов вдоль двух направлений в сотовой кристаллической решетке графемы.Когда нанотрубка называется «зигзаг», когда нанотрубка называется «кресло», а все остальные конфигурации обозначаются как хиральные. На рисунке 2 показаны три различных типа ОСУНТ: кресло, зигзаг и хиральный. Более подробные сведения о структуре можно найти в обзорах [12, 15, 16].

4. Свойства

Прочность углерод-углеродных связей придает углеродным нанотрубкам удивительные механические свойства. Ни один из предыдущих материалов не продемонстрировал сочетания приписываемых им превосходных механических, тепловых и электронных свойств.Их плотность может составлять всего 1,3 г / см ³ (одна шестая от плотности нержавеющей стали). Модули Юнга УНТ (мера жесткости материала) превосходят все углеродные волокна со значениями более 1ТПа, что примерно в 5 раз выше, чем у стали [17]. Однако их сила — это то, что их действительно отличает. Углеродные нанотрубки — самые прочные материалы, когда-либо обнаруженные человечеством. Наивысшая измеренная прочность на разрыв или деформация разрыва для углеродной нанотрубки составляла до 63 ГПа, что примерно в 50 раз выше, чем у стали [17].Даже самые слабые типы углеродных нанотрубок имеют прочность в несколько ГПа [18]. Кроме того, УНТ обладают хорошей химической стабильностью и устойчивостью к воздействию окружающей среды, а также высокой теплопроводностью (~ 3000 Вт / м / К, сравнимо с алмазом). Эти свойства в сочетании с легкостью углеродных нанотрубок дают им большой потенциал в таких приложениях, как аэрокосмическая промышленность.

Электронные свойства углеродных нанотрубок также необычны. Обладает высокой электропроводностью (сравнимо с медью). Особенно примечателен тот факт, что нанотрубки могут быть металлическими или полупроводниковыми.Действие качения нарушает симметрию плоской системы и задает четкое направление относительно гексагональной решетки и осевого направления. В зависимости от соотношения между этим осевым направлением и единичными векторами, описывающими гексагональную решетку, нанотрубки могут вести себя электрически как металл или полупроводник. Полупроводниковые нанотрубки имеют запрещенные зоны, которые масштабируются обратно пропорционально диаметру, в диапазоне от примерно 1,8 эВ для трубок очень малого диаметра до 0,18 эВ для максимально возможных стабильных ОСУНТ [19].Таким образом, некоторые нанотрубки имеют более высокую проводимость, чем медь, а другие ведут себя больше как кремний. Большой интерес вызывает возможность создания электронных устройств нанотрубок. Есть несколько областей техники, в которых углеродные нанотрубки уже используются. К ним относятся плоские дисплеи, сканирующие зондовые микроскопы, сенсорные устройства и топливный элемент.

5. Методы синтеза углеродных нанотрубок

Высококачественные материалы нанотрубок необходимы как для фундаментальных, так и для технологических применений.Под высоким качеством понимается отсутствие структурных и химических дефектов на значительном протяжении (например, 1–10 мкм) вдоль осей трубок. Количество патентов и публикаций по синтезу углеродных нанотрубок быстро растет. Однако остается еще много проблем, которые необходимо решить в отношении синтеза УНТ. В настоящее время существует четыре основных задачи в области синтеза нанотрубок. а) массовое производство, то есть разработка недорогих крупномасштабных процессов синтеза высококачественных нанотрубок, включая ОСУНТ.(б) Селективное производство, то есть контроль над структурой и электронными свойствами полученных нанотрубок. (c) Организация, то есть контроль над расположением и ориентацией полученных нанотрубок на плоской подложке. (d) Механизм, то есть развитие глубокого понимания процессов роста нанотрубок. Механизм роста до сих пор является предметом споров, и во время формирования УНТ может действовать более одного механизма.

Было разработано множество методов для производства УНТ и МУНТ с различной структурой и морфологией в лабораторных количествах.Обычно для синтеза УНТ используются три метода: дуговый разряд [20, 21], лазерная абляция [22] и химическое осаждение из газовой фазы (CVD) [23–26]. Основными элементами для образования нанотрубок являются катализатор, источник углерода и достаточная энергия. Общей чертой этих методов является добавление энергии к источнику углерода для получения фрагментов (групп или отдельных атомов углерода), которые могут рекомбинировать с образованием УНТ. Источником энергии может быть электричество от дугового разряда, тепло от печи (~ 900 ° C) для CVD или высокоинтенсивный свет от лазера (лазерная абляция).

6. Дуговый разряд и лазерное испарение

Дуговый разряд и лазерная абляция были первыми методами, которые позволили синтезировать ОУНТ в относительно больших (граммах) количествах. Оба метода включают конденсацию горячих газообразных атомов углерода, образующихся при испарении твердого углерода [27]. Для выращивания одностенных трубок в системе дугового разряда необходим металлический катализатор [28]. Рост высококачественных ОУНТ в масштабе 1–10 г производился также методом лазерной абляции (лазерная печь) [22].Помимо метода лазерной печи, имеются сообщения об использовании типичной промышленной лазерной системы непрерывного действия для производства ОСУНТ [29]. Тем не менее, требования к оборудованию и большое количество энергии, потребляемой этими методами, делают их менее подходящими для производства нанотрубок. С помощью дугового и лазерного методов можно получить только порошковые образцы с нанотрубками, запутанными в жгуты. Общей чертой дугового разряда и методов лазерной абляции является потребность в большом количестве энергии, чтобы вызвать реорганизацию атомов углерода в УНТ.Используемая температура даже выше 3000 ° C, что способствует хорошей кристаллизации УНТ, поэтому продукты всегда производятся с хорошим выравниванием графита. Однако основные требования к этим системам, включая условия вакуума и непрерывную замену графитовой мишени, создают трудности для крупномасштабного производства УНТ.

7. Химическое осаждение из паровой фазы (CVD)

Метод CVD включает разложение газообразного или летучего соединения углерода, катализируемое металлическими наночастицами, которые также служат центрами зародышеобразования для инициирования роста углеродных нанотрубок.В отличие от двух предыдущих методов, CVD оказался предпочтительным путем для крупномасштабного производства углеродных нанотрубок [27, 30]. Здесь углерод осаждается из углеводорода (или другого источника углерода) в присутствии катализатора при температурах ниже 1200 ° C. Структуру УНТ, такую ​​как количество ее стенок, диаметр, длину и ориентацию, можно хорошо контролировать во время процесса CVD. Таким образом, метод CVD имеет преимущества мягкого действия, низкой стоимости и контролируемого процесса.За последние двенадцать лет было разработано несколько методов, которые могут использоваться для получения нанотрубок в промышленных масштабах. Все они основаны на методах сердечно-сосудистых заболеваний. Среди этих методов пять различных подходов оказались наиболее многообещающими: (i) Метановое химическое осаждение из паровой фазы. Впервые о нем было сообщено в 1998 году, когда основное количество ОУНТ было синтезировано методом химического осаждения из метана при 900 ° C [23, 31]. Su et al. [26] значительно повысили выход этого метода с использованием в качестве катализатора аэрогелей, пропитанных наночастицами Fe / Mo.(ii) HiPCO, что означает каталитическое разложение монооксида углерода под высоким давлением, использует CO высокого давления в качестве источника углерода для получения ОСУНТ [32]. Катализаторы, используемые в процессе HiPCO, находятся в газовой фазе, полученной из летучего металлоорганического предшественника катализатора. (Iii) CO CVD использует CO в качестве исходного газа. По сравнению с образцами, изготовленными с использованием того же катализатора и метана, количество аморфного углерода может быть уменьшено. Важным достижением метода CO CVD является разработка Co-Mo катализатора [33].В этом процессе использовались биметаллические катализаторы Co-Mo и реактор CVD с псевдоожиженным слоем для производства большого количества ОУНТ. Наиболее важным преимуществом реакторов с псевдоожиженным слоем является то, что они позволяют непрерывно добавлять и удалять твердые частицы из реактора без остановки работы. (Iv) Спирт CVD, о котором сообщили в 2002 году Maruyama et al. [34], которые производят ОУНТ высокой чистоты без какого-либо покрытия из аморфного углерода с использованием спиртов, таких как метанол и этанол, в качестве источника углерода. Было высказано предположение, что радикал ОН, образующийся при высокой температуре из спиртов, может эффективно удалять аморфный углерод во время роста нанотрубок, оставляя в качестве продукта только чистые ОСУНТ.(v) Способы CVD с плазменным усилением (PECVD) в последнее время также широко используются для изготовления углеродных материалов, включая MWCNT и SWCNT [35–39]. Реактивные частицы в плазменной системе могут влиять на рост трубок очень малого диаметра, что влияет как на контроль диаметра, так и на избирательное травление металлических ОСУНТ. В таблице 2 дается краткое изложение трех наиболее распространенных используемых методов [40].

Метод Дуговый разряд Лазерная абляция Химическое осаждение из паровой фазы Подключите два блока питания на расстоянии нескольких миллиметров.При токе 100 ампер углерод испаряется и образует горячую плазму. Взрыв графита интенсивными лазерными импульсами; использовать лазерные импульсы, а не электричество, для генерации углеродного газа, из которого формируются УНТ; пробуйте различные условия, пока не достигнете той, которая производит огромное количество SWNT. Поместите субстрат в печь, нагрейте до высокой температуры и медленно добавьте углеродсодержащий газ, такой как метан. Когда газ разлагается, он высвобождает атомы углерода, которые рекомбинируют в форме NT. Состояние Инертный газ низкого давления (гелий). Аргон или газообразный азот при 500 торр. Высокие температуры от 500 до 1000 ° C при атмосферном давлении. Типичный выход 30–90% До 70% 20–100% SWCNT Короткие трубки диаметром 0,6–1,4 нм. Длинные пучки трубок (5–20 мкм) с индивидуальным диаметром от 1-2 нм. Длинные трубки диаметром от 0,6 до 4 нм. MWCNT Короткие трубки с внутренним диаметром 1–3 нм и внешним диаметром примерно 10 нм Этот метод не очень интересен, так как он слишком дорог, но синтез MWNT возможен. Длинные трубы диаметром от 10 до 240 нм Источник углерода Чистый графит Графит Углеводород на основе ископаемых и растительный углеводород. Стоимость Высокая Высокая Низкая Преимущество Можно легко производить SWNT, MWNT. ОСНТ имеют несколько структурных дефекта; MWNT без катализатора, не слишком дорогие, возможен синтез на открытом воздухе. Хорошее качество, более высокий выход и более узкое распределение SWNT, чем при дуговом разряде. Самый простой способ масштабирования до промышленного производства; большая длина, простой процесс, контролируемый диаметр SWNT и довольно чистый. Недостаток Трубки обычно короткие, имеют случайные размеры и направления; часто требуется большая очистка. Дорогостоящий метод, поскольку для него требуются дорогие лазеры и высокая мощность, но он постоянно совершенствуется. Часто с дефектами.

8. Катализатор

Катализаторы играют решающую роль в синтезе УНТ методом химического осаждения из паровой фазы, и поэтому улучшение желаемых характеристик катализатора повысит качество получаемых УНТ, а также выход процесса. Углеродные наноструктуры обычно синтезируются с использованием наночастиц переходных металлов в качестве катализаторов [22]. Было обнаружено, что структура УНТ определяется размером и химическим составом металлических катализаторов.Однако в настоящее время диаметр, длина и хиральность УНТ недостаточно контролируются в одном процессе из-за неполного понимания роли катализатора в зарождении и росте нанотрубок [41]. Считается, что рост УНТ с помощью химического осаждения из паровой фазы включает поверхностную и / или объемную диффузию углерода на частице металлического катализатора. Взаимодействия УНТ-УНТ или УНТ-субстрат в дополнение к расположению и активности каталитических сайтов определяют, растут ли УНТ в изолированной, запутанной или выровненной конфигурации.На всех стадиях роста УНТ химические и механические взаимодействия сильно взаимосвязаны, и эти взаимодействия должны быть дополнительно изучены для эффективного синтеза УНТ [42].

Переходные металлы в виде наночастиц считаются наиболее эффективными катализаторами. Своеобразная способность переходных металлов стимулировать рост УНТ в значительной степени связана со следующими факторами: (а) каталитической активностью по разложению летучих углеродных соединений, (б) способностью к образованию метастабильных карбидов и (в) диффузией углерода через металлический слой и над ним. частицы [43–45].Каталитический процесс CVD для роста УНТ использует гетерогенные катализаторы, которые представляют собой каталитически активные частицы металла, обычно диаметром 1–10 нм, закрепленные на большой инертной поверхности. Переходные металлы, используемые до сих пор в качестве катализаторов, включают Fe, Ni, Co и Mo. Однако более поздние исследования показали, что другие металлы, такие как In, Cu, Ag, Pd, Mn, Mo, Cr, Al и Au, также могут использоваться для формирования ОСУНТ [46, 47]. Поскольку для зародышеобразования ОСУНТ требуется частица катализатора, большое внимание уделяется роли катализаторов в формировании эмбриональной стадии ОСУНТ.Однако их роль еще предстоит определить, и это отчасти связано с противоречивыми результатами, которые могут указывать на существование нескольких механизмов.

Для получения УНТ катализатор должен быть приготовлен в виде наночастиц катализатора [48]. Поглощение углерода частицами катализатора и скорость осаждения УНТ из частиц катализатора сильно зависят от размера частиц катализатора. При заданном CVD существует оптимальный диаметр частиц для зародышеобразования ОУНТ с фиксированной скоростью подачи углерода.Более мелкие наночастицы катализатора легко отравляются из-за избыточной подачи, а более крупные частицы катализатора неактивны из-за недостаточной подачи [49].

До сих пор опубликованные результаты, касающиеся катализаторов, в основном касались синтеза монодисперсных УНТ, но было проведено очень мало подробных экспериментальных исследований путей реакции. Кроме того, необходимо дополнительно изучить и охарактеризовать взаимодействие между катализаторами и поверхностью субстратов. В будущем усилия будут направлены на поиск оптимальных условий CVD, чтобы раскрыть подробный механизм катализа и облегчить контроль над ростом УНТ для будущего изготовления устройств на основе нанотрубок.

8.1. Источники углерода

Одним из основных препятствий на пути промышленного применения УНТ является стоимость их углеродистых предшественников. С момента его первого открытия Иидзимой в 1991 году для производства УНТ использовались различные источники углерода. различное использование источника углерода. Дуговый разряд был первым методом, использованным для производства углеродных нанотрубок. УНТ, полученные этим методом, выращивались на отрицательном конце графитового электрода в инертной атмосфере гелия или аргона с очень высокой температурой, необходимой для испарения чистого графита или совместного испарения графита и металла [50–53].Как и в методе дугового разряда, в методе лазерной абляции используется графит. Графит испаряется лазерным излучением в инертной атмосфере в присутствии металлического катализатора для получения углеродных нанотрубок [22, 51, 54, 55].

Существует два основных источника углерода для синтеза УНТ с использованием метода CVD: углеводород на основе ископаемых и углеводород на основе растений. Углеводород давно и широко использовался в качестве обычного источника углерода в области исследования УНТ. Для многих исследователей природный газ становится наиболее предпочтительным источником углерода.Каталитическое разложение метана частицами катализатора переходных металлов является доминирующим процессом в росте углеродных нанотрубок, поскольку он устойчив к саморазложению при высоких температурах. Помимо метана, несколько других углеродных частиц, таких как ацетилен, бензол, ксилол, толуол и т. Д., Использовались в качестве углеродного сырья для синтеза УНТ [56–60]. Эти прекурсоры углерода связаны с ископаемым топливом, и ввиду недостаточного количества доступных в ближайшем будущем и их воздействия на окружающую среду необходимо рассмотреть возможность разработки углеродсодержащих материалов из природных ресурсов.Сейчас усилия направлены на использование ненефтяных продуктов. Синтезы УНТ из природных прекурсоров редки, однако за последние несколько лет природные возобновляемые ресурсы стали более привлекательными из-за их экологических преимуществ и более низкой стоимости [61]. Одним из таких значительных усилий является использование неразлагаемых полимеров для синтеза УНТ [62]. Имеются сообщения об использовании природных предшественников, таких как камфора (), скипидарное масло (), эвкалиптовое масло (), касторовое масло (), кокосовое масло () и пальмовое масло () для синтеза УНТ [63–70 ].Опубликованные данные показывают, что некоторые исследователи использовали отходы кулинарного пальмового масла в качестве предшественника биоуглерода в своих исследованиях [71]. Отработанное кулинарное масло, которое намного дешевле, чем натуральное растительное масло, является многообещающей альтернативой растительному маслу для производства УНТ. Суриани и его коллеги [71] сообщили об использовании отработанного пальмового масла при кулинарии для синтеза вертикально ориентированных углеродных нанотрубок (VACNT). Результат показал, что сложный состав отработанного масла (выщелачивание жиров и других углеводородов из обжаренных объектов) не влияет на процесс синтеза.

9. Очистка и диспергирование углеродных нанотрубок

УНТ, синтезированные указанными выше способами, неизбежно содержат углеродистые примеси и частицы металлического катализатора, и количество примесей обычно увеличивается с уменьшением диаметра УНТ. Фундаментальные проблемы, которые все еще существуют, заключаются в том, как (1) удалить примеси, такие как аморфный углерод и металлические катализаторы, и (2) получить однородные дисперсии углеродных нанотрубок в диспергирующих средах или растворах полимеров.Примеси в неочищенных углеродных нанотрубках сильно ухудшают механические или электрические свойства. Сажа, полученная от УНТ, содержит много примесей. До сих пор все известные в настоящее время методы производства генерируют УНТ с примесями. С момента открытия углеродных нанотрубок очистка является важным направлением в области синтеза. Как правило, основными примесями в саже являются листы графита (завернутые), аморфный углерод, металлический катализатор и более мелкие фуллерены. Кроме того, структурные дефекты, такие как оборванные связи, часто встречаются в большинстве типов УНТ.Эти примеси будут влиять на большинство желаемых свойств УНТ. Трудности очистки значительны, поскольку УНТ нерастворимы и, следовательно, жидкостная хроматография ограничена. Таким образом, обширные исследования были посвящены очистке углеродных нанотрубок с целью удаления посторонних наночастиц, которые изменяют физико-химические свойства углеродных нанотрубок. Здесь мы просто хотим дать краткий обзор принципов с несколькими примерами. Хорошие обзорные статьи по очистке нанотрубок доступны в недавней литературе [72, 73].Поэтому много усилий было потрачено на разработку методов очистки; итоговые подходы приведены в таблице 3. В этих методах используется либо одна, либо комбинация нескольких элементарных техник.

Процесс Описание Ссылки Окисление в газовой фазе (i) Как правило, химическое окисление включает окисление в газовой фазе (с использованием воздуха, O 2 , Cl 2 , H 2 O, и т.п.), жидкофазного окисления (кислотная обработка и кипячение с обратным холодильником и т. д.) и электрохимического окисления. (ii) Пробирки нагревают с контролируемой скоростью либо во влажном воздухе, либо в вакууме, либо в других окислителях в течение продолжительного времени примерно до 330 ° C. (ii) Это хороший способ удаления углеродистых примесей. (iii) Недостатки этого метода заключаются в том, что он часто открывает конец УНТ, разрезает УНТ, повреждает структуру поверхности и вводит оксигенированные функциональные группы (–OH, –C = O и –COOH) на УНТ. Частицы металла нельзя удалить напрямую, и необходима дополнительная кислотная обработка. [134–145] Окисление в жидкой фазе (кислотная обработка) (i) Обычно кислотная обработка удаляет металлический катализатор и некоторые фуллерены. (ii) Кипячение с обратным холодильником в HNO 3 , HCl или другой кислоте в течение периода времени от 4 до 48 часов. (iii) HNO 3 — единственная кислота, которая не вызывает разложения в пробирках (если она не оставлена ​​в HNO 3 в течение длительного периода времени, обычно> 16 часов). (iv) Металлический катализатор сольватируется, в то время как УНТ остаются в суспендированной форме. [135, 140, 144–147] Электрохимическое окисление (i) УНТ с меньшим количеством дефектов демонстрируют более высокую электрохимическую стойкость к окислению, чем УНТ с большим количеством дефектов. Подходит для очистки массивов УНТ без нарушения их выравнивания. (ii) Электрод из УНТ погружают в 0,2 М раствор HNO 3 или 0,2 М HCl (продувка N 2 в течение 20 мин перед использованием), и значение потенциала менялось в пределах +1.00 и +2,00 В при скорости сканирования 50 мВ с −1 . (iii) Увеличивает удельную площадь нанотрубок за счет обрезания концов нанотрубок и преобразования поверхностных свойств нанотрубок из гидрофобного состояния в гидрофильное. [148, 149] Центрифугирование (i) Центрифугирование при 7000 g или более в течение от 30 минут до 3 часов. Часто супернатант удаляют после одного цикла и снова центрифугируют. (ii) При этом удаляются наносферы, металлические наночастицы, другие углеродные частицы, но некоторые методы дают низкий выход нанотрубок, особенно когда центрифугирование повторяется много раз. [150–152] Фильтрация (i) Этот метод часто используется в сочетании с окислением. Продукты кислотного разложения хорошо растворимы в основном растворе, а УНТ нет, и их отделяют с помощью щелочного раствора с pH 11 и фильтруют с использованием фильтра 3–5 мкм мкм, часто в вакууме. (ii) При этом удаляются наносферы, металлические наночастицы, многоатомные атомы углерода и фуллерены без каких-либо отмеченных отрицательных эффектов. [153] Обработка ультразвуком (i) УНТ суспендируют в дистиллированной воде, толуоле или растворе кислоты и обрабатывают ультразвуком в течение 5–30 минут. (ii) Он отделяет пробирки от прикрепленных частиц, создавая дисперсию нанотрубок и других частиц для лучшего центрифугирования. (iii) Разделение частиц сильно зависит от используемого поверхностно-активного вещества, растворителя и реагента. Растворитель влияет на стабильность диспергированных трубок в системе. [143, 145, 150, 154–156] Магнитные (i) УНТ суспендированы в мыле или толулене и порошке наночастиц (ZrO 2 , NHCl 4 , CaCo 3 , ромб) добавлен. Эти частицы будут прикрепляться к УНТ и делать их магнитными. (ii) Суспензию обрабатывают ультразвуком в течение 2 часов, а затем магнитные частицы улавливают с помощью постоянных магнитных полюсов. (iii) Затем следует химическая обработка. (iv) Удаляет каталитические материалы и мелкие неорганические частицы. Мало или совсем нет известных отрицательных эффектов. [157–159] Микроволновая очистка (i) УНТ обрабатывают ультразвуком, затем разбавляют в HNO 3 (или другой кислоте). (ii) Обработка в микроволновой печи при мощности 100–200 Вт и повышение температуры в микроволновой печи до ~ 200 ° C в течение 30 минут. (iii) Затем микроволновую печь выдерживают при температуре 200 ° C в течение 30–90 минут. Это удаляет аморфный углерод, металлы и другие наночастицы без каких-либо известных отрицательных эффектов. [160–162]

Получение чистых монодисперсных ОУНТ определенной структуры в больших количествах является проблемой. ОУНТ обладают привлекательными электронными свойствами, поскольку в зависимости от хиральных индексов они становятся металлическими или полупроводниковыми (). Однако их сильная тенденция к образованию пучков (или веревок) из-за сильных ван-дер-ваальсовых взаимодействий препятствует их использованию в качестве окончательного наноматериала. Успешное диспергирование ОСНТ может привести к селективному по диаметру и / или хиральности разделению отдельных ОСНТ.Дезагрегация и однородное диспергирование являются критическими проблемами, которые необходимо решить, поскольку углеродные нанотрубки имеют тенденцию самоассоцировать в микромасштабные агрегаты. Следовательно, необходимо преодолеть термодинамическое стремление к агрегации. Существует два различных подхода к диспергированию углеродных нанотрубок: механический метод и методы, которые предназначены для изменения поверхностной энергии твердых тел физически (нековалентная обработка) или химически (ковалентная обработка) [74, 75]. В химических методах используется функционализация поверхности УНТ для улучшения их химической совместимости с целевой средой (растворитель или раствор / расплав полимера), то есть для улучшения характеристик смачивания или адгезии и уменьшения их склонности к агломерации.Однако агрессивная химическая функционализация, такая как использование чистых кислот при высоких температурах, может привести к структурным дефектам, приводящим к ухудшению свойств трубок. Нековалентная обработка особенно привлекательна из-за возможности адсорбции различных групп на поверхности УНТ без нарушения системы графеновых листов. Нековалентная обработка поверхности поверхностно-активными веществами или полимерами широко используется при приготовлении как водных, так и органических растворов для получения высокой массовой доли индивидуально диспергированных нанотрубок.Сообщалось о многих дисперсионных реагентах, среди которых можно назвать несколько поверхностно-активных веществ [76, 77], полициклических ароматических углеводородов [78], ДНК [79] и пептидов [80].

10. Взаимодействие биомолекул и наночастиц

10.1. Модификация углеродных нанотрубок

Химическая инертность УНТ снижает их технологичность, что препятствует полной реализации их потенциала. Было показано, что химическая функционализация УНТ придает растворимость в различных растворителях, модифицирует их электронные свойства и вызывает значительное расщепление связок.Проблемы растворимости УНТ из-за образования пучков делают их трудно растворимыми в обычных растворителях. Растворимость углеродных нанотрубок в воде ограничена, и требуется надлежащее количество стабилизаторов, чтобы избежать флокуляции и разделения фаз. Одним из недостатков УНТ в отношении их использования в биохимии и биомедицине является то, что они очень гидрофобны и обычно образуют нерастворимые агрегаты. Из-за меньшей растворимости УНТ в любом из растворителей также очень трудно изолировать одну углеродную нанотрубку от другой.Как и графит, УНТ относительно инертны, за исключением крышек нанотрубок, которые обладают большей реакционной способностью из-за наличия оборванных связей. На реакционную способность боковых стенок системы углеродных нанотрубок может влиять кривизна или хиральность трубки. Гидрофобные поверхности углеродных нанотрубок адсорбируют широкий класс веществ за счет — и / или ван-дер-ваальсовых взаимодействий [81–83]. Следовательно, надлежащая стабилизация дисперсии УНТ является необходимым условием для технологических приложений.

Loung et al.[84] сообщили, что когда УНТ обрабатывались ультразвуком в органических растворителях, они производили оборванные связи, которые будут подвергаться дальнейшим химическим реакциям. Многие усилия, предпринятые в последние годы, привели к разработке универсальных методологий химической модификации для решения проблемы нерастворимости. Недавнее расширение методов химической модификации и функционализации углеродных нанотрубок сделало возможным солюбилизировать и диспергировать углеродные нанотрубки в воде, тем самым открывая путь для легкого манипулирования и обработки в физиологической среде.Функционализация поверхности УНТ путем химического присоединения органических функциональных групп поможет материалам углеродных нанотрубок стать биосовместимыми, улучшая их растворимость в физиологических растворах и селективное связывание с биомишенями. Для функционализации УНТ обычно используются два основных пути: присоединение органических фрагментов к карбоксильным группам, которые образуются в результате окисления УНТ сильными кислотами, или прямое связывание с поверхностными двойными связями [85]. Важные ранние отчеты Георгакиласа и др.(2002) показали метод функционализации УНТ с использованием органических соединений. Приблизительно одна органическая группа на 100 атомов углерода нанотрубки вводится для получения хорошо растворимых пучков нанотрубок [86]. Солюбилизация нанотрубок создает новый интересный класс материалов, который сочетает в себе свойства нанотрубок и органической составляющей, что открывает новые возможности для применения в материаловедении, включая получение нанокомпозитов. Фторирование, добавление карбенов и нитренов, электрофилов или пероксирадикалов оказались успешными реакциями для ковалентной функционализации боковых стенок УНТ [85, 86].

В последние годы усилия были направлены на изучение потенциальных биологических применений УНТ, мотивированных их интересным размером, формой и структурой, а также привлекательными оптическими и электрическими свойствами. Во-первых, когда все атомы находятся на поверхности, ОСНТ имеют сверхвысокую площадь поверхности (теоретически 1300 м ² / г), что позволяет эффективно загружать множество молекул по длине боковой стенки нанотрубки. Во-вторых, супрамолекулярное связывание ароматических молекул может быть легко достигнуто путем укладки этих молекул на полиароматическую поверхность нанотрубок [87, 88].Было продемонстрировано, что биологические и биоактивные вещества, такие как белки, углеводы и нуклеиновые кислоты, могут быть конъюгированы с углеродными нанотрубками [89–91]. И нековалентные, и ковалентные стратегии были исследованы для создания интерфейса между биологическими молекулами и УНТ с целью сохранения функциональных свойств биомолекул. Об иммобилизации биомолекул на боковой стенке УНТ и, что более интересно, внутри УНТ сообщалось как в вычислительной, так и в экспериментальной областях [92–97].Основываясь на этих захватывающих наблюдениях и потенциальных приложениях, конформационные изменения биомолекул в этих замкнутых средах имеют тенденцию иметь большое значение, главным образом потому, что эти конформационные изменения, затронутые взаимодействиями биомолекул и УНТ, могут напрямую влиять на их биологические функции. Однако атомные детали взаимодействий на молекулярном уровне и динамические механизмы систем биомолекулы-УНТ все еще остаются сложными из-за сложности биомакромолекул.Взаимодействие между наноструктурированными материалами и живыми системами представляет фундаментальный и практический интерес и будет определять биосовместимость, потенциальную полезность и применение новых наноматериалов в биотехнологических процессах. Однако исследования гибридных архитектур УНТ-органические наночастицы развиты сравнительно слабо. Например, недостаточно исследований о влиянии свойств наноматериалов (таких как состав, морфология и химия поверхности) на структуру и функцию конъюгированных белков.Наиболее важным параметром во всех таких исследованиях является тип используемых углеродных нанотрубок, который определяется (i) процессом приготовления и производства; (ii) структурные характеристики УНТ; (iii) характеристики поверхности УНТ и характеристики функциональных групп на поверхности УНТ. Взаимодействия с клетками должны осуществляться с использованием биосовместимых УНТ, что достигается либо ковалентной, либо нековалентной функционализацией поверхности для получения водорастворимых УНТ [98].

10.2. Иммобилизация белков и ферментов

Практическое использование ферментов было реализовано в различных промышленных процессах и расширяется в новых областях, таких как тонкий химический синтез, фармацевтика, биосенсоры и клетки биотоплива [99]. Чтобы улучшить стабильность ферментов, ферменты обычно изучали с ферментами, иммобилизованными на твердой подложке [100]. Наноматериалы могут служить отличными вспомогательными материалами для иммобилизации ферментов, поскольку они предлагают идеальные характеристики для уравновешивания ключевых факторов, определяющих эффективность биокатализаторов, включая площадь поверхности, минимальное сопротивление массопереносу и эффективную загрузку ферментов [100–102].Углеродные нанотрубки привлекают большое внимание как альтернативные матрицы для иммобилизации ферментов. УНТ являются лучшим поддерживающим материалом для иммобилизации ферментов по сравнению с обычными подложками, такими как диоксид циркония, диоксид кремния и эпоксидная смола. Они более стабильны в суровых условиях, обеспечивают более высокую загрузку фермента и повышенную каталитическую активность фермента до 2 раз выше, чем плоская подложка, и до 10 раз выше, чем у нативного фермента [103]. УНТ, помимо выдающихся механических, электрических и термических свойств, также обеспечивают большую площадь поверхности для более высокой нагрузки ферментами, уменьшают диффузионные ограничения и биосовместимое микроокружение, которое помогает ферментам сохранять свои каталитические свойства [104, 105].Помимо белков, на УНТ могут быть иммобилизованы другие биологические молекулы, такие как нуклеиновые кислоты, антигены, пептиды и лекарства. Тип биомолекул, иммобилизованных на УНТ, приводит к различным применениям, что придает этим конъюгатам биомолекул большую универсальность. В таблице 4 показано применение некоторых выбранных конъюгатов белок-УНТ в различных областях.

GCE Cerrena 9025T 904 904 Glux 904 904 G 904 902 904 оксид этанола модифицированный диоксидом кремния GCE 904 25C модифицированный хитозаном и ионной жидкостью GCE Белок Наноматериалы из углеродных нанотрубок Приложение Ссылка β -глюкозидаза MWCNT-COOH Биокатализ MWCNT-COOH Кандидоз MWCNT-COOH Кандидоз MWCNT-COOH 9028 904 904 904 904 904 904 904 904 904 904 904 904 904 904 902 904 904 904 904 904 904 904 904 904 904 902 -COOH Биокатализ [164] Пероксидаза хрена Стеклоуглеродный электрод, модифицированный SWCNT / хитозаном (GCE) Биоэлектрохимический сенсор [165] C, модифицированный MAC Биотопливные элементы [166] Пероксидаза хрена, миоглобин, цитохром c SWNT / модифицированный ионной жидкостью GCE Биотопливные клетки, биосенсоры [167acicol25 Алмазный электрод, легированный бором, модифицированный УНТ 90 425 Биотопливные элементы, биосенсоры [168] Алкогольдегидрогеназа SWCNT / поли (диметилдиаллиламмонийхлорид) (PDDA) модифицированный GCE Этаноловый биосенсор Биосенсор глюкозы [170] Глюкозооксидаза, пероксидаза хрена MWCNT-толуидиновый синий / модифицированный нафион GCE Биосенсор глюкозы c 9042 176 4 904 25C H 2 O 2 детектор [172] Пероксидаза хрена MWCNT / хитозан / золь-гель модифицированный детектор GCE H 2 O [173] Цитохром c MWCNT / поли (амидоамин) / модифицированный хитозаном GCE Нитритные биосы Ensor [174] Trametes versicolor Гемоглобин MWCNT / хитозан Биосенсор кислорода, биотопливные элементы [175] Подходы к иммобилизации Иммобилизация ферментов занимает центральное место в биореакторных и биосенсорных технологиях. Иммобилизованная молекула — это молекула, движение которой в пространстве ограничено либо полностью, либо небольшой ограниченной областью путем присоединения к твердой структуре. Дорогие ферменты не рекомендуется использовать в промышленности в свободном состоянии, поскольку их трудно отделить от продуктов и, следовательно, они теряются после первого использования. В качестве альтернативы ферменты можно иммобилизовать на твердых носителях, чтобы их можно было легко отделить от продуктов простой фильтрацией.Основным преимуществом иммобилизации ферментов является легкое отделение фермента от реакционной смеси (субстратов и продуктов) и возможность его повторного использования в течение десятков раз, что значительно снижает стоимость фермента и ферментативных продуктов. Помимо этого великолепного преимущества, процесс иммобилизации наделяет фермент многими другими преимуществами, такими как (а) способность быстро останавливать реакцию путем удаления фермента из реакционного раствора (или наоборот), (б) продукт не загрязнен фермент, и (c) повышение устойчивости фермента к pH, температуре, растворителям, загрязняющим веществам и примесям.Существует пять основных методов иммобилизации ферментов и клеток (адсорбция, ковалентность, захват, инкапсуляция и сшивание), и ни один метод не подходит для всех молекул или целей. Сообщалось, что небольшие белки, такие как металлотионеин, цитохром С и -лактамаза, были способны адсорбироваться как на внутренней, так и на внешней стенках УНТ после того, как концы были открыты обработкой концентрированной азотной кислотой [106, 107]. С тех пор было продемонстрировано, что как многослойные (MWCNT), так и однослойные УНТ (SWCNT) обладают способностью адсорбировать многие типы белков.Адсорбированные белки образуют покрытие на поверхности УНТ при визуализации с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) или электронной микроскопии. Чтобы полностью изучить потенциал комплекса фермент-УНТ, важно найти оптимальные методы иммобилизации фермента. Для иммобилизации ферментов SWNT привлекательны своей более высокой площадью поверхности для взаимодействия с ферментами, но MWNT желательны из-за их более легкой диспергируемости и более низкой стоимости. Белки могут взаимодействовать с нанотрубками с множеством типов взаимодействий. Сообщалось о нековалентных (физиоабсорбция) и ковалентных (образование химических связей) конъюгациях для иммобилизации различных ферментов [108].Нековалентное присоединение сохраняет уникальные свойства как ферментов, так и УНТ, но иммобилизованный белок может постепенно теряться во время использования комплекса УНТ-фермент [108]. Ковалентная конъюгация обеспечивает прочное прикрепление, но структура фермента может быть нарушена в большей степени. Функционализация УНТ органическими, полимерными и биологическими молекулами может обеспечить получение биосовместимых композитов из нанотрубок со специфическими группами на их поверхности. Независимо от того, какой метод используется, основная проблема заключается в обеспечении стабильного прикрепления ферментов при сохранении их активности и функций, максимально приближенных к их естественному состоянию [109].На производительность комплексов УНТ-фермент влияет сочетание химического состава нанотрубок и метода иммобилизации. 11.1. Нековалентная иммобилизация Нековалентный подход считается более многообещающим методом, поскольку в нем меньше искажений конформационной структуры иммобилизованных ферментов [110, 111]. В большинстве случаев взаимодействие между белком и УНТ включает физическую адсорбцию белка на УНТ. Адсорбция белка на УНТ включает как гидрофобное, так и электростатическое взаимодействие [96, 112, 113].Чистые УНТ, будучи высокогидрофобными, будут способствовать гидрофобному взаимодействию за счет взаимодействия боковых цепей гидрофобных аминокислот белков с боковой стенкой УНТ. Что касается электростатического взаимодействия, электроны на поверхности УНТ будут взаимодействовать с электронами ароматического кольца аминокислот (например, фенилаланина и триптофана). Помимо электростатического и гидрофобного взаимодействия, водородные связи и неспецифическая адсорбция также могут играть роль в адсорбции ферментов на УНТ [110].Адсорбция обычно включает в себя погружение УНТ в раствор фермента и встряхивание образца, чтобы дать время для физической адсорбции на поверхности, а затем смыть фермент, который не адсорбируется. Этот метод может осуществляться путем прямой физической адсорбции на УНТ (прямая физическая адсорбция) или адсорбции с помощью таких веществ, как полимеры, поверхностно-активные вещества и связывающие молекулы (специфическая адсорбция). Поскольку УНТ обладают естественным сродством к различным белкам, адсорбция происходит самопроизвольно, когда белки контактируют с УНТ в растворе, и следует за поведением псевдонасыщения. Гидрофобная наноразмерная среда УНТ может влиять на структуру и функцию белков или ферментов. Используя такие методы, как FT-IR и AFM, было обнаружено, что конформация адсорбированного белка искажается или частично разворачивается из-за сильного взаимодействия с УНТ [96]. Исследования показали, что ферменты претерпевают структурные изменения при адсорбции, а некоторые ферменты имеют значительную потерю содержания альфа-спирали. Природа фермента или белка влияет на степень его денатурации при адсорбции.Моделирование молекулярной динамики показало, что в органическом растворителе гептане водородные связи в активном центре липазы могут быть лучше сохранены, если фермент иммобилизован на поверхности УНТ [114]. Даже если происходит денатурация ферментов или белков, УНТ могут стабилизировать ферменты при повышенных температурах и в органических растворителях в большей степени, чем обычные плоские носители [112, 113]. Было высказано предположение, что сильно изогнутые поверхности УНТ неблагоприятны для денатурации ферментов в суровых условиях и подавляют латеральные взаимодействия между соседними адсорбированными ферментами.Повышенная кривизна УНТ, вероятно, может способствовать уменьшению вредных взаимодействий между иммобилизованными белковыми молекулами, что, в свою очередь, приводит к увеличению стабильности ферментов на УНТ по сравнению с устойчивостью на плоских поверхностях. Для метода прямой физической адсорбции сила взаимодействия между белком или ферментом и УНТ является преимущественно гидрофобным взаимодействием [108]. На количество ферментов, адсорбированных на УНТ, влияют различные факторы, такие как природа фермента, химический состав поверхности УНТ и рабочие параметры.В таблице 5 показаны примеры белков или ферментов, которые были иммобилизованы путем прямой физической адсорбции, и типы задействованных сил взаимодействия. Иммобилизованный белок или фермент Типы взаимодействия Ссылки Комплекс лизоцим-CNT (i) Гидрофобные области на внешней стороне белка взаимодействуют со стенкой CNT посредством гидрофобных взаимодействий. (ii) π — π стэкинг-взаимодействие между боковыми стенками УНТ и ароматическими кольцами (оба эти гидрофобные и π — π взаимодействия широко использовались для объяснения движущей силы прямой адсорбции многих ферментов на УНТ). (iii) Электростатическое взаимодействие. Помимо гидрофобных и π — π взаимодействий, лизоцим взаимодействует с нанотрубками через протонированные аминогруппы с дефектными сайтами УНТ при значениях pH ниже изоэлектрической точки.При уровнях pH выше изоэлектрической точки они взаимодействуют посредством адсорбции амина. [110, 111] глюкозооксидаза; 2,5-дигидроксибензальдегид; бычий сывороточный альбумин. (i) Взаимодействие водородных связей между карбоксилированными УНТ и белками поддерживает адгезию ферментного комплекса на УНТ. [176] Помимо прямой нековалентной иммобилизации, непрямая иммобилизация с помощью полимеров и биомолекул, прикрепленных к УНТ, облегчает иммобилизацию ферментов или белков.Полимеры и биомолекулы были использованы для функционализации УНТ. Функционализированные УНТ обладают хорошей диспергируемостью в воде, а образование комплекса фермент-УНТ достигается с помощью якорной молекулы. Полимеры, нанесенные на УНТ, могут обеспечивать отрицательно и положительно заряженные функциональные группы на поверхности комплексов УНТ-полимер. Специфичность связывания ферментов или белков обусловлена ​​сочетанием многих молекулярных свойств, таких как гидрофобность, электростатические взаимодействия, водородные связи и стерические свойства [115, 116].В таблице 6 показаны примеры белков или ферментов, которые были иммобилизованы путем непрямой специфической адсорбции, и типы задействованных сил взаимодействия. Иммобилизованный белок или фермент Типы взаимодействия Ссылки Глюкозооксидаза (i) Поверхность УНТ была положительно заряжена путем покрытия поли (4-стиролсульфоната натрия) в сочетании с ионными жидкостями. (ii) Фермент адсорбировался на композитах из нанотрубок за счет электростатических взаимодействий. [177, 178] Алкогольдегидрогеназа (i) УНТ, инкапсулированные хитозаном, имеют положительно заряженную поверхность; ферменты были иммобилизованы за счет электростатического взаимодействия. [179] Глюкозооксидаза и алкогольдегидрогеназа (i) однонитевую ДНК оборачивали на УНТ, и ферменты иммобилизовали на УНТ, обернутые ДНК. (ii) Связывание ДНК с УНТ, по-видимому, в первую очередь связано с π — π стэкинг-взаимодействием с плоскостью ароматических нуклеотидных оснований, ориентированной параллельно поверхности нанотрубки. [178, 180–182] ДНКзим; Глюкозооксидаза (i) Стрептавидин и флавинадениндинуклеотид также использовались в качестве связывающих молекул между ферментами и УНТ. (ii) ДНКзим, иммобилизованный на УНТ, присоединенный стрептавидином через стабильные амидные связи. (iii) Глюкозооксидаза была иммобилизована на УНТ, функционализированных флавинадениндинуклеотидом через амидные связи. [183, 184] пероксидаза хрена; Цитохром c (i) Ферменты адсорбировались на УНТ, которые были покрыты поверхностно-активными веществами, такими как Тритон Х-100, додецилсульфат натрия и бромид цетилтриметиламмония. (ii) Ферменты и поверхностно-активные вещества собираются вместе на УНТ. УНТ обрабатывают ультразвуком в растворе поверхностно-активного вещества.Когда фермент смешивается с суспензией, он связывается с УНТ сильнее, чем поверхностно-активное вещество, и вытесняет поверхностно-активное вещество, чтобы получить доступ к поверхности УНТ. [104, 185, 186] Преимущества методов нековалентного присоединения для иммобилизации ферментов, среди прочего, заключаются в улучшенном сохранении белковых структур и свойств УНТ. Однако иммобилизованный белок в растворе находится в равновесии и поэтому может постепенно теряться из-за выщелачивания во время использования.С другой стороны, ковалентное сопряжение обеспечивает прочное прикрепление, но жесткая стадия окисления (например, сильными кислотами) разрушает -сети на поверхностях УНТ и может ухудшить их механические и электронные свойства [117]. Следовательно, ковалентное присоединение ферментов может привести к многократному использованию. О ковалентном присоединении белков к карбоксилированным УНТ с использованием популярного сшивающего агента 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) впервые сообщили Huang et al. [118] и Jiang et al. [119]. 11.2. Ковалентная иммобилизация 11.2.1. Прямое ковалентное связывание белков с УНТ Для предотвращения вымывания белков или ферментов использовались ковалентные связи для прикрепления молекул белка или фермента к УНТ. Ковалентная функционализация УНТ обычно достигается двумя основными подходами: (i) этерификацией или амидированием окисленных трубок и (ii) ковалентным присоединением функциональных групп к боковым стенкам [85, 86]. Был реализован эффективный одностадийный метод ковалентного присоединения алкильных групп, заканчивающихся карбоновой кислотой, к боковым стенкам углеродных нанотрубок [120].Дальнейшая функционализация карбоксильных групп на боковых цепях нанотрубок концевыми аминами и диаминами придает нанотрубкам улучшенную растворимость и переработку, что может позволить их присоединение к полимерным композиционным материалам посредством химического связывания через концевые функциональные группы на нанотрубках. Эти функциональные группы также обеспечивают сайты для ковалентного присоединения биологически активных частей, например аминокислот, пептидов, белков и олигонуклеотидов [120]. Ковалентная иммобилизация ферментов на УНТ также была осуществлена ​​путем обеспечения реакции свободных аминогрупп (на поверхности белка) с группами карбоновых кислот, которые образуются в результате бокового окисления УНТ, чему способствует 1-этил-3- (3диметиламинипропил). ) карбодиимид [112, 113, 118, 119].Метод широко применяется для ковалентной иммобилизации белков на карбоксилированных УНТ [108]. Для некоторых ферментов загрузка фермента превышает 1000 мк г фермента на мг УНТ [121, 122]. Конъюгаты стабильны при высоких температурах, обеспечивая комбинацию полезных свойств, таких как низкое сопротивление массопереносу, высокая активность и стабильность, а также возможность повторного использования. Сообщалось, что открытая поверхность УНТ может способствовать доступности субстрата для фермента, а УНТ могут способствовать передаче тепла [122].Ji et al. [121] показали, что ковалентно присоединенная липаза на УНТ имеет преимущества перед свободной липазой при катализе в органическом растворителе. Иммобилизованная липаза значительно улучшает преобразование субстрата по сравнению с нативной липазой. Было продемонстрировано, что ферменты на ОСУНТ обладают гораздо более высокой активностью, чем ферменты, конъюгированные с МСУНТ [109]. 11.2.2. Ковалентное прикрепление белков к УНТ с помощью связывающих молекул Связывающие молекулы, которые действуют как «мост» между материалом и белком, часто используются для ковалентной иммобилизации белка и ферментов на УНТ.Они связываются с УНТ посредством гидрофобного и π — π взаимодействий [123, 124], а также ковалентно связывают фермент, например, посредством амидной связи [125, 126]. Эти связывающие молекулы обладают преимуществами при иммобилизации ферментов. При иммобилизации пероксидазы хрена высоко реактивные группы сукцинимидилового эфира покрывали на УНТ, используя сукцинимидиловый эфир 1-пиренбутановой кислоты в качестве связывающей молекулы [123]. Pang et al. [124] сообщили, что с аминопиреном функциональные аминогруппы были равномерно введены на поверхность УНТ, и фермент иммобилизованная лакказа показал более высокую электрокаталитическую активность и лучшую стабильность, чем лакказа, иммобилизованная на первичных УНТ.Связывающие молекулы могут предоставлять УНТ специфические сайты для иммобилизации ферментов [102, 127]. На рис. 3 представлены три основных метода иммобилизации биомолекул на УНТ. 12. Структура и каталитическое поведение иммобилизованных ферментов Предпосылка использования наноразмерных структур для иммобилизации состоит в том, чтобы уменьшить диффузионные ограничения и максимизировать функциональную площадь поверхности для увеличения нагрузки ферментами [128]. Кроме того, физические характеристики наночастиц, такие как улучшенная диффузия и подвижность частиц, могут влиять на каталитическую активность присоединенных ферментов [101].Иммобилизация ферментов выгодна для коммерческого применения из-за удобства в обращении, легкости отделения ферментов от реакционной смеси и повторного использования, а также возможного повышения термической и pH-стабильности [129, 130]. Однако низкая биокаталитическая эффективность иммобилизованных ферментов является основным недостатком, препятствующим широкомасштабному применению. Нековалентные методы, которые используют простую физическую адсорбцию и обычно не требуют жестких условий обработки, на практике проще, однако приводят к меньшим нагрузкам, чем более сложные методы, как сообщается в исследовании Zhang и Henthorn [131].Авторы обнаружили, что количество загрузки фермента было значительно меньше для метода прямой адсорбции (66 микрограмм фермента на миллиграмм сухих углеродных нанотрубок), чем для метода линкерной молекулы (140 мкм г / мг). За последние 6 лет или около того некоторые исследовательские группы исследовали взаимосвязь между активностью и структурой иммобилизованных ферментов. Затем было проведено исследование сохраненной активности фермента, и они обнаружили, что только 27% активности фермента сохраняется, когда конъюгация производится с использованием прямой адсорбции, в то время как 57% активности фермента сохраняется с помощью линкерной молекулы [131].Караджанаги и др. [96] сообщили, что прямая физическая адсорбция вызывает значительное изменение вторичной структуры белка [132], использовали спектроскопию кругового дихроизма и флуоресценцию для анализа структурных изменений, происходящих при адсорбции белка. Во многих случаях более высокая стабильность объясняется более жесткой структурой, которую принимает фермент. Несколько спектроскопических методов были использованы для отслеживания возможных структурных изменений при иммобилизации.В таблице 7 показаны результаты некоторых недавних работ в этой области. Тип фермента и нанотрубок, функциональные группы на поверхности УНТ и методы иммобилизации являются решающими факторами, которые влияют на структуру фермента при иммобилизации [116]. Luminism L LB структурные изменения при иммобилизации 174] Белок Наноматериал Спектроскопические методы Результаты Ссылка Белок частично разворачивается при иммобилизации [110] Цитохром c MWCNT / poly (амидоамин) / хитозан UV-No Vis2 Амилоглюкозидаза ОСУНТ, МСУНТ (в сочетании с связывающими агентами) Круговой дихроизм Фермент сохраняет свою структуру при физической адсорбции.Однако ковалентное прикрепление приводит к значительной потере структуры. [187] Пероксидаза хрена SWCNT Круговой дихроизм и флуоресценция Ферменты сохраняют высокий процент своей нативной структуры при иммобилизации. [113] 13. Заключение Различные модифицированные методы синтеза были разработаны для производства УНТ в больших масштабах для коммерческого применения.В настоящее время метод CVD является наиболее многообещающим методом производства большого количества УНТ, поскольку его стоимость относительно невысока по сравнению с другими методами. Однако коммерческие применения УНТ развиваются довольно медленно, в первую очередь из-за высокой стоимости производства нанотрубок самого высокого качества. Химия УНТ достигла огромных успехов, и очевидно, что эта тема будет стимулировать применение углеродных нанотрубок. Функционализация УНТ, и особенно УНТ определенной длины, диаметра и хиральности, приведет к лучшему контролю материалов и устройств на основе УНТ на молекулярном уровне.Настоящая статья показывает, что их огромный потенциал для биотехнологии и биомедицины только начинает реализовываться. Различные биомолекулы (белки, ферменты или ДНК / РНК) могут взаимодействовать и иммобилизоваться на УНТ, что дает широкую область применения. Однако универсальной ферментной поддержки не существует, и лучший метод иммобилизации может отличаться от фермента к ферменту, от приложения к применению и от носителя к носителю. В будущем информация, полученная из белковых последовательностей, трехмерных структур и механизма реакции, должна быть дополнительно объединена с удивительными свойствами УНТ и физико-химическими методами, чтобы получить иммобилизованный фермент с еще большей стабильностью и более высокой каталитической активностью.Используя нековалентные подходы, ферменты могут быть менее денатурированы при иммобилизации, а внутренняя электронная структура и свойства УНТ сохраняются. Также необходимо изучить, как связывающие молекулы взаимодействуют с ферментами и влияют на структуру фермента и расположение ферментов на УНТ. Подвижность, ограничивающие эффекты, поведение раствора и межфазные свойства наноразмерных материалов могут придать уникальные свойства системам биокатализаторов, позволяя разработать революционный класс биокатализаторов, который отличается от традиционных иммобилизованных ферментов с точки зрения приготовления, каталитической эффективности и потенциала применения. .В будущем могут появиться новые механизмы и явления. Интерес к этой области быстро растет и, вероятно, в ближайшем будущем послужит толчком к более интересным разработкам. (PDF) Лесные потоки являются важными источниками выбросов закиси азота | 11 AUDET ET A l. Brookshire, E.N.J., Valett, H.M., Thomas, S.A., & Webster, J.R. (20 05) . Спаренный циклрастворенныйорганический азот иуглерод в лесах поток.Ecology, 86 (9), 2487–2496.https: //doi.org/10.1890/04-1184 Buffam, I., Laudon, H., Temnerud, J. , Mörth, C.M.,  & Bishop, K. (2007). Изменчивость в ландшафтном масштабе кислотности и растворенного органического углерода в течение весны. Floodinaborealstreamnetwork. Journ al of Geophysical Research: Biogeosciences,  112. ht tps: //doi.org/10.1029/2006J G000218 Ciais,  П.,  Сабин,  К.,  Бала,  Г.,  Бопп,  Л.,  Бровкин,  В., Канаделл,  Дж., … Heima nn,  M. (2014). Карбоновые и другие биогеохимические циклы. In T. F.Sto cker, D. Q in ,  G. ‐ K. Plattner,  M. Tign or, S . K. Allen,  J. Boschung, A.Nauels, Y.Xia, V. Bex,  & P.M.Midgley (Eds.), Climate change 2013: Основы физических наук. Вклад рабочих группы I в пятый оценочный отчет Межправительственной группы экспертов по изменению климата (стр. 465–570). Кембридж, Великобритания: «Кембридж» University Press. Čuhel, J., Šimek, M., Laughlin, R. J., Bru,  D., Chèneby, D., Watson, C.J.,  & Philippot, L. (2010). Insightsintoe activity. Applied and Environmental Microbiology,  76 (6),  1870–1878. https: // doi. org / 10.1128 / aem.02484-09 Davidson, E. A.,  &  Swank,  W. T. (1990). Закись азота растворенная в почве Решение : «Незначительный путь» потерь азота с юго-востока- из твердых пород древесины. Water Resources Research,  26 (7),  1687–1690. h t t p s : / / d o i. или г / 1 0. 1 0 2 9 / WR 0 2 6 i 0 0 7 p 0 1 6 8 7  Дэвис, M.P.,  & David, M.B. (2018). Потоки закиси азота из сельскохозяйственных культур ручьев в Восточно-Центральном регионе Иллинойса. Вода, воздух и загрязнение почвы, № 229 (11), № 354. https://doi. org / 10.1007 / s11270‐018-4007-7 Ekström,  S. M.,  Regnell,  O., Reader,  H.E., Nilsson,  P.A.,  Löfgren,  S.,  &  Kritzberg, E. S. (2016) . Повышение концентрации железа в поверхности воды как следующая последовательность восстанавливающих условий на водосборе . Журнал геофизических исследований: Biogeosciences, № 121 (2), № 479– 4 9 3.  ч т т п с : / / д о я. или г / 1 0. 1 0 0 2/2 0 1 5 J G 0 0 3 1 4 1 Эрикссон, Э., Карлтун, Э., Э. и Лундмарк, Э. Э. (1992). Подкисление лесов почв в Швеции. Амбио, №21 (2), №150–154. FAO. (2015). Глобальная оценка лесных ресурсов 2015 г., кабинетная справка. Получено с http://www.fao.org/3/a‐i4808e.pdf Fölster, J.,  Johnson,  R . K.,  Futter,  M. N. ,  &  Wilander,  A. (2014) . Шведский мониторинг забойных вод: 50 лет адаптивного монитора ing. Ambio, 43 (1), 3–18. https: //doi.org/10.1007/s13280‐014-0558‐z Garmo,  Ø. ​​A.,  Skjelk våle,  B.  L.,  de Wit,  H. A.,  Colom bo,  L.,  Cur tis,  C.,  Fölster,  J., …  Worsztynowicz, A. (2014) . Тенденции в поверхностных вод химии в подкисленных районах в Европе и Северной Америке с 1990 до 2008. Вода, воздух и загрязнение почвы, 225 (3), 1880. https: // doi. org / 10.1007 / s11270‐014-1880-6 Gauthier,  S.,  Bernier,  P., Kuuluvainen,  T., Shvidenko,  A . Z.,  & Щепащенко, Д.Г. (2015). Здоровье бореальных лесов и глобальные изменения . Наука, №349 (6250), №819–822.https: //doi.org/10.1126/scien ce.aaa9092 Grabb, K. C., Buchwa ld,  C.,  Hanse l,  C. M.,  &  Wankel,  S. D. (2017). A двойное нитритное изотопное исследование хемоденитрирования min- eral-associatedFe (II)  и его производство оксида азота. Geochimica et Cosmochimica Acta, 196,  388–402. https: //doi.org/10.1016/j. gca.2016.10.026 Grossel, A.,  Nicoullaud, B., Bourennane,  H., Lacoste, M., Guimbaud, C.,  Robert, C.,  &  Henault,  C. (2016). ni‐ выбросов двуокиси углерода из почв и дренажных водотоков в возделываемых землях landsc ape in Centr al France. Agriculture Ecosystems & Environment, 230, 251–260.https: //doi.org/10.1016/j.agee.2016.06.015 Hansen, M.C., Potapov, P.V., Moore, R. , Hancher, M., Turubanova, S.A., Tyukavina,  A., … Townshend, J.R. G. (2013) . Глобальные карты с высоким разрешением карты21-го века .https: //doi.org/10.1126/science.1244693 Hawkes, J.A., Radoman, N., Bergquist, J., Wallin, M. B., Tranvik, L .J.,  &  Löfgren, S. (2018). Региональное разнообразие сложногорастворенного органического вещества вещества в лесных массивах гемибореального региона.  верховья ручьи. Scientific Reports, 8 (1), 16060.https: //doi.org/10.1038 / s41598‐018‐34272‐3 Holl, B.S., Jungkunst, H.F., Fiedler, S.,  & Stahr, K. (2005). «Непрямая» эмиссия азота из насыщенных азотом лесов ели и общая точность методологии IPCC. Атмосферная среда, №39 (32), 5959–5970. https: //doi.org/10.1016/j.atmosenv.2005.06.026 IPCC. (2013). «Климатическое изменение 2013: основы физических наук. Вклад рабочей группы I в пятый оценочный отчет Межправительственной группы экспертов по изменению климата .Кембридж, Великобритания / Нью-Йорк, Нью-Йорк: «Кембридж» University Press. Kortelainen,  P., Mattsson,  T.,  Finér, L.,  Ahtiainen,  M.,  Saukkonen,  S.,  & Sallantaus, T. (2006) . «Контроль» за «экспортом» C, N, P и «Fe» из ненарушенных северных водосборов,  Финляндия. Aquatic Sciences, 68 (4),  453–468. Https: //doi.org/10.1007/s00027‐006‐0833‐6 Котавала,  D. N.,  Watmough,  S. A., Futter, M.  N.,  Zhang,  L.,  &  Dillon,  P. J. (2011). Stream nitrat e быстро реагирует на уменьшение отложений g нитрата . Ecosystems, 14 (2),  274–286. https: // doi.org/10.1007/ s10 021-011-9422-1 Kulkarn i,  M. V.,  Yavitt,  J. B.,  &  Gr offman,  P. M.  (2017) . Rapid conver‐‐ sion of add ed nitrate to nitro us Oxid и dinit rogen в северной лесной почве Geomicrobiology Journal, 34 (8),  670–676. https: // doi. орг / 10.1080 / 01490451.2016.1238981 Kyllmar, K., Carlsson, C., Gustafson, A., Ulen, B., & Johnsson, H. из малых сельскохозяйственных водосборов в Швеции характеристика и тенденции. Agriculture Ecosystems & Environment,  115 (1–4), 15–26.https: //doi.org /10.1016/j.agee.2005.12.004 Kyllmar, K., Forsberg, L.S., Andersson, S., & Martensson, K. (2014). Small  сельскохозяйственных мониторинговых водосборовв Швеции, представляющихприрод‐ психического »воздействия. Agriculture Ecosys tems & Environment, 198,  25–35. https: //doi.org/10.1016/j.agee.2014.05.016 Laudon, H., Berggren, M. , Агрен, A., Buffam, I., Bishop,  K., Grabs,  T.,…  Köhler, S. (2011). Pat terns и Динамика растворенного органического автомобиля‐ бон (DOC)  внутренних бореальных потоков: рол е процессов,  связи,  , и масштабирование. Ecosystems, 14 (6),  880–893. https: //doi.org/10.1007/ s10 021‐011‐9452‐8 Laudon,  H.,  Köhler, S.,  &  Buffam,  I. (2004). «Сезонный» экспорт ТОС из семи «бореальных» водосборов в северной Швеции. Aquatic Sciences, 66. (2),  223–230. https: //doi.org/10.1007/s00027‐004‐0700-2 Laudon, H., Taberman, I., Ågren, A. ., Futter, M., Ottosson-Löfvenius, M.,  & Bishop, K. (2013). структура для гидрологии, биогеохимии, климатических исследований в бореальных ландшафтов.Water Resources Research, 49 (10), 7154–7158. https: //doi.org/10.1002/wrcr.20520 Laverman, A. M.,  Zoomer, H .R.,  & Verhoef,  H. A. (2001). Эффект кислорода, pHиорганическогоуглерода насло почвы специфическогоденитрификации Ca‐ pacityinacidconiferousforest. Soil Biology & Biochemistry, 33 (4–5),  683–687.https: //doi.org/10.1016/S0038‐ 0717 (00) 00180-2 Ledesma, J. L. J.,  Futter,  M. N.,  Blackburn,  M.,  Lidman,  F., Grabs,  T.,  Sponsell er, R.A., … Köhle r, S .J. (2018). Tow ards animprovedco ncep‐ tualizationriparianzones inborealforestheadwaters.Ecosystems, 21 (2), 297–315.https: //doi.org /10.1007/s10021‐017‐0149‐5 Лю, B.,  Mørkved,  P. T., Frostegård, Å.,  &  Bakken,  L. R. (2010) . Денитрификация генные пулы, транскрипция и кинетика NO,  Продукция N2O и N2 в зависимости от pH почвы. FEMS Microbiology Ecology, 72 (3), 407–417. ht tps : // doi .org /10.1111/ j.1574–6941. 2010 г. 00856.x Löfgren,  S.,  Fröberg,  M.,  Yu,  J., Nise ll,  J.,  &  Ranne by, B . (2014). Вода химический состав в 179 случайно выбранных шведских верхних водотоках связанных с производством лесов, вырубкой лесов и климатом. Экологические Мониторинг и оценка, 186 ( 12),  8907–8928. https: // doi. орг / 10.1007 / s10661‐014‐4054‐5 Lucas, R.W., Sponseller, R.A.,  & Laudon, H. (2013) . Controlsoverbase концентрации катионов в потоке и речных водах: долгосрочный анализ относится к роли отложений и климата. Экосистемы, №16 (5 ), 707–721. https: //doi.org /10.10 07 / s10021‐013‐9641-8 ТОП-9 самых популярных брендов светодиодных драйверов входного сигнала постоянного тока 12В и бесплатная доставка Топ-10 Лучшие адаптеры Ledmo Ac 2021 — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой про 10 лучших светодиодных диммеров 2020 — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой про 10 лучших светодиодных декодеров Dmx 2020 — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучшие игровые про Светодиоды от источника переменного тока — LEDs Magazine LEDs MagazineТоп 10 лучших светодиодных фонарей с питанием от постоянного тока 2020 — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой проТоп 10 лучших измерителей вольтметров 2020 года — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой проТоп 10 лучших морозильников 12vs 2021 — Bestgaming pro — Лучший игровой про Лучший игровой проТоп 10 лучших автомобильных зарядных устройств для Xos 2021 — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой проТоп 10 лучших двухканальных 5-канальных усилителей 2020 года — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой проТоп 10 лучших электрических преобразователей 2020 — Bestgamingpro — Лучшие Gaming Pro Лучший игровой проЛучший игровой проТоп 10 лучших автомобильных аксессуаров с настройкой микронастройки 2021 — Bestgamingpro — лучший игровой про лучший игровой проТоп 10 лучших автомобильных систем безопасности Viper 2021 — Bestgamingpro — лучший геймерский про Лучший игровой проТоп 10 лучших автомобильных ламп зажигания 2020 — Bestgamingpro — лучший игровой про 10 лучших автомобильных аудиоприемников Xo Vision с Bluetooth в 2021 году — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой проТоп 10 лучших автомобильных адаптеров USB на 12 В 2020 года — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой проектор BLUETTI проводит огромную летнюю распродажу — сэкономьте до 947 долларов — Разработчики XDA Разработчики XDA 10 лучших автомобильных зарядных устройств с USB-портами в 2021 году — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой про roTop 10 лучших DVD-плееров Pyle Flip Down 2020 — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой про Полное руководство по использованию правильного зарядного устройства или адаптера питания (и что произойдет, если вы этого не сделаете) — groovy — Runner’s World Runner’s WorldTop 10 лучших винтажных ресиверов 2021 года — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой proMi Smart Speaker Review — Гаджеты 360 Гаджеты 360Elon Musk’s ‘Hustle’ Комментарий на SNL приводит к падению Dogecoin почти на 30 процентов — ABP Live ABP LiveTop 10 лучших кемпинговых холодильников 2020 — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучшее игровое про Новости рынка proShare: Sensex, Nifty близки к рекордным максимумам на фоне поддерживающих глобальных сигналов; Банковские акции сияют — ABP Live ABP Live «Большой шаг к прозрачности»: Рави Шанкар Прасад благодарит Google и Facebook за первый отчет о соответствии — ABP Live ABP Live Мизорам стремится к централизованному вмешательству, чтобы снять блокаду со стороны Ассама, заявляет, что злоумышленники разрушили железнодорожные пути — ABP Live ABP LiveFM Выступление Нирмалы Ситхараман о бюджете на 2021 год: Полный текст — ABP Live ABP Live Корейско-американские профессионалы в области напитков приносят «солидарность» в Нью-Йорк — VinePair VinePair Готовы ли светодиодные люминесцентные лампы к прайм-тайму? — Greentech Media Greentech MediaTop 10 Лучший монитор Tft с Hdmis 2020 — Bestgamingpro — Лучший игровой про Лучший игровой про Новый претендент на Raspberry Pi обещает 7-кратную скорость при 2-кратной цене с Android 9 Pie, USB 3.0, 4K видео — TechRepublic TechRepublic решит, когда явиться в полицию: Испорченный президент BJP Кералы К. Сурендран о денежном кейсе «Хавала» — ABP Live ABP LiveLIAN LI запускает новую систему блокировки вентиляторов с UNI FAN SL120 — guru3__ guru3__Это соперничество Raspberry Pi продается сейчас: $ 63 Odroid-N2 обещает большую скорость, USB 3.0, Android 9, видео 4K — TechRepublic TechRepublicTop 10 | Утренний бюллетень ABP LIVE: главные заголовки новостей с 14 января 2021 года, чтобы начать свой день — ABP Live ABP LiveReview: солнечная панель Explorer 50 Вт и зарядное устройство Explorer 240 — DroneDJ Drone обзор: Увеличьте мощность своих устройств в дороге — Techaeris TechaerisDahua HDVCI-POC камеры видеонаблюдения | Новости безопасности — SourceSecurit__ SourceSecurit__Используйте аккумуляторы Ebike в качестве портативного источника переменного тока с инвертором 48 В постоянного / переменного тока за 125 долларов Звонок в автомобильную аудиосистему — Forbes Forbes2013 Toyota Land Cruiser, судя по всему, обновился — Autoblog Autoblog46 Лучшие мотоциклетные светодиодные фары 2021 года: по мнению экспертов.- Game Polar Game PolarIndependence Day 2020: полный текст обращения премьер-министра Моди к народу с крепостных валов Красного форта — ABP Live ABP LiveANTOP AT-125B Indoor Antenna и AT-400BV Indoor / Outdoor Antenna review — Gadgeteer The GadgeteerIP-камеры | Сетевые камеры | IP-камеры видеонаблюдения — SecurityInformed SecurityInformed6 лучших портативных зарядных устройств, которые можно купить в эту Черную пятницу — Отчет Windows Отчет по Windows Toyota Land Cruiser (2013) — изображения, информационные характеристики — NetCarSho__ NetCarSho__Toyota Avalon (2013) — изображения, информационные характеристики — NetCarSho__ NetCarSho__Toyota HiLux (2016) — фотографии, информационные характеристики — NetCarSho__ NetCarSho__Bihar Девушка Джиоти Кумари, которая проехала на велосипеде из Гуруграма в свою деревню в Дарбханге во время изоляции от коронавируса Covid-19, теперь будет играть главную роль в кино! — ABP Live ABP Live47 Лучшие детские электромобили от BMW в 2021 году: по мнению экспертов.- Game Polar Game Polar46 Лучшие плоские лампочки 2021 года: по мнению экспертов. — Игра Polar Game Polar49 Лучшие новые технологии Samsung могут превратить умный автомобиль в мобильный офис в 2021 году: по мнению экспертов. — Игра Polar Game Polar50 Лучшие мотоциклы со светодиодными фарами в 2021 году: по мнению экспертов. — Game Polar Game Polar45 Лучшие адаптеры переменного тока на 12 В в 2021 году: по мнению экспертов. — Game Polar Game Polar49 Лучшие лучшие программируемые светодиодные знаки в 2021 году: по мнению экспертов. — Игра Polar Game Polar48 Лучшие пирамидальные автомобильные усилители в 2021 году: по мнению экспертов.- Игра Polar Game Polar49 Лучшие навигационные огни с батарейным питанием в 2021 году: по мнению экспертов. — Игра Polar Game Polar Пытаемся вовремя доставить меня — сентябрь / октябрь 2021 г. | Страница 4 — Tesla Motors Club Tesla Motors Club Рассматривает возможность изменения моего заказа, но беспокоится о задержке доставки — Tesla Motors Club Tesla Motors Club 47 Лучшие системы дистанционного пуска автомобилей через OBD в 2021 году: по мнению экспертов. — Игра Polar Game Polar49 Лучшие мониторы для автомобильных подголовников в 2021 году: по мнению экспертов. — Игра Polar Game Polar47 Лучшие док-станции для жестких дисков в 2021 году: по мнению экспертов.- Game Polar Game Polar45 Лучшие лучшие док-станции ssd в 2021 году: по мнению экспертов. — Игра Polar Game Polar46 Лучший планшет с портами hdmi в 2021 году: по мнению экспертов. — Игра Polar Game Polarback обновляет камеру — не впечатлен — Клуб Tesla Motors Клуб Tesla Motors Пирс Морган в Ньютауне, штат Коннектикут. Стрельба в школе: «Сколько еще детей должно умереть, прежде чем вы, ребята, скажете:« Мы хотим меньше оружия, а не больше » ‘- CNN CNN ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код 000 ПЕРСОНАЛ 000 000 000 000 ПЕРСОНАЛ ВЫБОР Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код НАБОР ПЕРСОНАЛА Код НАБОР ПЕРСОНАЛА Код НАБОР ПЕРСОНАЛА Код НАБОР ПЕРСОНАЛА Код Код ПЕРСОНАЛА Код 000 000 ПЕРСОНАЛ 000 000 000 ПЕРСОНАЛ 000 000 ВЫБОР Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ 000 000 000 000 000 ПИК 000 Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ Код ПЕРСОНАЛ ПИК FF Код ПЕРСОНАЛ FF Код ПЕРСОНАЛ FF Код ПЕРСОНАЛ FF Код Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ОТБОР ПЕРСОНАЛА Код Код ПЕРСОНАЛА 000 000 000 000 000 000 ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ПОДБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код ВЫБОР ПЕРСОНАЛА Код НАБОР ПЕРСОНАЛА Код НАБОР ПЕРСОНАЛА Код НАБОР ПЕРСОНАЛА Код НАБОР ПЕРСОНАЛА Код Код ПЕРСОНАЛА Код 000 000 000 000 000 000 9_0002 Led mr16 -ic драйвер, подходит для любого диммера, сочетается с.Электронный трансформатор. -dc12v, 8w, 2700к-2900к. Сша кри чип. 8w cree dc12v ic драйвер led mr16. Особенности продукта ~. 1. США. Кри. Чип, 4шт. 1_ Создание светодиодных RGB-дисплеев — одна из самых интересных задач программирования и инженерии, которую мы видим здесь, на Hackaday. С этим приходится иметь дело не только создателям больших дисплеев и светодиодных кубов. 2_ Этот продукт состоит из панели TFT-LCD, микросхем драйвера, FPC и блока светодиодной подсветки. Повысьте привлекательность своего продукта, выбрав ЖК-дисплей TFT, ЖК-дисплей Topway превратился в линейку жидких TFT-дисплеев. 3_ Светодиодный источник питания -180Вт светодиодный трансформатор, переменный ток в постоянный. -низкая температура, долгий срок службы. -защита от перенапряжения. -2 года гарантии. Водонепроницаемый светодиодный блок питания 180 Вт 15 А. Пожалуйста, посоветуйте мне свой. 4_ Описание: Характеристики и применение Высота матрицы 0,7 дюйма Размер точки 2 мм Возможность штабелирования по горизонтали и вертикали Простой монтаж на печатной плате или гнездах Серая поверхность, белая точка Совместимость с RoHS Монохромный для помещений. Драйвер входного светодиода dc12v Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт. Настройка вашего браузера для приема файлов cookie Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины: В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie. Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie. Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер. Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере. Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором. Почему этому сайту требуются файлы cookie? Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня. Что сохраняется в файле cookie? Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется. Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать. Операторы BDC обвиняют CBN в росте цен на продукты питания, другие Автор Aduragbemi Omiyale Информационный семинар для обсуждения стандартов на сельскохозяйственные товары в Нигерии начнется в понедельник, 8 ноября, и закончится 9 ноября 2021 года в отеле Protea в Икеджи, Лагос. Мероприятие организовано Комиссией по ценным бумагам и биржам (SEC) и организацией по стандартизации Нигерии (SON). Семинар по повышению осведомленности о товарных стандартах направлен на улучшение национальной экосистемы торговли товарами и сделать ее привлекательной для инвесторов в качестве важных заинтересованных сторон, таких как переработчики, фермерские группы, экспортеры, фермерские кооперативы, продавцы / покупатели, а также сотрудники по распространению сельскохозяйственных знаний проведут мозговой штурм о том, как улучшить положение. Отчет по экосистеме торговли сырьевыми товарами определил стандарты и сортировку как важные для определения качества и стоимости товаров.Эффективное использование этих стандартов гарантированно устранит некачественные сельскохозяйственные товары и расширит внутреннюю и международную торговлю товарами, происходящими из Нигерии. Комитет по внедрению экосистемы торговли сырьевыми товарами, в состав которого входят основные заинтересованные стороны, работал над разработкой системы классификации и стандартизации в соответствии с передовой международной практикой, и это стало важной информацией для участников мероприятия. Недавно генеральный директор Комиссии по ценным бумагам и биржам г-н Ламидо Югуда заявил, что в рамках реализации 10-летнего Генерального плана рынка капитала комиссия учредила Технический комитет по экосистеме торговли сырьевыми товарами, в задачу которого входило выявление проблем существующую структуру и разработайте дорожную карту для динамичной экосистемы. «Для реализации отчета был создан комитет, в состав которого вошли различные заинтересованные стороны, включая SON. Одна из рекомендаций в отчете указывает на развитие системы аттестации и стандартизации в соответствии с передовой международной практикой », — сказал он. Г-н Югуда заявил, что во всем мире признается, что уникальной особенностью товарной биржи является стандартизация товаров, торгуемых на ее платформе. «Однако определение этих классов и стандартов зависит от утвержденных местных стандартов, которые должны учитывать международно признанные стандарты.Принятие международных стандартов для экспортных товаров не может быть нарушено, если биржи должны играть ключевую роль в продвижении экспорта », — сказал он. Он отметил, что установление соответствующих стандартов изменит экосистему торговли сырьевыми товарами Нигерии. «Стандарты обеспечивают потребителей гарантией соответствия назначению, переработчиков — спецификациями товаров, и служат ориентиром, с которым можно сравнивать характеристики товаров. «Другие преимущества включают увеличение стоимости для мелких фермеров за счет надбавки за высококачественные товары, сокращение послеуборочных потерь из-за стандартной послеуборочной обработки, упаковки и хранения, а также расширение возможностей трудоустройства за счет установки. складов и пробирных компаний для оказания услуг по контролю качества », — сказал он. Со своей стороны, генеральный директор SON, г-н Фарук Салим, сказал, что агентство было взволновано сотрудничеством с SEC, поскольку оно стремится развивать рынок капитала в Нигерии и нигерийскую экономику в целом. «Мы стремимся помогать нашим людям, особенно фермерам, и поддерживать их в достижении продовольственного достатка. Если будет стандартизация, банки будут готовы финансировать фермеров, а товары можно будет экспортировать за столь необходимую иностранную валюту для стимулирования нашей экономики », — сказал он. Нравится: Нравится Загрузка … Связанные . Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт