Кривошипно-шатунный механизм. Назначение и устройство КШМ

Кривошипно-шатунный механизм (далее сокращенно – КШМ) – механизм двигателя. Основным назначением КШМ является преобразование возвратно-поступательных движений поршня цилиндрической формы во вращательные движения коленчатого вала в двигателе внутреннего сгорания и наоборот.

Устройство КШМ

 

Поршень

Поршень имеет вид цилиндра, изготовленного из сплавов алюминия. Основная функция этой детали заключается в превращении в механическую работу изменение давления газа, или наоборот, – нагнетание давления за счет возвратно-поступательного движения.

Поршень представляет собой сложенные воедино днище, головку и юбку, которые выполняют совершенно разные функции. Днище поршня плоской, вогнутой или выпуклой формы содержит в себе камеру сгорания. Головка имеет нарезанные канавки, где размещаются поршневые кольца (компрессионные и маслосъемные).

Компрессионные кольца исключают прорыв газов в картер двигателя, а поршневые маслосъемные кольца способствуют удалению излишков масла на внутренних стенках цилиндра. В юбке расположены две бобышки, обеспечивающие размещение соединяющего поршень с шатуном поршневого пальца.

 

Шатун

Изготовленный штамповкой или кованый стальной (реже – титановый) шатун имеет шарнирные соединения. Основная роль шатуна состоит в передаче поршневого усилия к коленчатому валу. Конструкция шатуна предполагает наличие верхней и нижней головки, а также стержня с двутавровым сечением. В верхней головке и бобышках находится вращающийся («плавающий») поршневой палец, а нижняя головка – разборная, позволяющая, тем самым, обеспечить тесное соединение с шейкой вала. Современная технология контролируемого раскалывания нижней головки позволяет обеспечить высокую точность соединения ее частей.

 

Коленчатый вал

Изготовленный из стали или чугуна высокой прочности коленчатый вал состоит из шатунных и коренных шеек, соединенных щеками и вращающихся в подшипниках скольжения. Щеки создают противовес шатунным шейкам. Основная функция коленчатого вала состоит в восприятии усилия от шатуна для преобразования его в крутящий момент. Внутри щек и шеек вала предусмотрены отверстия для подачи под давлением масла системой смазки двигателя.

 

Маховик

Маховик устанавливается на конце коленчатого вала. На сегодняшний день находят широкое применение двухмассовые маховики, имеющие вид двух, упруго соединенных между собой, дисков. Зубчатый венец маховика принимает непосредственное участие в запуске двигателя через стартер.

 

Блок и головка блока цилиндров

Блок цилиндров и головка блока цилиндров отливаются из чугуна (реже – сплавов алюминия). В блоке цилиндров предусмотрены рубашки охлаждения, постели для подшипников коленчатого и распределительного валов, а также точки крепления приборов и узлов. Сам цилиндр выполняет функцию направляющей для поршней. Головка блока цилиндра располагает в себе камеру сгорания, впускные-выпускные каналы, специальные резьбовые отверстия для свечей системы зажигания, втулки и запрессованные седла. Герметичность соединения блока цилиндров с головкой обеспечены прокладкой. Кроме того, головка цилиндра закрыта штампованной крышкой, а между ними, как правило, устанавливается прокладка из маслостойкой резины.

В целом, поршень, гильза цилиндров и шатун формируют цилиндр или цилиндропоршневую группу кривошипно-шатунного механизма. Современные двигатели могут иметь до 16 и более цилиндров.

РЕКОМЕНДУЕМ ТАКЖЕ ПРОЧИТАТЬ:

Устройство КШМ

 

 

 

 

КШМ ВАЗ 2110, 2111, 2112 Основные размеры КШМ ВАЗ 2110, 2111, 2112 показаны на рисунке. Хорошо зарекомендовали себя двигателя ВАЗ 2110, они имеют много взаимозаменяемых деталей КШМ с двигателями ВАЗ 2108, ВАЗ 2109

Кривошипно-шатунный механизм (КШМ) преобразует прямолинейное возвратно-поступательные движения поршней, воспринимающих давление газов, во вращательное движение коленчатого вала.

Устройство КШМ можно разделить на две группы: подвижные и неподвижные.

Подвижные детали: 

поршень, поршневые кольца, поршневые пальцы и шатуны, коленчатый вал, маховик.

Блок-картер, головка блока цилиндров, гильзы цилиндров. Имеются также фиксирующие и крепежные детали.

Поршневая группа

Поршневая группа включает в себя поршень, поршневые кольца, поршневой палец с фиксирующими деталями. Поршень воспринимает усилие расширяющихся газов при рабочем ходе и передает ею через шатун па кривошип коленчатого вала; осуществляет подготовительные такты; уплотняет над поршневую полость цилиндра как от прорыва газов в картер, так и от излишнего проникновения в нее смазочного материала.

Коренные подшипники

Для коренных подшипников применяются подшипники скольжения, выполненные в виде вкладышей, основой которых является стальная лента толщиной 1,9—2,8 мм для карбюраторных двигателей и 3—6 мм для дизелей. В качестве антифрикционного материала вкладышей используют высокооловянистый алюминиевый сплав для карбюраторных двигателей и трехслойные с рабочим слоем из свинцовой бронзы.

Маховик

Маховик служит для уменьшения неравномерности вращения коленчатого вала, накопления энергии во время рабочего хода поршня, необходимой для вращения вала в течение подготовительных тактов, и вывода деталей КШМ из ВМТ (верхней мертвой точки) и НВТ (нижней мертвой точки).
В многоцилиндровых двигателях маховик является, в основном, накопителем кинетической энергии, необходимой для пуска двигателя и обеспечения плавного трогания автомобиля с места.

Маховики отливают из чугуна в виде лиска с массивным ободом и проводят его динамическую балансировку в сборе с коленчатым валом. На ободе маховика имеется посадочный поясок для напрессовки зубчатого венца для электрического пуска стартером. На цилиндрической поверхности маховика находятся метки или маркировочные штифты и надписи, определяющие момент прохождения ВМТ поршнем первого цилиндра. На торцевую рабочую поверхность опирается фрикционный диск сцепления. Для крепления его кожуха имеются резьбовые отверстия. Маховик центрируют по наружной поверхности фланца с помощью выточки, а положения его относительно коленчатого вала фиксируют установочным штифтом или несимметричным расположением отверстий крепления маховика.

Поршни

Форма и конструкция поршня, включая днище поршня и отверстие под поршневой палец, в значительной степени определяются формой камеры сгорания.

Устройство шатуна Шатун необходим для соединения поршня с коленчатым валом и передачи усилия от поршня к коленчатому валу

 

Устройство КШМ автомобиля. 

1 — стопорное кольцо, 2 — поршневой палец, 3 — маслосьемные кольца, 4 — компрессионные кольца, 5 — камера сгорания, 6 — днище поршня, 7 — головка поршня:     8 — юбка поршня;  9 —  поршень: 10 — форсунка; 11- шатун; 12  — вкладыш;  13 — шайба , 14 — длинный болт; 15 — короткий болт; 16 — крышка шатуна, 17  —  втулка шатуна;  18 — номер на шатуне; 19 — метка на крышке шатуна; 20 —  шатунный болт.

 

Поршень состоит из головки поршня и направляющей части — юбки поршня. С внутренней стороны имеются приливы — бобышки с гладкими отверстиями под поршневой палец. Для фиксации пальца в отверстиях проточены канавки под стопорные кольца. В зоне выхода отверстий на внешних стенках юбки выполняются местные углубления, где стенки юбки не соприкасаются со стенками цилиндров. Таким образом получаются так называемые холодильники. Для снижения температуры нагрева направляющей поршня в карбюраторных двигателях головку поршня отделяют две поперечные симметричные прорези, которые препятствуют отводу теплоты от днища.

Нагрев, а следовательно, и тепловое расширение поршня по высоте неравномерны. Поэтому поршни выполняют в виде конуса овального сечения. Головка поршня имеет диаметр меньше, чем направляющая. В быстроходных двигателях, особенно при применении коротких шатунов, скорость изменения боковой силы довольно значительна. Это приводит к удару поршня о цилиндр. Чтобы избежать стуков, при перекладке поршневые пальцы смещают на 1,4—1,6 мм в сторону действия максимальной боковой силы, что приводит к более плавной перекладке и снижению уровня шума.

Головка поршня состоит из днища и образующих ее стенок, в которых именно канавки под поршневые кольца. В нижней канавке находятся дренажные отверстия для отвода масла диаметром 2,5—3 мм. Днище головки является одной из стенок камеры сгорания и воспринимает давление газов, омывается открытым пламенем и горячими газами. Для увеличения прочности днища и повышения обшей жесткости головки се стенки выполняются с массивными ребрами. Днища поршней изготовляют плоскими, выпуклыми, вогнутыми и фигурными. Форма выбирается с учетом типа двигателя, камеры сгорания, процесса смесеобразования и технологии изготовления поршней.

Поршневые кольца

Поршневые кольца — элементы уплотнения поршневой группы, обеспечивающие герметичность рабочей полости цилиндра и отвод теплоты от головки поршня.

По назначению кольца подразделяются на:

Компрессионные кольца — препятствующие прорыву газов в картер и отводу теплоты в стенки цилиндра.

Маслосъемные кольца — обеспечивающие равномерное распределение масла по поверхности цилиндра и препятствующие проникновению масла в камеру сгорания.

Изготовляются кольца из специальною легированною чугуна или стали. Разрез кольца, называемый замком, может быть прямым, косым или ступенчатым. По форме и конструкции поршневые кольца дизелей делятся на трапециевидные, с конической поверхностью, и подрезом, маслосъемные, пружинящие с расширителем; поршневые кольца карбюраторных двигателей — на бочкообразные, с конической поверхностью со скосом, с подрезом; маслосьемные — с дренажными отверстиями и узкой перемычкой, составные предсталяют собой два стальных лиска (осевой и радиальный расширители).

Составное маслосъемное поршневое кольцо (а) и его установка в головке поршня двигателя: 1 — дискообразное кольцо; 2 — осевой расширитель; 3 — радиальный расширитель; 4— замок кольца; 5 — компрессионные кольца; 6 — поршень; 7 — отверстие в канавке маслосъемного кольца.

Для повышения износостойкости первого компрессионного кольца, работающего и условиях высоких температур  и граничного трения, его поверхность покрывают пористым хромом. Устанавливая на поршень поршневые кольца, необходимо следить за тем, чтобы замки соседних колец были смещены один относительно другого на некоторый угол (90 —180 градусов). Поршневой палец обеспечивает шарнирное соединение шатуна с поршнем. Поршневые пальцы изготовляют из малоуглеродистых сталей. Рабочую поверхность тщательно обрабатывают и шлифуют. Для уменьшения массы палец выполняют пустотелым.

Установка поршневого пальца

Шатун шарнирно соединяет поршень с кривошипом коленчатого вала. Он воспринимает от поршня и передает коленчатому валу усилие давления газов при рабочем ходе, обеспечивает перемещение поршней при совершении вспомогательных тактов. Шатун работает в условиях значительных нагрузок действующих по его продольной оси. Шатун состоит из верхней головки, в которой имеется гладкое отверстие под подшипник поршневого пальца; стержня двутаврового сечения и нижней головки с разъемным отверстием для крепления с шатунной шейкой коленчатого вата. Крышка нижней головки крепится с помощью шатунных болтов. Шатун изготавливают методом гарячей штамповки из высокочественной стали. Для более подробного изучения создан раздел «Устройство шатуна«.

Устройство шатуна

Для смазывания подшипника поршневого пальца (бронзовая втулка) в верхней головке шатуна имеются отверстие или прорези. В двигателях марки «ЯМЗ» подшипник смазывается под давлением, для чего в стержне шатуна имеется масляный канал. Плоскость разъема нижней головки шатуна может располагаться под различными углами к продольной оси шатуна. Наибольшее распространение получили шатуны с разъемом перпендикулярным к оси стержня, В двигателях марки «ЯМЗ» имеющим больший диаметр,  чем диаметр цилиндра, pазмер нижней головки шатуна, выполнен косой разъем нижней головки, так как при прямом разъеме монтаж шатуна через цилиндр при сборке двигателя становится невозможным. Для подвода масла к стенкам цилиндра на нижней головке шатуна имеется отверстие. С целью уменьшения трения и изнашивания в нижние головки шатунов устанавливают подшипники скольжения, состоящие из двух взаимозаменяемых вкладышей (верхнего и нижнею).

Вкладыши изготовляются из стальной профилированной ленты толщиной 1,3—1,6 мм для карбюраторных двигателей и 2—3,6 мм для дизелей. На ленту наносят антифрикционный сплав толщиной 0,25—-0,4 мм — высокооловянистый алюминиевый сплав (для карбюраторных двигателей). На дизелях марки «КамАЗ» применяют трехслойные вкладыши, залитые свинцовистой бронзой. Шатунные вкладыши устанавливаются в нижнюю головку шатуна с натягом 0,03—0,04 мм. От осевого смешения и провертывания вкладыши удерживаются в своих гнездах усиками, входящими в пазы, которые при сборке шатуна и крышки должны располагаться на одной стороне шатуна.

Устройство двигателя автомобиля не сложно для обучения, главное изучать материал последовательно и систематизированно.

СОДЕРЖАНИЕ:

1. Устройство КШМ двигателя

1.1 Подвижные детали КШМ

1.2 Неподвижные детали КШМ

2. Неисправности КШМ двигателя

2.1 Звуки неисправностей двигателя (стуки двигателя)

2.2 Признаки и причины неисправностей двигателя автомобиля

3. Капитальный ремонт двигателя автомобиля

 

Назначение и устройство кривошипно-шатунного механизма ДВС

Двигатели внутреннего сгорания, используемые на автомобилях, функционируют за счет преобразования энергии, выделяемой при горении горючей смеси, в механическое действие – вращение. Это преобразование обеспечивается кривошипно-шатунным механизмом (КШМ), который является одним из ключевых в конструкции двигателя автомобиля.

Устройство КШМ

Кривошипно-шатунный механизм двигателя состоит из трех основных деталей:

1. Цилиндро-поршневая группа (ЦПГ).
2. Шатун.
3. Коленчатый вал.

Все эти компоненты размещаются в блоке цилиндров.

ЦПГ

Назначение ЦПГ — преобразование выделяемой при горении энергии в механическое действие – поступательное движение. Состоит ЦПГ из гильзы – неподвижной детали, посаженной в блок в блок цилиндров, и поршня, который перемещается внутри этой гильзы.

После подачи внутрь гильзы топливовоздушной смеси, она воспламеняется (от внешнего источника в бензиновых моторах и за счет высокого давления в дизелях). Воспламенение сопровождается сильным повышением давления внутри гильзы. А поскольку поршень это подвижный элемент, то возникшее давление приводит к его перемещению (по сути, газы выталкивают его из гильзы). Получается, что выделяемая при горение энергия преобразуется в поступательное движение поршня.

Для нормального сгорания смеси должны создаваться определенные условия – максимально возможная герметичность пространства перед поршнем, именуемое камерой сгорания (где происходит горение), источник воспламенения (в бензиновых моторах), подача горючей смеси и отвод продуктов горения.

Герметичность пространства обеспечивается головкой блока, которая закрывает один торец гильзы и поршневыми кольцами, посаженными на поршень. Эти кольца тоже относятся к деталям ЦПГ.

Шатун

Следующий компонент КШМ – шатун. Он предназначен для связки поршня ЦПГ и коленчатого вала и передает механических действий между ними.

Шатун представляет собой шток двутавровой формы поперечного сечения, что обеспечивает детали высокую устойчивость на изгиб. На концах штока имеются головки, благодаря которым шатун соединяется с поршнем и коленчатым валом.

По сути, головки шатуна представляют собой проушины, через которые проходят валы обеспечивающие шарнирное (подвижное) соединение всех деталей. В месте соединения шатуна с поршнем, в качестве вала выступает поршневой палец (относится к ЦПГ), который проходит через бобышки поршня и головку шатуна. Поскольку поршневой палец извлекается, то верхняя головка шатуна – неразъемная.

В месте соединения шатуна с коленвалом, в качестве вала выступают шатунные шейки последнего. Нижняя головка имеет разъемную конструкцию, что и позволяет закреплять шатун на коленчатом валу (снимаемая часть называется крышкой).

Коленчатый вал

Назначение коленчатого вала — это обеспечение второго этапа преобразования энергии. Коленвал превращает поступательное движение поршня в свое вращение. Этот элемент кривошипно-шатунного механизма имеет сложную геометрию.

Состоит коленвал из шеек – коротких цилиндрических валов, соединенных в единую конструкцию. В коленвале используется два типа шеек – коренные и шатунные. Первые расположены на одной оси, они являются опорными и предназначены для подвижного закрепления коленчатого вала в блоке цилиндров.

В блоке цилиндров коленчатый вал фиксируется специальными крышками. Для снижения трения в местах соединения коренных шеек с блоком цилиндров и шатунных с шатуном, используются подшипники трения.

Шатунные шейки расположены на определенном боковом удалении от коренных и к ним нижней головкой крепится шатун.

Коренные и шатунные шейки между собой соединяются щеками. В коленчатых валах дизелей к щекам дополнительно крепятся противовесы, предназначенные для снижения колебательных движений вала.

Шатунные шейки вместе с щеками образуют так называемый кривошип, имеющий П-образную форму, который и преобразует поступательного движения во вращение коленчатого вала. За счет удаленного расположения шатунных шеек при вращении вала они движутся по кругу, а коренные — вращаются относительно своей оси.

Количество шатунных шеек соответствует количеству цилиндров мотора, коренных же всегда на одну больше, что обеспечивает каждому кривошипу две опорных точки.

На одном из концов коленчатого вала имеется фланец для крепления маховика – массивного элемента в виде диска. Основное его назначение: накапливание кинетической энергии за счет которой осуществляется обратная работа механизма – преобразование вращения в движение поршня. На втором конце вала расположены посадочные места под шестерни привода других систем и механизмов, а также отверстие для фиксации шкива привода навесного оборудования мотора.

Принцип работы механизма

Принцип работы кривошипно-шатунного механизма рассмотрим упрощенно на примере одноцилиндрового мотора. Такой двигатель включает в себя:

• коленчатый вал с двумя коренными шейками и одним кривошипом;
• шатун;
• и комплект деталей ЦПГ, включающий в себя гильзу, поршень, поршневые кольца и палец.

Воспламенение горючей смеси выполняется когда объем камеры сгорания минимальный, а обеспечивается это при максимальном поднятии вверх поршня внутри гильзы (верхняя мертвая точка – ВМТ). При таком положении кривошип тоже «смотрит» вверх. При сгорании выделяемая энергия толкает вниз поршень, это движение передается через шатун на кривошип, и он начинает двигаться по кругу вниз, при этом коренные шейки вращаются вокруг своей оси.

При провороте кривошипа на 180 градусов поршень достигает нижней мертвой точки (НМТ). После ее достижения  выполняется обратная работа механизма. За счет накопленной кинетической энергии маховик продолжает вращать коленвал, поэтому чему кривошип проворачивается и посредством шатуна толкает поршень вверх. Затем цикл полностью повторяется.

Если рассмотреть проще, то один полуоборот коленвала осуществляется за счет выделенной при сгорании энергии, а второй – благодаря кинетической энергии, накопленной маховиком. Затем процесс повторяется вновь.

Ещё кое-что полезное для Вас:

Особенности работы двигателя. Такты

Выше описана упрощенная схема работы КШМ. В действительности чтобы создать необходимые условия для нормального сгорания топливной смеси, требуется выполнение подготовительных этапов – заполнение камеры сгорания компонентами смеси, их сжатие и отвод продуктов горения. Эти этапы получили название «такты мотора» и всего их четыре – впуск, сжатие, рабочий ход, выпуск. Из них только рабочий ход выполняет полезную функцию (именно при нем энергия преобразуется в движение), а остальные такты – подготовительные. При этом выполнение каждого этапа сопровождается проворотом коленвала вокруг оси на 180 градусов.

Конструкторами разработано два типа двигателей – 2-х и 4-тактный. В первом варианте такты совмещены (рабочий ход с выпуском, а впуск – со сжатием), поэтому в таких моторах полный рабочий цикл выполняется за один полный оборот коленвала.

В 4-тактном двигателе каждый такт выполняется по отдельности, поэтому в таких моторах полный рабочий цикл выполняется за два оборота коленчатого вала, и только один полуоборот (на такте «рабочий ход») выполняется за счет выделенной при горении энергии, а остальные 1,5 оборота – благодаря энергии маховика.

Основные неисправности и обслуживание КШМ

Несмотря на то, что кривошипно-шатунный механизм работает в жестких условиях, эта составляющая двигателя  достаточно надежная. При правильном проведении технического обслуживания, механизм работает долгий срок.

При правильной эксплуатации двигателя ремонт кривошипно-шатунный механизма потребуется только из-за износа ряда составных деталей – поршневых колец, шеек коленчатого вала, подшипников скольжения.

Поломки составных компонентов КШМ происходят в основном из-за нарушения правил эксплуатации силовой установки (постоянная работа на повышенных оборотах, чрезмерные нагрузки), невыполнения ТО, использования неподходящих горюче-смазочных материалов. Последствиями такого использования мотора могут быть:

• залегание и разрушение колец;
• прогорание поршня;
• трещины стенок гильзы цилиндра;
• изгиб шатуна;
• разрыв коленчатого вала;
• «наматывание» подшипников скольжения на шейки.

Такие поломки КШМ очень серьезны, зачастую поврежденные элементы ремонту не подлежат их нужно только менять. В некоторых случаях поломки КШМ сопровождаются разрушениями иных элементов мотора, что приводит мотор в полную негодность без возможности восстановления.

Чтобы кривошипно-шатунный механизм двигателя не стал причиной выхода из строя мотора, достаточно выполнять ряд правил:

1. Не допускать длительной работы двигателя на повышенных оборотах и под большой нагрузкой.
2. Своевременно менять моторное масло и использовать смазку, рекомендованную автопроизводителем.
3. Использовать только качественное топливо.
4. Проводить согласно регламенту замену воздушных фильтров.

Не стоит забывать, что нормальное функционирование мотора зависит не только от КШМ, но и от  смазки, охлаждения, питания, зажигания, ГРМ, которым также требуется своевременное обслуживание.

Назначение и общее устройство кривошипно-шатунного механизма Камаз 4310

Категория:

   Устройство эксплуатация камаз 4310

Публикация:

   Назначение и общее устройство кривошипно-шатунного механизма Камаз 4310

Читать далее:

Назначение и общее устройство кривошипно-шатунного механизма Камаз 4310

Кривошипно-шатунный механизм (К.ШМ) является основным механизмом поршневого двигателя. Он предназначен для осуществления рабочего процесса внутри цилиндровой полости и преобразования возвратно-поступательного движения поршней во вращательное движение коленчатого вала. Двигатели КамАЗ имеют центральный кривошипно-шатунный механизм, выполненный по У-образной схеме с последовательным расположением шатунов на шатунных шейках коленчатого вала.

Детали кривошипно-шатунного механизма работают в чрезвычайно тяжелых условиях. Как показывает анализ работы двигателей, до 40% всех отказов приходится на КШМ. Кроме того, отказы деталей этого механизма часто приводят к аварийным последствиям, выз-ывая повреждение сопряженных узлов, а восстановление их работоспособности сопровождается значительными трудозатратами, так как требует практически полной разборки и сборки двигателя.

Кривошипно-шатунный механизм состоит из неподвижных и подвижных деталей.

Рекламные предложения на основе ваших интересов:

К неподвижным деталям относятся блок цилиндров, гильзы цилиндров, головки цилиндров, передняя крышка (корпус гидромуфты), картер маховика, поддон картера, детали крепления и элементы уплотнения.

К подвижным деталям относятся восемь поршневых групп (поршень, поршневые кольца, поршневой палец), шатуны, коленчатый вал и маховик.

Рекламные предложения:

Читать далее: Неподвижные детали кривошипно-шатунного механизма Камаз 4310

Категория: — Устройство эксплуатация камаз 4310

Главная → Справочник → Статьи → Форум

Кривошипно-шатунный механизм: устройство, детали, принцип работы

Практически в любом поршневом двигателе, установленном в автомобиле, тракторе, мотоблоке, используется кривошипно- шатунный механизм. Стоят они и компрессорах для производства сжатого воздуха. Энергию расширяющихся газов, продуктов сгорания очередной порции рабочей смеси, кривошипный механизм преобразует во вращение рабочего вала, передаваемое на колеса, гусеницы или привод мотокосы. В компрессоре происходит обратное явление: энергия вращения приводного вала преобразуется в потенциальную энергию сжимаемого в рабочей камере воздуха или другого газа.

Устройство механизма

Первые кривошипные устройства были изобретены в античном мире. На древнеримских лесопилках вращательное движение водяного колеса, вращаемого речным течением, преобразовывалось в возвратно-поступательной движение полотна пилы. В античности большого распространения такие устройства не получили по следующим причинам:

• деревянные части быстро изнашивались и требовали частого ремонта или замены;
• рабский труд обходился дешевле высоких для того времени технологий.

В упрощенном виде кривошипно-шатунный механизм использовался с XVI века в деревенских прялках. Движение педали преобразовывалось во вращение прядильного колеса и других частей приспособления.

Разработанные в XVIII веке паровые машины тоже использовали кривошипный механизм. Он располагался на ведущем колесе паровоза. Давление пара на поршневое дно преобразовывалось в возвратно- поступательное движение штока, соединенного с шатуном, шарнирно закрепленном на ведущем колесе. Шатун придавал колесу вращение. Такое устройство кривошипно-шатунного механизма было основой механического транспорта до первой трети XX века.

Паровозная схема была улучшена в крейцкопфных моторах. Поршень в них жестко прикреплен к крейцкопфу- штоку, скользящему в направляющих взад и вперед. На конце штока закреплен шарнир, к нему присоединен шатун. Такая схема увеличивает размах рабочих движений, позволяет даже сделать вторую камеру с другой стороны от поршня. Таким образом каждое движение штока сопровождается рабочим тактом. Такая кинематика и динамика кривошипно-шатунного механизма позволяет при тех же габаритах удвоить мощность. Крейцкопфы применяются в крупных стационарных и корабельных дизельных установках.

Элементы, составляющие кривошипно-шатунный механизм, разбивают на следующие типы:

• Подвижные.
• Неподвижные.

К первым относятся:

• поршень;
• кольца;
• пальцы;
• шатун;
• маховик;
• коленвал;
• подшипники скольжения коленчатого вала.

К неподвижным деталям кривошипно-шатунного механизма относят:

• блок цилиндров;
• гильза;
• головка блока;
• кронштейны;
• картер;
• другие второстепенные элементы.

Поршни, пальцы и кольца объединяют в поршневую группу.

Каждый элемент, равно как и подробная кинематическая схема и принцип работы заслуживают более подробного рассмотрения

Блок цилиндров

Это одна из самых сложных по конфигурации деталь двигателя. На схематическом объемном чертеже видно, что внутри он пронизан двумя непересекающимися системами каналов для подачи масла к точкам смазки и циркуляции охлаждающей жидкости. Он отливается из чугуна или сплавов легких металлов, содержит в себе места для запрессовки гильз цилиндра, кронштейны для подшипников коленвала, пространство для маховика, систем смазки и охлаждения. К блоку подходят патрубки системы подачи топливной смеси и удаления отработанных газов.

Снизу к блоку через герметичную прокладку крепится масляный картер- резервуар для смазки. В этом картере и происходит основная работа кривошипно- шатунного механизма, сокращенно КШМ.

Гильза должна выдерживать высокое давление в цилиндре. Его создают газы, образовавшиеся после сгорания топливной смеси. Поэтому и то место блока, куда гильзы запрессованы, должно выдерживать большие механические и термические нагрузки.

Гильзы обычно изготавливают из прочных сортов стали, реже — из чугуна. В ходе работы двигателя они изнашиваются при капитальном ремонте двигателя могут быть заменены. Различают две основных схемы их размещения:

• сухая, внешняя сторона гильзы отдает тепло материалу блока цилиндров;
• влажная, гильза омывается снаружи охлаждающей жидкостью.

Второй вариант позволяет развивать большую мощность и переносить пиковые нагрузки.

Поршни

Деталь представляет из себя стальную или алюминиевую отливку в виде перевернутого стакана. Скользя по стенкам цилиндра, он принимает на себя давление сгоревшей топливной смеси и превращает его в линейное движение. Далее через кривошипный узел она превращается во вращение коленчатого вала, а затем передается на сцепление и коробку передач и через кардан к колесам. Силы, действующие в кривошипно-шатунном механизме, приводят транспортное средство или стационарный механизм в движение.

Деталь выполняет следующие функции:

• на такте впуска, двигаясь вниз (или в направлении от коленчатого вала, если цилиндр расположен не вертикально) на, он увеличивает объем рабочей камеры и создает в ней разрежение, затягивающее и равномерно распределяющее по объему очередную порцию рабочей смеси;
• на такте сжатия поршневая группа движется вверх, сжимая рабочую смесь до необходимой степени;
• далее идет рабочий такт, деталь под давлением идет вниз, передавая импульс вращения коленчатому валу;
• на такте выпуска он снова идет вверх, вытесняя отработанные газы в выхлопную систему.

На всех тактах, кроме рабочего, поршневая группа движется за счет коленчатого вала, забирая часть энергии его вращения. На одноцилиндровых двигателях для аккумуляции такой энергии служим массивный маховик, на многоцилиндровые такты цилиндров сдвинуты во времени.

Конструктивно изделие подразделяется на такие части, как:

• днище, воспринимающее давление газов;
• уплотнение с канавками для поршневых колец;
• юбка, в которой закреплен палец.

Палец служит осью, на которой закреплено верхнее плечо шатуна.

Поршневые кольца

Назначение и устройство поршневых колец обуславливается их ролью в работе кривошипных- устройств. Кольца выполняются плоскими, они имеют разрез шириной в несколько десятых частей миллиметра. Их вставляют в проточенные для них кольцевые углубления на уплотнении.

Кольца выполняют следующие функции:

• Уплотняют зазор между гильзой и стенками поршня.
• Обеспечивают направление движения поршня.
• Охлаждают. Касаясь гильзы, компрессионные кольца отводят избыточное тепло от поршня, оберегая его от перегрева.
• Изолируют рабочую камеру от смазочных материалов в картере. С одной стороны, кольца задерживают капельки масла, разбрызгиваемые в картере ударами противовесов щек коленвала, с другой, пропускают небольшое его количество для смазки стенок цилиндра. За это отвечает нижнее, маслосъемное кольцо.

Смазывать необходимо и соединение поршня с шатуном.

Отсутствие смазки в течение нескольких минут приводит детали цилиндра в негодность. Трущиеся части перегреваются и начинают разрушаться либо заклиниваются. Ремонт в этом случае предстоит сложный и дорогостоящий.

Поршневые пальцы

Осуществляют кинематическую связь поршня и шатуна. Изделие закреплено в поршневой юбке и служит осью подшипника скольжения. Детали выдерживают высокие динамические нагрузки во время рабочего хода, а также смены такта и обращения направления движения. Вытачивают их из высоколегированных термостойких сплавов.

Различают следующие типы конструкции пальцев:

• Фиксированные. Неподвижно крепятся в юбке, вращается только обойма верхней части шатуна.
• Плавающие. Могут проворачиваться в своих креплениях.

Плавающая конструкция применяется в современных моторах, она снижает удельные нагрузки на компоненты кривошипно- шатунной  группы и увеличивает их ресурс.

Шатун

Эта ответственный элемент кривошипно-шатунного механизма двигателя выполнен разборным, для того, чтобы можно было менять вкладыши подшипников в его обоймах. Подшипники скольжения используются на низкооборотных двигателях, на высокооборотных устанавливают более дорогие подшипники качения.

Внешним видом шатун напоминает накидной ключ. Для повышения прочности и снижения массы поперечное сечение сделано в виде двутавровой балки.

При работе деталь испытывает попеременно нагрузки продольного сжатия и растяжения. Для изготовления используют отливки из легированной или высокоуглеродистой стали.

Коленчатый вал

Преобразование осуществляет с помощь.

Из деталей кривошипно-шатунной группы коленчатый вал имеет наиболее сложную пространственную форму. Несколько коленчатых сочленений выносят оси вращения его сегментов в сторону от основной продольной оси. К этим вынесенным осям крепятся нижние обоймы шатунов. Физический смысл конструкции точно такой же, как и при закреплении оси шатуна на краю маховика. В коленвала «лишняя», неиспользуемая часть маховика изымается и заменяется противовесом. Это позволяет существенно сократить массу и габариты изделия, повысить максимально доступные обороты.

Основные части, из которых состоит коленвал, следующие:

• Шейки. Служат для крепления вала в кронштейнах картера и шатунов на валу. Первые называют коренными, вторые — шатунными.
• Щеки. Образуют колена, давшие узлу свое название. Вращаясь вокруг продольной оси и толкаемые шатунами, преобразуют энергию продольного движения поршневой группы во вращательную энергию коленвала.
• Фронтальная выходная часть. На ней размещен шкив, от которого цепным или ременным приводом крутятся валы вспомогательных систем мотора- охлаждения, смазки, распределительного механизма, генератора.
• Основная выходная часть. Передает энергию трансмиссии и далее — колесам.

Тыльная часть щек, выступающая за ось вращения коленвала, служит противовесом для основной их части и шатунных шеек. Это позволяет динамически уравновесит вращающуюся с большой скоростью конструкцию, избежав разрушительных вибраций во время работы.

Для изготовления коленвалов используются отливки из легких высокопрочных чугунов либо горячие штамповки (поковки) из упрочненных сортов стали.

Картер двигателя

Служит конструктивной основой всего двигателя, к нему крепятся все остальные детали. От него отходят внешние кронштейны, на них весь агрегат прикреплен к кузову. К картеру крепится трансмиссия, передающая от двигателя к колесам крутящий момент. В современных конструкциях картер исполняется единой деталью с блоком цилиндров. В его пространственных рамках и происходит основная работа узлов, механизмов и деталей мотора. Снизу к картеру крепится поддон для хранения масла для смазки подвижных частей.

Принцип работы кривошипно-шатунного механизма

Принцип работы кривошипно — шатунного механизма не изменился за последние три столетия.

Во время рабочего такта воспламенившаяся в конце такта сжатия рабочая смесь быстро сгорает, продукты сгорания расширяются и толкают поршень вниз. Он толкает шатун, тот упирается в нижнюю ось, разнесенную в пространстве с основной продольной осью.  В результате под действием приложенных по касательной сил коленвал проворачивается на четверть оборота в четырехтактных двигателях и на пол-оборота в двухтактных. таким образом продольное движение поршня преобразуется во вращение вала.

Расчет кривошипно-шатунного механизма требует отличных знаний прикладной механики, кинематики, сопротивления материалов. Его поручают самым опытным инженерам.

Неисправности, возникающие при работе КШМ и их причины

Сбои в работе могут случиться в разных элементах кривошипно-шатунной группы. Сложность конструкции и сочетания параметров шатунных механизмов двигателей заставляет особенно внимательно относить к их расчету, изготовлению и эксплуатации.

Наиболее часто к неполадкам приводит несоблюдение режимов работы и технического обслуживания мотора. Некачественная смазка, засорение каналов подачи масла, несвоевременная замена или пополнение запаса масла в картере до установленного уровня- все эти причины приводят к повышенному трению, перегреву деталей, появлению на их рабочих поверхностях задиров, потертостей и царапин. При каждой замене масла обязательно следует менять масляный фильтр. В соответствии с регламентом обслуживания также нужно менять топливные и воздушные фильтры.

Нарушение работы системы охлаждения также вызывает термические деформации деталей вплоть до их заклинивания или разрушения. Особенно чувствительны к качеству смазки дизельные моторы.

Неполадки в системе зажигания также могут привести к появлению нагара на поршне и п\его кольцах Закоксовывание колец вызывает снижение компрессии и повреждение стенок цилиндра.

Бывает также, что причиной поломки становятся некачественные либо поддельные детали или материалы, примененные при техническом обслуживании. Лучше приобретать их у официальных дилеров или в проверенных магазинах, заботящихся о своей репутации.

Перечень неисправностей КШМ

Наиболее распространенными поломками механизма являются:

• износ и разрушение шатунных и коренных шеек коленвала;
• стачивание, выкрашивание или плавление вкладышей подшипников скольжения;
• загрязнение нагаром сгорания поршневых колец;
• перегрев и поломка колец;
• скопление нагара на поршневом днище приводит к его перегреву и возможному разрушению;
• длительная эксплуатация двигателя с детонационными эффектами вызывает прогорание днища поршня.

Сочетание этих неисправностей со сбоем в системе смазки может вызвать перекос поршней в цилиндрах и заклинивание двигателя. Устранение всех этих поломок связано демонтажом двигателя и его частичной или полной разборкой.

Ремонт занимает много времени и обходится недешево, поэтому лучше выявлять сбои в работе на ранних стадиях и своевременно устранять неполадки.

Признаки наличия неисправностей в работе КШМ

Для своевременного выявления сбоев и начинающих развиваться негативных процессов в кривошипно- шатунной группе полезно знать из внешних признаков:

• Стуки в двигателе, непривычные звуки при разгоне.  Звенящие звуки часто бывают вызваны детонационными явлениями. Неполное сгорание топлива во время рабочего такта и взрывообразное его сгорание на такте выпуска приводят к скоплению нагара на кольцах и днище поршня, к ухудшению условий их охлаждения и разрушению. Необходимо залить качественное топливо и проверит параметры работы системы зажигания на стенде.
• Глухие стуки говорят об износе шеек коленвала. В этом случае следует прекратить эксплуатацию, отшлифовать шейки и заменить вкладыши на более толстые из ремонтного комплекта.
• «Поющий» на высокой звонко ноте звук указывает на возможное начало плавления вкладышей или на нехватку масла при повышении оборотов. Также нужно срочно ехать в сервис.
• Сизые клубы дыма из выхлопного патрубка свидетельствуют о избытке масла в рабочей камере. Следует проверить состояние колец и при необходимости заменить их.
• Падение мощности также может вызываться закоксовыванием колец и снижением компрессии.

При обнаружении этих тревожных симптомов не стоит откладывать визит в сервисный центр. Заклиненный двигатель обойдется намного дороже, и по деньгам, и по затратам времени.

Обслуживание КШМ

Чтобы не повредить детали КШМ, нужно соблюдать все требования изготовителя по периодическому обслуживанию и регулярному осмотру автомобиля.

Уровень масла, особенно на не новом автомобиле, следует проверять ежедневно перед выездом. Занимает это меньше минуты, а может сэкономить месяцы ожидания при серьезной поломке.

Топливо нужно заливать только с проверенных АЗС известных брендов, не прельщаясь двухрублевой разницей в цене.

При обнаружении перечисленных выше тревожных симптомов нужно незамедлительно ехать на СТО.

Не стоит самостоятельно, по роликам из Сети, пытаться растачивать цилиндры, снимать нагар с колец и выполнять другие сложные ремонтные работы. Если у вас нет многолетнего опыта такой работы- лучше обратиться к профессионалам. Самостоятельная установка шатунного механизма после ремонта- весьма сложная операция.

Применять различные патентованные средства «для преобразования нагара на стенках цилиндров», «для раскоксовывания» разумно лишь тогда, когда вы точно уверены и в диагнозе, и в лекарстве.

Устройство кривошипно-шатунного механизма

Основной задачей двигателей внутреннего сгорания, использующиеся на всевозможной технике, является преобразование энергии, которая выделяется при сжигании определенных веществ, в случае с ДВС – это топливо на основе нефтепродуктов или спиртов и воздуха, необходимого для горения.

Преобразование энергии производится в механическое действие – вращение вала. Далее уже это вращение передается дальше, для выполнения полезного действия.

Однако реализация всего этого процесса не такая уж и простая. Нужно организовать правильно преобразование выделяемой энергии, обеспечить подачу топлива в камеры, где производиться сжигание топливной смеси для выделения энергии, отвод продуктов горения. И это не считая того, что тепло, выделяемое при сгорании нужно куда-то отводить, нужно убрать трение между подвижными элементами. В общем, процесс преобразования энергии сложен.

Поэтому ДВС – устройство довольно сложное, состоящее из значительного количества механизмов, выполняющих определенные функции. Что же касается преобразования энергии, то выполняет его механизм, называющийся кривошипно-шатунным. В целом, все остальные составные части силовой установки лишь обеспечивают условия для преобразования и обеспечивают максимально возможный выход КПД.

Принцип действия кривошипно-шатунного механизма

Основная же задача лежит на этом механизме, ведь он преобразовывает возвратно-поступательное перемещение поршня во вращение коленчатого вала, того вала, от движения которого и производится полезное действие.

Устройство КШМ

Чтобы было более понятно, в двигателе есть цилиндро-поршневая группа, состоящая из гильз и поршней. Сверху гильза закрыта головкой, а внутри ее помещен поршень. Закрытая полость гильзы и является пространством, где производится сгорание топливной смеси.

При сгорании объем горючей смеси значительно возрастает, а поскольку стенки гильзы и головка являются неподвижными, то увеличение объема воздействует на единственный подвижный элемент этой схемы – поршень. То есть поршень воспринимает на себя давление газов, выделенных при сгорании, и от этого смещается вниз. Это и является первой ступенью преобразования – сгорание привело к движению поршня, то есть химический процесс перешел в механический.

И вот далее уже в действие вступает кривошипно-шатунный механизм. Поршень связан с кривошипом вала посредством шатуна. Данное соединение является жестким, но подвижным. Сам поршень закреплен на шатуне посредством пальца, что позволяет легко шатуну менять положение относительно поршня.

Шатун же своей нижней частью охватывает шейку кривошипа, которая имеет цилиндрическую форму. Это позволяет менять угол между поршнем и шатуном, а также шатуном и кривошипом вала, но при этом смещаться шатун вбок не может. Относительно поршня он только меняет угол, а на шейке кривошипа он вращается.

Поскольку соединение жесткое, то расстояние между шейкой кривошипа и самим поршнем не изменяется. Но кривошип имеет П-образную форму, поэтому относительно оси коленвала, на которой размещен этот кривошип, расстояние между поршнем и самим валом меняется.

За счет применения кривошипов и удалось организовать преобразование перемещения поршня во вращение вала.

Но это схема взаимодействия только цилиндро-поршневой группы с кривошипно-шатунным механизмом.

На деле же все значительно сложнее, ведь имеются взаимодействия между элементами этих составляющих, причем механические, а это значит, что в местах контакта этих элементов будет возникать трение, которое нужно по максимуму снизить. Также следует учитывать, что один кривошип неспособен взаимодействовать с большим количеством шатунов, а ведь двигатели создаются и с большим количеством цилиндров – до 16. При этом нужно же и обеспечить передачу вращательного движения дальше. Поэтому рассмотрим, из чего состоит цилиндро-поршневая группа (ЦПГ) и кривошипно-шатунный механизм (КШМ).

Начнем с ЦПГ. Основными в ней являются гильзы и поршни. Сюда же входят и кольца с пальцами.

Гильза

Съёмная гильза

Гильзы существуют двух типов – сделанные непосредственно в блоке и являющиеся их частью, и съемные. Что касается выполненных в блоке, то представляют они собой цилиндрические углубления в нем нужной высоты и диаметра.

Съемные же имеют тоже цилиндрическую форму, но с торцов они открыты. Зачастую для надежной посадки в свое посадочное место в блоке, в верхней части ее имеется небольшой отлив, обеспечивающий это. В нижней же части для плотности используются резиновые кольца, установленные в проточные канавки на гильзе.

Внутренняя поверхность гильзы называется зеркалом, потому что она имеет высокую степень обработки, чтобы обеспечить минимально возможное трение между поршнем и зеркалом.

В двухтактных двигателях в гильзе проделываются на определенном уровне несколько отверстий, которые называются окнами. В классической схеме ДВС используется три окна – для впуска, выпуска и перепуска топливной смеси и отработанных продуктов. В оппозитных же установках типа ОРОС, которые тоже являются двухтактными, надобности в перепускном окне нет.

Поршень

Поршень принимает на себя энергию, выделяемую при сгорании, и за счет своего перемещения преобразовывает ее в механическое действие. Состоит он из днища, юбки и бобышек для установки пальца.

Устройство поршня

Именно днищем поршень и воспринимает энергию. Поверхность днища в бензиновых моторах изначально была ровной, позже на ней стали делать углубления для клапанов, предотвращающих столкновение последних с поршнями.

В дизельных же моторах, где смесеобразование происходит непосредственно в цилиндре, и составляющие смеси туда подаются по отдельности, в днищах поршня выполнена камера сгорания – углубления особой формы, обеспечивающие более лучшее смешивание компонентов смеси.

Отличие дизельного двигателя от бензинового

В инжекторных бензиновых двигателях тоже стали применять камеры сгорания, поскольку в них тоже составные части смеси подаются по отдельности.

Юбка является лишь его направляющей в гильзе. При этом нижняя часть ее имеет особую форму, чтобы исключить возможность соприкосновения юбки с шатуном.

Чтобы исключить просачивание продуктов горения в подпоршневое пространство используются поршневые кольца. Они подразделяются на компрессионные и маслосъемные.

В задачу компрессионных входит исключение появления зазора между поршнем и зеркалом, тем самым сохраняется давление в надпоршневом пространстве, которое тоже участвует в процессе.

Если бы компрессионных колец не было, трение между разными металлами, из которых изготавливаются поршень и гильза было бы очень высоким, при этом износ поршня происходил бы очень быстро.

В двухтактных двигателях маслосъемные кольца не применяются, поскольку смазка зеркала производиться маслом, которое добавляется в топливо.

В четырехтактных смазка производится отдельной системой, поэтому чтобы исключить перерасход масла используются маслосъемные кольца, снимающие излишки его с зеркала, и сбрасывая в поддон. Все кольца размещаются в канавках, проделанных в поршне.

Бобышки – отверстия в поршне, куда вставляется палец. Имеют отливы с внутренней части поршня для увеличения жесткости конструкции.

Палец представляет собой трубку значительной толщины с высокоточной обработкой внешней поверхности. Часто, чтобы палец не вышел за пределы поршня во время работы и не повредил зеркало гильзы, он стопориться кольцами, размещающимися в канавках, проделанных в бобышках.

Это конструкция ЦПГ. Теперь рассмотрим устройство кривошипно-шатунного механизма.

Шатун

Итак, состоит он из шатуна, коленчатого вала, посадочных мест этого вала в блоке и крышек крепления, вкладышей, втулки, полуколец.

Шатун – это стержень с отверстием в верхней части под поршневой палец. Нижняя часть его сделана в виде полукольца, которым он садится на шейку кривошипа, вокруг шейки он фиксируется крышкой, внутренняя поверхность ее тоже выполнена в виде полукольца, вместе с шатуном они и формируют жесткое, но подвижное соединение с шейкой – шатун может вращаться вокруг ее. Соединяется шатун со своей крышкой посредством болтовых соединений.

Чтобы снизить трение между пальцем и отверстием шатуна применяется медная или латунная втулка.

По всей длине внутри шатун имеет отверстие, через которое масло подается для смазки соединения шатуна и пальца.

Коленчатый вал

Перейдем к коленчатому валу. Он имеет достаточно сложную форму. Осью его выступают коренные шейки, посредством которых он соединен с блоком цилиндров. Для обеспечения жесткого соединения, но опять же подвижного, в блоке посадочные места вала выполнены в виде полуколец, второй частью этих полуколец выступают крышки, которыми вал поджимается к блоку. Крышки к с блоком соединены болтами.

Коленвал 4-х цилиндрового двигателя

Коренные шейки вала соединены с щеками, которые являются одной из составных частей кривошипа. В верхней части этих щек располагается шатунная шейка.

Количество коренных и шатунных шеек зависит от количества цилиндров, а также их компоновки. В рядных и V-образных двигателях на вал передаются очень большие нагрузки, поэтому должно быть обеспечено крепление вала к блоку, способное правильно распределять эту нагрузку.

Для этого на один кривошип вала должно приходиться две коренные шейки. Но поскольку кривошип размещен между двух шеек, то одна из них будет играть роль опорной и для другого кривошипа. Из этого следует, что у рядного 4-цилиндрового двигателя на валу имеется 4 кривошипа и 5 коренных шеек.

У V-образных двигателей ситуация несколько иная. В них цилиндры расположены в два ряда под определенным углом. Поэтому один кривошип взаимодействует с двумя шатунами. Поэтому у 8-цилиндрового двигателя используется только 4 кривошипа, и опять же 5 коренных шеек.

Уменьшение трения между шатунами и шейками, а также блоком с коренными шейками достигается благодаря использованию вкладышей – подшипников трения, которые помещаются между шейкой и шатуном или блоком с крышкой.

Смазка шеек вала производится под давлением. Для подачи масла применяются каналы, проделанные в шатунных и коренных шейках, их крышках, а также вкладышах.

В процессе работы возникают силы, которые пытаются сместить коленчатый вал в продольном направлении. Чтобы исключить это используются опорные полукольца.

В дизельных двигателях для компенсации нагрузок используются противовесы, которые прикрепляются к щекам кривошипов.

Маховик

С одной из сторон вала сделан фланец, к которому прикрепляется маховик, выполняющий несколько функций одновременно. Именно от маховика передается вращение. Он имеет значительный вес и габариты, что облегчает вращение коленчатому валу после того, как маховик раскрутится. Чтобы запустить двигатель нужно создать значительное усилие, поэтому по окружности на маховик нанесены зубья, которые называются венцом маховика. Посредством этого венца стартер раскручивает коленчатый вал при запуске силовой установки. Именно к маховику присоединяются механизмы, которые и используют вращение вала на выполнение полезного действия. У автомобиля это трансмиссия, обеспечивающая передачу вращения на колёса.

Чтобы исключить осевые биения, коленчатый вал и маховик должны быть хорошо отбалансированы.

Другой конец коленчатого вала, противоположный фланцу маховика используется зачастую для привода остальных механизмом и систем мотора: к примеру, там может размещаться шестерня привода масляного насоса, посадочное место для приводного шкива.

Это основная схема коленчатого вала. Особо нового пока ничего не придумано. Все новые разработки направлены пока только на снижение потерь мощности в результате трения между элементами ЦПГ и КШМ.

Также стараются снизить нагрузку на коленчатый вал путем изменения углов положения кривошипов относительно друг друга, но особо значительных результатов пока нет.

«Назначение, устройство и принцип работы кривошипно-шатунного механизма»

ТЕМА:

«Назначение, устройство и принцип работы кривошипно-шатунного механизма»

ПМ.01 Техническое обслуживание и ремонт автотранспорта

Дисциплина: Устройство, техническое обслуживание и ремонт автомобилей

Тема урока: Назначение, устройство и работа кривошипно-шатунного механиз­ма. 2 часа

Тип урока: изучения новых знаний

Цель урока (по стандарту): К концу занятия обучающиеся должны:

Знать

— устройство и конструктивные особенности обслуживаемых КШМ;

— назначение и взаимодействие основных узлов КШМ;

Уметь

— анализировать работу КШМ, оценивая взаимодействие соответствующих деталей и узлов.

ОБЩИЕ КОМПЕТЕНЦИИ

Понимать сущность и социальную значимость своей будущей профессии, проявлять к ней устойчивый интерес.

Организовывать собственную деятельность, исходя из цели и способов ее достижения, определенных руководителем.

Анализировать рабочую ситуацию, осуществлять текущий и итоговый контроль, оценку и коррекцию собственной деятельности нести ответственность за результаты своей работы.

Осуществлять поиск информации, необходимой для эффективного выполнения профессиональных задач.

Использовать информационно-коммуникационные технологии в профессиональной деятельности.

Работать в коллективе и команде, эффективно общаться с коллегами, руководством, клиентами.

Дидактическая цель (деятельностный подход):

К концу учебного занятия обучающийся будет уметь анализировать работу КШМ оценивая взаимодействие узлов и деталей.

Материально-дидактическое обеспечение :

1. Макет одноцилиндрового двигателя, разрез двигателя ЗМЗ-53.

Узлы деталей в натуральную величину.

2. Информационные листы.

3. Задания.

4. Оценочные листы

5. Литература:

Кузнецов А.С. Устройство и работа двигателя внутреннего сгорания.М.: Академия, 2010

Сайт «Устройство автомобиля». Форма доступа: www.automan.ru

Электронное пособие КШМ В.Е Пигарев. 2011г.

Структурно – логическая схема урока:.

Этапы занятия	Время этапа	Познавательная деятельность студентов на этапе	Методические особенности и краткие указания по проведению этапов занятия	примечания
1.Организационный этап	5	kα0	Проверить готовность обучающихся к уроку
2.Постановка цели урока	5	kα1	Мотивировать обучающихся на познавательную деятельность, в процессе демонстрации работы действующего макета одноцилиндрового двигателя и разрез двигателя ЗМЗ-53, и привлечь их к совместному целеполаганию, с помощью вопроса: «Что нужно знать, чтобы обслужить кривошипно-шатунный механизм?».Обсудить варианты ответов.	Демонстрация узлов и деталей КШМ При помощи макета и разреза
3.Изучение нового материала	5	kα1-2	Раздать информационные листы и сопровождающие материалы
3.1.Назначение и устройство КШМ	15	kα1	Организовать индивидуальную самостоятельную работу обучающихся с информационными листами	ИЛ№1,2,3
3.1.1.Поршневая группа 3.1.2. Шатун 3.1.3. Коленчатый вал	20	kα2	Предложить выполнить задания. Сверить ответы с эталонами ответов.	Задания к ИЛ1,2,3 Эталоны ответов
4. Принцип работы КШМ	5	kα1	Показать видеоролик принципа работы КШМ	Демонстрация на экране
5.Закрепление изученного материала	10	kα1		Группы по 5 человек
5.1. Устройство КШМ	10	kα2	Организовать работу в малых группах. Выдать конкретизированные задания для групповой работы.	задания для групповой работы (1-3)
6. Анализ характерных ошибок	10	kα2	Выдать эталоны решения задач с критериями оценки, самооценка обучающихся с результатами работы на уроке. Организовать общегрупповое обсуждение. В процессе обсуждения, выяснять причины характерных ошибок и совместно с преподавателем находить правильные решения.	Листы эталонов, бланк самооценки
7.Задание на дом	5	kα1	Выдать задания на дом, обсудить.

Технологическая карта (Ход урока)

Информационный лист №1

Поршень относится к числу наиболее ответственных и напряженных деталей двигателя, выполняет следующие функции:

• обеспечивает требуемую форму камеры сгорания и герметичность внутрицилиндрового пространства;

• передает силу давления газов на шатун и стенку цилиндра;

• управляет открытием и закрытием окон в двухтактных двигателях со щелевой схемой газообмена;

• воспринимает механические нагрузки от давления газов и силы инерции, а также высокие тепловые нагрузки.

Дополнительно поршень нагревается от трения о стенки цилиндра.

По конструкции поршень представляет форму стакана.

На наружной поверхности цилиндрической части поршня имеются канавки для поршневых колец,

служащих для уплотнения цилиндра от прорыва газов и попадания смазки из картера в камеру сгорания.

Верхнюю часть поршня называют головкой,

а направляющая (тронковая) часть — юбка.

В тронке расположены бобышки, в которых имеется отверстие для поршневого пальца.

Задание №1 к информационному листу №1

Обозначьте с помощью цифр детали поршня, используя рисунок №1

Детали поршня	цифра
маслосъемные кольца-
компрессионные кольца
юбка поршня
головка поршня
поршневой палец
стопорное кольцо
бобышки

Рис 1. Конструкция поршня

Эталон к заданию №1 ИЛ-1

Детали поршня	цифра
маслосъемные кольца-	2
компрессионные кольца	1
юбка поршня	7
головка поршня	6
поршневой палец	5
стопорное кольцо	4
бобышки	3

Рис 1. Конструкция поршня

Критерии оценки:

Максимальное количество -10 баллов.

1 ошибка — 5 баллов

2 ошибки — 3 балла

3 ошибки — 1 балл

Более 3 ошибок 0 баллов

Задание №2 ИЛ-1

дополните схему используя следующие названия деталей

маслосъемные кольца

компрессионные кольца

поршневой палец

стопорное кольцо

бобышки

Эталон к заданию №2 ИЛ-1

Критерии оценки:

Максимальное количество -10 баллов.

1 ошибка — 5 баллов

2 ошибки — 3 балла

3 ошибки — 1 балл

Более 3 ошибок 0 баллов

Информационный лист №2

Шатун связывает колено вала с поршнем.

При работе шатун совершает сложное качательное движение и подвергается переменной по величине и направлению нагрузке от давления газов и сил инерции.

Материалом для шатунов обычно служит углеродистая или легированная сталь.

Шатуны изготавливают большей частью ковкой в штампах с последующей механической и термической обработкой.

Требования к качеству шатунной группы

Задание №1 ИЛ-2

Заполните схему используя следующие названия деталей

• втулка верхней головки

• крышка нижней головки шатуна

• вкладыши

• болты, гайки, шайбы

• стержень шатуна

эталон к заданию №1 ИЛ-2

Критерии оценки:

Максимальное количество -10 баллов.

1 ошибка — 5 баллов

2 ошибки — 3 балла

3 ошибки — 1 балл

Более 3 ошибок 0 баллов

Задание №2 ИЛ-2

Обозначьте с помощью цифр детали поршня, используя рисунок №2

Детали шатуна	цифра
Стержень шатуна-
Стопорные шайбы
Гайки
Болты
Втулка верхней головки шатуна
Крышка шатуна
Подшипники нижней головки шатуна

Рис. 2 шатун

эталон к заданию №2 ИЛ-2

Детали шатуна	цифра
Стержень шатуна-	3
Стопорные шайбы	6
Гайки	4
Болты	5
Втулка верхней головки шатуна	1
Крышка шатуна	7
Подшипники нижней головки шатуна (вкладыши)	2

Критерии оценки:

Максимальное количество -10 баллов.

1 ошибка — 5 баллов

2 ошибки — 3 балла

3 ошибки — 1 балл

Более 3 ошибок 0 баллов

Информационный лист №3

Коленчатый вал относится к числу наиболее ответственных, напряженных и дорогостоящих деталей двигателя. Вал воспринимает периодические нагрузки от давления газов и сил инерции возвратно-поступательного движущихся и вращающихся частей, поэтому он подвергается изгибающим и скручивающим усилиям. Коренные и шатунные шейки его должны быть изготовлены с высокой степенью точности, а поверхности шеек достаточно твердыми и обработаны с высокой степенью чистоты.

Соединительные фланцы отдельных частей вала скрепляют болтами и шпильками.

Большая часть валов для уравновешивания центробежных сил снабжаются противовесами.

Коленчатый вал имеет коренные и шатунные шейки, охватываемые нижними головками шатунов, а также щеки (колена), связывающие шатунные шейки с коренными.

Задание №1 ИЛ-3

Обозначьте с помощью цифр детали коленчатого вала, используя рисунок №3

Детали коленчатого вала	цифра
Коренные шейки
противовесы
фланец
Коленчатый вал
колена
Шатунные шейки

Рис. 3. Коленчатый вал

Эталон к Заданию №1 ИЛ-3

Обозначьте с помощью цифр детали коленчатого вала, используя рисунок №3

Детали коленчатого вала	цифра
Коренные шейки	1
противовесы	4
фланец	6
Коленчатый вал	5
колена	3
Шатунные шейки	2

Критерии оценки:

Максимальное количество -10 баллов.

1 ошибка — 5 баллов

2 ошибки — 3 балла

3 ошибки — 1 балл

Более 3 ошибок 0 баллов Рис. 3. Коленчатый вал

Показ видеоролика принципа работы кривошипно-шатунного механизма

Задание для работы в малой группе

Вам как будущим автомеханикам необходимо уметь ремонтировать детали КШМ вплоть до их восстановления. Определите какие из предложенных ниже деталей (рис. а) относятся:

		Проставить номера деталей согласно рисунку
Группа 1	К поршню	№
Группа 2	К шатуну	№
Группа 3	К коленчатому валу	№

Рис 4. Детали КШМ

Эталон правильных ответов задания в малых группах

		Критерии оценок в малых группах
группа №1. Поршень	1. Юбка поршня 2. бобышка 3. стопорные кольца 4. головка поршня 5. днище поршня 6. канавки 7. палец 8. компрессионные кольца 9. маслосъемные кольца	Максимальное количество -10 баллов. 1, 2 ошибки -7 баллов 3-5 ошибок — 5 баллов 6 ошибок 1 балл Более 6 ошибок – 0 баллов
Группа №2. Шатун	10. нижняя крышка шатуна 11. вкладыши 12. втулка верхней головки 13. болты и гайки крышки шатуна 14. верхняя головка шатуна 15. шатун	Максимальное количество -10 баллов. 1, 2 ошибки -5 баллов 3 ошибки — 1 балл Более 3 ошибок – 0 баллов
Группа №3. Коленчатый вал.	16. коленчатый вал 17. коренные вкладыши 18. противовесы 19. фланец	Максимальное количество -10 баллов. 1 ошибка -5 баллов 2 ошибки — 1 балл Более 2 ошибок– 0 баллов

Оценочный лист

ФИО	Баллы за задания						Малая группа		Сумма баллов		Перевод баллов в отметку
	№1	№2	№3	№4	№5

Критерии перевода баллов в оценки:

Максимальный балл — 60

Отметка:

5(отлично) от 50-60 баллов.

4 (хорошо) от 40-50 баллов.

3( удовлетворительно) от 30-40 баллов.

Менее 30 баллов учебный материал не усвоен.

Tank Encyclopedia, первый онлайн-музей танков

Мариса Белхоте / 26 июля 2021 г.

Стэн Лучиан / 25 июля 2021 г.

Стэн Лучиан / 25 июля 2021 г.

Автор: MarkoPantelic / 24 июля 2021 г.

Германия (1939 г.) Средний танк — 96 штук. После завершения первых четырех серий Panzer III, он был реализован…

Прочитайте больше

• Французские прототипы времен холодной войны

Мариса Белхоте / 23 июля 2021 г.

Франция (1945 г.) Проектирование истребителя танков — не построено Освобождение Франции началось в июне 1944 г. и в основном длилось …

Прочитайте больше

Автор: Артуро Джусти / 21 июля 2021 г.

Королевство Италия, 1942-1945, средний танк — 167 штук Carro Armato M15 / 42 был последним вариантом итальянского…

Прочитайте больше

Автор: Артуро Джусти / 17 июля 2021 г.

Германия 1943-1945, Легкая самоходка — 194 захвачено и произведено Semovente L40 da 47/32 был итальянским …

Прочитайте больше

---

Энциклопедия танков ®: Место назначения для энтузиастов танков уже десять лет. 7 000 000 посетителей, 1300+ страниц

Если вас интересует история в целом и война в частности, Энциклопедия танков — это место, где можно найти ВСЕ бронированные машины, которые когда-либо бродили по полю боя, от H.«Сухопутные линкоры» Дж. Уэллса и новейшие основные боевые танки, наши статьи охватывают все эпохи развития бронетехники и охватывают широкий спектр конструкций бронетранспортеров, от мостовиков и инженерных машин до истребителей танков и десантников. Вы также можете найти статьи о «мягкой» технике, противотанковом вооружении, тактике, сражениях и технологиях. Десять лет ботанической одержимости гусеницами. Энциклопедия танков продолжает оставаться в стадии разработки, и именно здесь вы, читатель, можете помочь.Если вы заметили, что чего-то не хватает, добавьте это в наш список публичных предложений . И, пожалуйста, поддержите нас!

Четыре эпохи, которые мы освещаем:

Первая мировая война: грязь, колючая проволока и окопы Великобритания и Франция начали разработку танков, чтобы прорвать позиции противника. Они были предназначены для выхода на нейтральную полосу, но танк быстро превратился в машину для убийства, используемую в общевойсковых операциях.

Вторая мировая война: испытательный полигон для ведения бронетанковой войны: Впервые большое количество танков и бронетехники будут сражаться друг с другом.От джунглей атоллов Тихого океана до засушливой пустыни Ливии, ледяных и ветреных степей Советского Союза и дождливого бокса Нормандии.

Холодная война: Восток против Запада: Две противоположные сверхдержавы привели к расколу мира на Восток и Запад. США и СССР вместе со своими собственными альянсами создали новое поколение бронетехники, извлекая уроки из многочисленных прокси-войн.

Современная эра: актуальны ли танки ?: Несмотря на многочисленные пророки, возвещающие о гибели танков, броня по-прежнему является важной ветвью вооруженных сил мира.Нет никаких признаков того, что это скоро изменится, поскольку разработка танков продолжает адаптироваться к современным условиям боя.

Белки, содержащие Sh4-домен, функционируют на разных этапах образования везикул, покрытых клатрином.

1

Шмид, С. Л., МакНивен, М. А., Де Камилли, П. Динамин и его партнеры: отчет о ходе работы. Curr. Opin. Cell Biol. 10 , 504–512 (1998).

CAS Статья Google Scholar

2

Север, С., Muhlberg, A. B. & Schmid, S. L. Нарушение домена GAP динамина стимулирует рецептор-опосредованный эндоцитоз. Nature 398 , 481–486 (1999).

CAS Статья Google Scholar

3

Дэвид К., Макферсон П. С., Мундигл О. и де Камилли П. А. Роль амфифизина в эндоцитозе синаптических везикул, предполагаемая его связыванием с динамином в нервных окончаниях. Proc.Natl Acad. Sci. USA 93 , 331–335 (1996).

CAS Статья Google Scholar

4

Leprince, C. et al. Новый член семейства амфифизинов, связывающий эндоцитоз и пути передачи сигнала. J. Biol. Chem. 272 , 15101–15105 (1997).

CAS Статья Google Scholar

5

Рамджаун, А. Р., Мичева, К. Д., Бушле, И., Макферсон, П. С.Идентификация и характеристика изоформы амфифизина, обогащенной нервными окончаниями. J. Biol. Chem. 272 , 16700–16706 (1997).

CAS Статья Google Scholar

6

de Heuvel, E. et al. Идентификация основных синаптоянин-связывающих белков в головном мозге. J. Biol.Chem. 272 , 8710–8716 (1997).

CAS Статья Google Scholar

7

Рингстад, Н., Nemoto, Y. & De Camilli, P. Семейство белков Sh4p4 / Sh4p8 / Sh4p13: партнеры по связыванию синаптоянина и динамина через Grb2-подобный домен с гомологией 3 Src. Proc.Natl Acad. Sci. USA 94 , 8569–8574 (1997).

CAS Статья Google Scholar

8

Роос, Дж. И Келли, Р. Б. Dap160, нейро-специфическая гомология eps15 и белок, содержащий несколько доменов Sh4, который взаимодействует с динамином Drosophila . J. Biol.Chem. 273 , 19108–19119 (1998).

CAS Статья Google Scholar

9

Yamabhai, M. et al. Интерсектин, новый адаптерный белок с двумя доменами гомологии eps15 и пятью доменами гомологии src3. J. Biol. Chem. 273 , 31401–31407 (1998).

CAS Статья Google Scholar

10

Зенгер, А.S., Wang, W., Bishay, J., Cohen, S. & Egan, S. E. Белки Ese с доменами EH и Sh4 регулируют эндоцитоз, связываясь с динамином и Eps15. EMBO J. 18 , 1159–1171 (1999).

Артикул Google Scholar

11

Qualmann, B., Roos, J., DiGregorio, P. J. и Kelly, R. B. Syndapin I, синаптический динамин-связывающий белок, который связывается с нейронным белком синдрома Вискотта-Олдрича. Мол. Биол.Ячейка 10 , 501–513 (1999).

CAS Статья Google Scholar

12

Подагра, I. et al. Динамин GTPase связывается и активируется подмножеством доменов Sh4. Cell 75 , 25–36 (1993).

CAS Статья Google Scholar

13

McPherson, P. S. et al. Пресинаптическая инозитол-5-фосфатаза. Nature 379 , 353–357 (1996).

CAS Статья Google Scholar

14

McPherson, P. S. et al. Взаимодействие Grb2 через его гомологичные 3 домена Src с синаптическими белками, включая синапсин I. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91 , 6486–6490 (1994).

CAS Статья Google Scholar

15

Парик, П.И МакМахон, Х. Т. Семейство белков амфифизина и их роль в эндоцитозе в синапсе. Trends Neurosci. 21 339–344 (1998).

CAS Статья Google Scholar

16

Шупляков О. и др. Эндоцитоз синаптических везикул, нарушенный из-за нарушения взаимодействий динамин-Sh4-домен. Science 276 , 259–263 (1997).

CAS Статья Google Scholar

17

Парик, П., Vallis, Y. & McMahon, H.T. Ингибирование рецептор-опосредованного эндоцитоза с помощью домена Sh4 амфифизина. Curr. Биол. 7 , 554–560 (1997).

CAS Статья Google Scholar

18

Di Fiore, P. P., Pelicci, P. G. & Sorkin, A. EH: новый домен белок-белкового взаимодействия, потенциально участвующий во внутриклеточной сортировке. Trends Biochem. Sci. 22 , 411–413 (1997).

CAS Статья Google Scholar

19

Хуссейн, Н.K. et al. Сплайсинговые варианты интерсектина являются компонентами эндоцитарного аппарата нейронов и ненейрональных клеток. J. Biol. Chem. 274 , 15671–15677 (1999).

CAS Статья Google Scholar

20

Mahaffey, D. T., Moore, M. S., Brodsky, F. M. и Anderson, R. G. W. Белки оболочки, выделенные из везикул, покрытых клатрином, могут собираться в покрытые ямки. J. Cell Biol. 108 , 1615–1624 (1989).

CAS Статья Google Scholar

21

Лин, Х. К., Мур, М. С., Санан, Д. А. и Андерсон, Р. Г. У. Восстановление ямок, покрытых клатрином, отрастающих от плазматических мембран. J. Cell Biol. 114 , 881–891 (1991).

CAS Статья Google Scholar

22

Gilbert, A., Paccaud, J. P. и Carpentier, J. L. Прямое измерение образования везикул, покрытых клатрином, с использованием бесклеточного анализа. J. Cell Sci. 110 , 3105–3115 (1997).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

23

Schmid, S. L. & Smythe, E. Стадийные анализы образования покрытых ямок и отпочкования покрытых пузырьков invitro . J. Cell Biol. 114 , 869–880 (1991).

CAS Статья Google Scholar

24

Смайт, Э., Картер Л. и Шмид С. Л. Цитозоль- и клатрин-зависимая стимуляция эндоцитоза invitro очищенными адаптерами. J. Cell Biol. 119 , 1163–1171 (1992).

CAS Статья Google Scholar

25

Schmid, S. L. Формирование пузырьков, покрытых клатрином, и сортировка белков: интегрированный процесс. Annu. Rev. Biochem. 66 , 511–548 (1997).

CAS Статья Google Scholar

26

Орчи, Л. et al. Почкование из мембран Гольджи требует комплекса покрытий из неклатриновых белков оболочки. Nature 362 , 648–652 (1993).

CAS Статья Google Scholar

27

Barlowe, C. et al. COPII: мембранная оболочка, образованная белками Sec, которые управляют отрастанием везикул из эндоплазматического ретикулума. Cell 77 , 895–907 (1994).

CAS Статья Google Scholar

28

Damke, H., Баба, Т., Варнок, Д. Э. и Шмид, С. Л. Индукция мутантного динамина специфически блокирует образование везикул, покрытых эндоцитозом. J. Cell Biol. 127 , 915–934 (1994).

CAS Статья Google Scholar

29

Oh, P., McIntosh, D. P. & Schnitzer, J. E. Динамин в шейке кавеол опосредует их отрастание с образованием транспортных пузырьков за счет GTP-управляемого деления плазматической мембраны эндотелия. J. Cell Biol. 141 , 101–114 (1998).

CAS Статья Google Scholar

30

Ostermann, J. et al. Пошаговая сборка функционально активных транспортных пузырьков. Cell 75 , 1015–1025 (1993).

CAS Статья Google Scholar

31

Rowe, T. et al. Везикулы COPII, происходящие из микросом эндоплазматического ретикулума (ER) млекопитающих, рекрутируют COP1. J.Cell Biol. 135 , 895–911 (1996).

CAS Статья Google Scholar

32

Йост, М., Симпсон, Ф., Кавран, Дж. М., Леммон, М. А. и Шмид, С. Л. Фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат необходим для образования везикул, покрытых эндоцитозом. Curr. Биол. 8 , 1399–1402 (1998).

CAS Статья Google Scholar

33

Акирилоаи, М., Барылко, Б. и Албенези, Дж. П. Существенная роль домена гомологии плекстрина динамина в рецептор-опосредованном эндоцитозе. Мол. Cell Biol. 19 , 1410–1415 (1999).

CAS Статья Google Scholar

34

Ли А., Франк Д. В., Маркс М. С. и Леммон М. А. Доминантно-отрицательное ингибирование рецептор-опосредованного эндоцитоза мутантом динамина-1 с дефектным доменом гомологии плекстрина. Curr.Биол. 9 , 261–264 (1999).

Артикул Google Scholar

35

Валлис, Ю., Вигге, П., Маркс, Б., Эванс, П. Р. и МакМэхон, Х. Т. Важность домена гомологии плекстрина динамина в клатрин-опосредованном эндоцитозе. Curr. Биол. 9 , 257–260 (1999).

CAS Статья Google Scholar

36

Картер Л.L., Redelmeier, T. E., Woolenweber, L. A. и Schmid, S. L. Множественные GTP-связывающие белки участвуют в эндоцитозе, опосредованном везикулами, покрытыми клатрином. J. Cell Biol. 120 , 37–45 (1993).

CAS Статья Google Scholar

37

Мичева, К. Д., Кей, Б. К. и Макферсон, П. С. Синаптоянин образует два отдельных комплекса в нервном окончании. Взаимодействие с эндофилином и амфифизином. Дж.Биол. Chem. 272 , 27239–27245 (1997).

CAS Статья Google Scholar

38

Ван З. и Моран М. Ф. Потребность в адапторном белке GRB2 при эндоцитозе рецептора EGF. Наука 272 , 1935–1939 (1996).

CAS Статья Google Scholar

39

Спаркс, А. Б. и др. Отчетливые предпочтения лигандов для Src гомологии 3 доменов из Src, Yes, Abl, Cortactin, p53bp2, PLCg, Crk и Grb2. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93 , 1540–1544 (1996).

CAS Статья Google Scholar

40

Робинсон, П. Дж. и др. Dynamin GTPase регулируется фосфорилированием протеинкиназы C в нервных окончаниях. Nature 365 , 163–166 (1993).

CAS Статья Google Scholar

41

Ламаз, К., Баба, Т., Редельмайер, Т. Э. и Шмид, С. Л. Рекрутирование рецепторов эпидермального фактора роста и рецепторов трансферрина в покрытые ямки in vitro : различные биохимические требования. Мол. Биол. Ячейка 3 , 1181–1194 (1993).

Google Scholar

42

Schmid, S. L. и Carter, L. L. АТФ необходим для рецептор-опосредованного эндоцитоза в интактных клетках. J.Cell Biol. 111 , 2307–2318 (1990).

CAS Статья Google Scholar

43

Heuser, J. E. & Reese, T. S. Доказательства рециклинга мембраны синаптических пузырьков во время высвобождения медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки. J. Cell Biol. 57 , 315–344 (1973).

CAS Статья Google Scholar

44

Estes, P. S. et al. Движение динамина внутри отдельных синаптических бутонов Drosophila относительно маркеров, специфичных для компартмента. J. Neurosci. 16 , 5443–5456 (1996).

CAS Статья Google Scholar

45

Гайдаров И., Сантини Ф., Уоррен Р. А. и Кин Дж. Х. Пространственный контроль динамики покрытых ямок в живых клетках. Nature Cell Biol. 1 , 1–7 (1999).

CAS Статья Google Scholar

46

Мичева, К. Д., Рамджаун, А.Р., Кей, Б. К. и Макферсон, П. С. Зависимые от домена Sh4 взаимодействия эндофилина с амфифизином. FEBS Lett. 414 , 308–312 (1997).

CAS Статья Google Scholar

47

Warnock, D. E., Terlecky, L. J. и Schmid, S. L. Динамин GTPase стимулируется сшиванием через C-концевой домен, богатый пролином. EMBO J. 14 , 1322–1328 (1995).

CAS Статья Google Scholar

48

Харлоу, Э.& Lane, D. Антитела : лабораторное руководство (Публикации Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, 1988).

Google Scholar

49

Warnock, D. E., Baba, T. & Schmid, S. L. Повсеместно экспрессируемый динамин-II имеет более высокую внутреннюю активность GTPase и большую склонность к самосборке, чем нейроналдинамин-I. Мол. Биол. Ячейка 8 , 2553–2562 (1997).

CAS Статья Google Scholar

50

Мюльберг, А.Б., Варнок, Д. Э. и Шмид, С. Л. Структура домена и внутримолекулярная регуляция динаминовой ГТФазы. EMBO J. 16 , 6676–6683 (1997).

CAS Статья Google Scholar

Техническое описание DS1085 от Maxim Integrated

DS1085

10 из 21

КОМАНДНЫЙ НАБОР

Данные и управляющая информация считываются и записываются в DS1085 в формате, показанном на рисунке 3. Чтобы

записали в DS1085, ведущий выдает адрес ведомого DS1085, и бит чтения / записи устанавливается в 0.После получения

подтверждения мастер шины предоставляет командный протокол. После получения этого протокола

DS1085 выдает подтверждение, а затем мастер может отправлять данные на DS1085. Если DS1085 должен быть прочитан

, мастер должен отправить протокол команд, как и раньше, а затем выдать условие повторения START и

, а затем снова байт управления, на этот раз с битом R / W, установленным в 1, чтобы разрешить чтение. данных из

DS1085. Набор команд для DS1085 следующий:

Доступ к DAC [08h]

Если R / W равен 0, эта команда записывает в регистр DAC.После выдачи этой команды в регистр DAC записываются следующие значения байта данных

. Если R / W равен 1, следующие считанные байты данных — это значения, хранящиеся в регистре

DAC. Это 2-байтовая передача, первый байт содержит восемь старших битов, второй байт содержит

и

двух младших битов в наиболее значимых позициях байта данных. Остальные шесть бит игнорируются, и

может быть записано с любым значением (при чтении эти биты равны 0).

Доступ к смещению [0Eh]

Если R / W равен 0, эта команда записывается в регистр смещения.После подачи этой команды в регистр OFFSET записывается следующее значение байта данных

. Если R / W равен 1, следующим считанным байтом данных будет значение, сохраненное в регистре

OFFSET. Это однобайтовая передача, из которой используются только пять младших битов (последние пять бит). В оставшиеся три бита

можно записать любое значение для завершения байта данных (при чтении эти биты равны 1).

Доступ к DIV [01h]

Если R / W равен 0, эта команда записывает в регистр DIV.После выполнения этой команды в регистр DIV записываются значения следующего байта данных

. Если R / W равен 1, следующие считанные байты данных — это значения, хранящиеся в регистре

DIV. Этот регистр имеет 10-битное значение. Первыми отправляются восемь старших битов, за которыми следует второй байт

, который содержит два младших бита значения регистра в наиболее значимых позициях байта данных.

Остальные шесть битов игнорируются и могут иметь любое значение (при чтении эти биты равны 0).

Доступ к мультиплексору [02h]

Если R / W равно 0, эта команда записывает в регистр MUX. После подачи этой команды в регистр MUX записываются значения следующего байта данных

. Если R / W равен 1, следующие считанные байты данных — это значения, хранящиеся в регистре

MUX. Этот регистр имеет 10-битное значение. Первыми отправляются восемь старших битов, за которыми следует второй байт

, который содержит два младших бита значения регистра в наиболее значимых позициях байта данных.

Остальные шесть битов игнорируются и могут иметь любое значение (при чтении эти биты равны 0).

Access ADDR [0Dh]

Если R / W равен 0, эта команда записывает в регистр ADDR. После подачи этой команды в регистр ADDR записывается следующее значение байта данных

. Если R / W равен 1, следующим считанным байтом данных будет значение, сохраненное в регистре

ADDR. Это однобайтовая передача. Этот регистр имеет 5-битное значение, первые три бита записи

могут быть любым значением, за которым следуют пять активных битов (при чтении первые три бита равны 0).

Глоссарий / Национальная программа моделирования сейсмических опасностей / Землетрясения / Природные опасности и риски / Наша наука / Домашняя страница

A ∙ B ∙ C ∙ D ∙ E ∙ F ∙ G ∙ H ∙ I ∙ J ∙ K ∙ L ∙ M ∙ N ∙ O ∙ P ∙ Q ∙ R ∙ S ∙ T ∙ U ∙ V ∙ W ∙ X ∙ Y ∙ Z

Acceleration — Изменение скорости (скорости в определенном направлении) за одну единицу времени.Земля испытывает ускорение во время землетрясения, когда земля трясется.

Aleatory Uncertainty — Неопределенность, зависящая от случая, вызванная внутренней изменчивостью природы. Он используется в вероятностном анализе сейсмической опасности. (Подробнее: http://www.opensha.org/sites/opensha.org/files/PSHA_Primer_v2_0.pdf)

Модель фонового источника или распределенной сейсмичности — эта модель предназначена для учета разломов всех размеров, о которых мы не знаем, на поверхности и на глубине.Это многослойная (глубинная) сетка показателей сейсмичности, разработанная с использованием каталога землетрясений GeoNet. Это один из двух компонентов исходной модели NSHM, который в основном разрабатывается рабочей группой SRM.

Эффекты бассейна — Усиленное землетрясение в пределах геологического бассейна из-за его геометрии и наличия более мягких грунтов (т. Е. «Осадочного бассейна»). Обновление NSHM предполагает включение моделирования бассейнового усиления для региона Веллингтона.Бассейн Веллингтона является районом, вызывающим серьезную озабоченность после землетрясения в Кайкхура в 2016 году, однако эта проблема касается многих бассейнов по всей стране.

наверх <<

CSHM — C anterbury S eismic H azard M odel — региональная временная модель для района Большого Крайстчерча, разработанная после основных толчков продолжающегося землетрясения в Кентербери. CSHM зависит от времени, поскольку он учитывает снижение активности афтершоков с течением времени.

Дезагрегация / дезагрегация (дезагрегация / дезагрегация) — процесс разделения вкладов в результаты вероятностной сейсмической опасности по заданным критериям. Это сделано, чтобы помочь понять, какие источники землетрясений могут повлиять на них и которые важны для конкретного региона. Критерии могут быть комбинациями (т. Е. Магнитуды, расстояния, местоположения и типа тектонической области (т.е. активная мелкая кора, вулканическая, субдукционная поверхность, субдукционная плита).

Детерминированный анализ сейсмической опасности — Использование только одного значительного потенциального землетрясения для оценки сотрясения земли для конкретного места или региона.Он может включать или не включать неопределенность в расчет сотрясения грунта. Обычно это используется для дополнения вероятностного анализа сейсмической опасности.

Направленность — Изменчивость сотрясений землетрясения в зависимости от направления прорыва разлома. Движение грунта в направлении распространения разрыва (направление, в котором выделяется энергия землетрясения) более сильное, чем в других направлениях (см. Глоссарий по землетрясениям USGS; и https://earthquake.usgs.gov/data/rupture/directivity .php

наверх <<

Эпистемическая неопределенность — Неопределенность в наших знаниях о том, как происходят землетрясения и сотрясает землю. Время и дополнительное наблюдение могут уменьшить эти неопределенности. Он используется в вероятностном анализе сейсмической опасности. (Подробнее см .: Вероятностный анализ сейсмической опасности в региональном и национальном масштабе: современное состояние и будущие задачи; и http://www.opensha.org/sites/opensha.org/files/PSHA_Primer_v2_0.pdf;

GMM — Модель движения грунта — Математические / статистические модели, используемые для оценки количества сотрясений грунта на заданном участке или в заданной серии точек.Иногда также называется «отношением затухания». GMM, специфичные для Новой Зеландии, включают McVerry et al. (2006) и Брэдли (2013). Есть наборы других международных GMM из проектов NGA West-1, NGA West-2 и NGA Subduction. Рабочей группе GMCM поручено разработать и определить, какие GMM будут включены в NSHM.

GMCM — Модель характеристики движения грунта — Эта модель объединяет несколько методов оценки сотрясения грунта с использованием различных GMM и других факторов, таких как эффекты бассейна.

Движение земной поверхности — Движение земной поверхности, вызванное землетрясениями. Землетрясения создают сейсмические волны, которые проходят через поверхность земли и вдоль нее. (См. Глоссарий по землетрясениям USGS.)

наверх <<

Кривая опасности — Набор значений (обычно в виде кривой на графике), представляющих вероятности превышения (вертикальная ось) заданных значений ускорения (горизонтальная ось). Короче говоря, значения этой кривой представляют вероятность превышения определенного значения ускорения.Эти графики относятся к одному периоду спектра (т.е. PGA, 0,5, 1).

KSHM — Kaikōura S eismic H azard M odel. Региональная модель, зависящая от времени, была разработана для центральной части Новой Зеландии (т.е. северной / северо-восточной части Южного острова и нижней части Северного острова) после землетрясения Кайкура 2016 года. Эта модель включает значительные обновления модели источника разлома, включая источники зоны субдукции Хикуранги, и модели распределенной сейсмичности: оба компонента включают зависящие от времени скорости землетрясений, которые меняются во времени.KSHM также включает в себя набор моделей движения грунта (GMM), а не одну модель, как в NSHM 2010 года.

Новозеландский класс площадки — используется для передачи понимания почвенных условий на площадке и в настоящее время используется в строительных стандартах и ​​руководящих принципах Новой Зеландии (например, в стандарте Новой Зеландии 1170). Классы площадок варьируются от A до E и определяются рядом почвенных условий, включая, помимо прочего, скорости поперечных волн, измерение других геотехнических свойств и оценку периода площадки.Большинство сайтов в Новой Зеландии соответствуют классам сайтов B, C или D. Ниже приведены краткие описания классов сайтов:

— A: Strong Rock
— B: Rock
— C: Мелководный грунт
— D: Глубокий или мягкий грунт
— E: Очень мягкий грунт

New Zealand Strong Motion Database (NZSMD) — база данных записей сильного движения записан в Новой Зеландии. Эта база данных была создана GNS (Van Houtte et al., 2017), включая данные до 2016 года.Он обновляется как часть редакции NSHM.

NSHM — Национальная модель сейсмической опасности . Это официальная модель сейсмической опасности для Новой Зеландии, которая оценивает вероятность и силу землетрясений в Новой Зеландии.

NSHMP-haz — Кодекс Национального проекта по картированию сейсмической опасности (NSHMP) Геологической службы США для анализа сейсмической опасности. Платформа написана с использованием java и имеет открытый исходный код (свободно доступна и может быть разработана пользователями).

наверх <<

OpenQuake — комплексная программная платформа для расчета опасности и риска землетрясений, разработанная Фондом Global Earthquake Model Foundation. Платформа написана с использованием Python и имеет открытый исходный код (свободно доступен и может разрабатываться пользователями).

Period (T) — интервал времени, необходимый для одного полного цикла волны землетрясения. (См. Диаграмму в Глоссарии USGS Earthquake.)

PGA — P eak G round A cceleration.Наибольшее увеличение скорости, зарегистрированное при землетрясении частицей на земле, или которое можно ожидать на основании оценочного движения грунта в определенном месте (т.е.как показано в спектре для конкретного места). В PSHA PGA обычно отображается с нулевым спектральным периодом.

PSHA — P robabilistic S eismic H azard A анализ. Численный / аналитический подход к количественной оценке вероятности превышения различных уровней движения грунта на площадке с учетом всех возможных землетрясений.(Подробнее: http://www.opensha.org/sites/opensha.org/files/PSHA_Primer_v2_0.pdf)

Вероятность превышения (PoE, PE) — PoE для движения грунта обеспечивает вероятность того, что движение грунта будет превышено в интересующем временном окне. Это основной вывод PSHA.

наверх <<

Период возврата, интервал повторения и вероятность превышения

Период возврата и интервал повторения — это разные вещи. Период возврата используется для описания выходов PSHA. Интервал повторяемости используется для описания поведения землетрясений при конкретном разломе. Однако закономерность возникновения землетрясений — очень дискуссионная тема. Например, мы не обязательно моделируем отдельные землетрясения, которые происходят с регулярным интервалом, и поэтому использование периода повторяемости для сотрясения земли может вводить в заблуждение, и движение грунта с определенной вероятностью превышения (PoE) является правильным термином. Например, мы должны описывать колебания грунта с 10% вероятностью превышения за 50 лет, а не колебания грунта с периодом повторяемости 475 лет.

Модель уровня сейсмичности — Представления известных и неизвестных источников разломов для целей оценки опасности землетрясений. Эта модель дает оценки того, где происходят землетрясения, с какой скоростью они происходят и какими могут быть магнитуды. Он включает данные об известных неисправностях и оценки неизвестных неисправностей. Оба компонента ограничены несколькими источниками данных, включая геологию землетрясений и модель разломов сообщества, каталог землетрясений GeoNet и сеть GeoNet GNSS.Окончательная модель уровня сейсмичности состоит из многокомпонентных моделей, которые позволяют нам учесть эпистемическую неопределенность.

Spectrum / Spectra — кривая, показывающая амплитуду (в случае анализа опасности это будет ускорение) по оси y в зависимости от периода по оси x. Итак, общий спектр должен показывать количество тряски в каждом периоде (сколько есть тряски каждого типа). Это производится для горизонтальных движений земли. (См. Диаграмму в глоссарии USGS по землетрясениям.)

наверх <<

UHS — Единый спектр / спектры опасности, обычно называемые «спектром» или «спектрами».

Vs30 — Средняя скорость поперечной волны на глубину 30 метров. Часто используется отдельно или вместе с Z1.0 и / или Z2.5 для представления характеристик площадки в моделях движения грунта (GMM).

Z1.0 — Глубина, на которой скорость поперечной волны достигает 1 км / с (1000 м / с). Часто используется вместе с Vs30 для представления характеристик площадки в моделях движения грунта (GMM).

Z2.5 — Глубина, на которой скорость поперечной волны достигает 2,5 км / с (2500 м / с). Часто используется вместе с Vs30 для представления характеристик площадки в моделях движения грунта (GMM).

наверх <<

Командно-штабная машина БМП-1КШ технический паспорт характеристики разведывательные фотографии | Россия Легкий бронетранспортер Российской армии UK

Вооружение Для самозащиты БМП-1КШ вооружена ПК 7.62-мм пулемет. Машина всегда оснащалась одноместной башней, как стандартная БМП-1, но 76-мм пушка была удалена и заменена большей телескопической антенной HAWK EYE. Устройство и защита Компоновка БМП-1КШ очень похожа на российскую боевую машину пехоты БМП-1. Корпус БМП-1КШ выполнен из цельносварной стали, что обеспечивает защиту экипажа от огня стрелкового оружия и осколков снарядов.Экипаж состоит из трех солдат, водителя и двух радистов, которые сидят в передней части машины. В кормовой части боевого отделения предусмотрено место для четырех штабных офицеров. Силовая установка На БМП-1КШ установлен 6-цилиндровый рядный дизельный двигатель водяного охлаждения типа УТД-20 мощностью 300 л.с. при 2000 об / мин. Торсионная подвеска такая же, как и у стандартной БМП-1, которая состоит из шести опорных катков с резиновыми шинами с каждой стороны, ведущей звездочки спереди, натяжного ролика сзади и трех опорных катков.Первая и последняя опорные станции имеют гидравлический амортизатор, а верх гусеницы имеет покрытие из легкой листовой стали, которое обычно снимается при работе в снегу. Принадлежности БМП-1КШ оснащена радиостанциями Р-137, Р-140М или Р-145БМ, по четыре из пяти на каждой. Кроме того, на машине есть телефонное оборудование, телеграфная система связи, вентиляция, навигационная система TNA-3 и дизельный генератор, способный питать оборудование связи.Генератор установлен в верхней части корпуса. В задней части боевого отделения установлены небольшие антенны. БМП-1КШ является полностью амфибийной, движется по воде за счет гусениц. Технические характеристики К началу Вооружение 7.62-мм пулемет Страновые пользователи Россия и страны Востока Дизайнер Country Россия Принадлежности Радиостанция Р-137, Р-140М или Р-145БМ, Р-111, Р-124, электрогенератор, система телефонной и телеграфной связи.NBC, ночное видение, Экипаж 7 солдат Броня Защита от осколков стрелкового оружия и снарядов. Масса 13,00 кг Скорость 65 км / ч по дороге, 7 км / ч по воде Диапазон 550-600 км а а Размеры Длина, 6.73 м; Ширина 2,94 м; Высота 1,92 м

SNX18 — паралог SNX9, который действует как мембранный тубулятор в AP-1-положительном эндосомном переносе | Журнал клеточной науки

SNX9, SNX18 и SNX30 составляют отдельное подсемейство PX-BAR-содержащих белков сортировочного нексина (SNX).Мы показываем здесь, что большинство тканей экспрессируют все три паралога, а эксперименты по иммунопреципитации и иммунофлуоресценции продемонстрировали, что белки семейства SNX9 действуют в клетках как отдельные объекты. Их домены Sh4 проявляли высокую селективность к динамину 2, а единицы PX-BAR обладали способностью тубулировать мембраны при экспрессии в клетках HeLa. Как ранее описано для домена PX-BAR SNX9 (SNX9-PX-BAR), очищенный SNX18-PX-BAR вызывал тубуляцию липосом in vitro и имел предпочтительное связывание с PtdIns (4,5) P ₂ .Однако, в отличие от SNX9, который в первую очередь действует на клатрин-опосредованный эндоцитоз на плазматической мембране, эндогенный SNX18 локализован в AP-1- и PACS1-положительных эндосомных структурах, лишенных клатрина и устойчивых к брефельдину A. Более того, γ- Мотив узнавания адаптина был определен в области SNX18 низкой сложности, и комплекс эндогенных SNX18 и AP-1 мог быть иммунопреципитирован после обработки брефельдином A. Избыточная экспрессия SNX18 секвестрировала AP-1 из периферических эндосом и приводила к образованию коротких украшенных SNX18 трубок с отчетливыми динаминовыми точками.Результаты показывают, что члены семейства SNX9 образуют дискретные единицы разрыва мембраны вместе с динамином, и подтверждают, что SNX18 обеспечивает почкование носителей для AP-1-позитивного эндосомного транспорта.

Молекулярные механизмы, участвующие в эндосомной сортировке, в настоящее время привлекают много внимания, и они оказались более сложными, чем предполагалось ранее (Bonifacino and Rojas, 2006; Maxfield and McGraw, 2004). Для поддержки решений о сортировке, которые необходимо принимать, чтобы гарантировать, что различные грузы будут доставлены в соответствующие пункты назначения в соответствии с потребностями ячейки, требуется ряд различных факторов.Промежуточные продукты транспорта могут иметь форму круглых везикул или протяженных канальцев, а некоторые клетки демонстрируют сложную систему сетей эндоцитарных мембран, которые, как считается, участвуют в определенных событиях транспортировки. Динамические органеллы, обычно называемые ранними эндосомами, по-видимому, являются основными сортировочными станциями в системе и могут быть функционально разделены на сортирующие эндосомы и рециклирующие эндосомы. Интернализованный материал может либо возвращаться обратно в плазматическую мембрану одним из нескольких маршрутов, быть отсортирован в сеть транс-Гольджи (TGN), либо попадать в лизосомный путь, что приводит к деградации груза.

Мембрансвязывающие и -модулирующие белки важны для механики эндоцитарной системы. Классическими примерами являются белки везикулярной оболочки, такие как клатрин и его адаптерные белки (AP) (Edeling et al., 2006b; Robinson, 2004; Ungewickell and Hinrichsen, 2007). Клатрин действует как везикулярный стабилизирующий белок в нескольких местах клетки, и для формирования клатрин-зависимого носителя требуются мембраноспецифические AP для локализации, сборки оболочки, рекрутирования дополнительных белков и отбора груза.Существует четыре разных типа точек доступа, которые работают на разных сотовых узлах. Например, в то время как AP-2 в основном обнаруживается на плазматической мембране, участвующей в клатрин-зависимом эндоцитозе, AP-1 концентрируется в TGN, чтобы опосредовать клатрин-зависимый транспорт груза в эндосомную систему. AP-1 также обнаруживается на эндосомальных мембранах и, как предполагается, участвует в путях доставки грузов в TGN. Однако неясно, как одна и та же точка доступа может работать на путях трафика, которые идут в противоположных направлениях.Подобная схема, вероятно, потребует различных процедур для формирования перевозчика, чтобы дать уникальные идентификаторы промежуточных транспортных средств. Такие различия могут быть опосредованы специфическими дополнительными белками и мембрано-модулирующими белками. Преимущество использования одного и того же адаптера связывания груза для антероградного и ретроградного движения состоит в том, что могут быть созданы эффективные системы рециркуляции для белков, которые перемещаются между компартментами, таких как рецептор манноза 6-фосфата и фурин.

Белки, которые могут связывать и модулировать определенные мембранные зоны, играют важную роль в процессе образования везикулярных и канальцевых носителей.Примерами являются белки с фосфоинозитид-связывающими доменами PX (гомология phox) и PH (гомология плекстрина) (Di Paolo and De Camilli, 2006; Lemmon, 2003), а также белки с функцией изгиба мембран (Zimmerberg and Kozlov, 2006). Класс белков с последним свойством представляет собой недавно описанные белки BAR (Bin / Amphiphysin / Rvs) -домена (Gallop and McMahon, 2005). Домен BAR имеет серповидную структуру, образованную димеризацией, со способностью формировать мембрану в виде зачатков и канальцев.Эндоцитарная система, по-видимому, особенно богата белками PX-, PH- и BAR-доменов. Семейство PX-белков большого сортировочного нексина (SNX) (Seet and Hong, 2006; Worby and Dixon, 2002) состоит из более чем 30 членов у млекопитающих. Большинство SNX, по-видимому, функционируют на различных этапах эндоцитозного переноса. Некоторые члены семейства SNX, например SNX9, также содержат домены BAR. Этот формирующий мембрану белок PX-BAR выполняет свою основную функцию в клатрин-зависимом эндоцитозе на плазматической мембране, где через свой домен Sh4 он рекрутирует и активирует динамин GTPase для разрыва везикул (Lundmark and Carlsson, 2003; Lundmark and Carlsson, 2004; Пилипенко и др., 2007; Сулет и др., 2005; Ярар и др., 2008).

Геномы позвоночных экспрессируют два паралога SNX9, которые пока практически не изучены. Один из них, SNX18, был обнаружен при протеомном скрининге партнеров по взаимодействию с полипролиновыми областями Sos (Schulze and Mann, 2004) и лиганда Fas (Thornhill et al., 2007). Другой белок был обнаружен как ADAM15-связывающий Sh4-белок в анализе фагового дисплея и получил обозначение SNX30 с использованием последовательного номера в серии SNX (Karkkainen et al., 2006). В последующем обзоре (Seet and Hong, 2006) тому же белку, к сожалению, было присвоено имя SNX33, и обозначение этого белка (первоначально гипотетический белок MGC32065) в настоящее время перепутано в базах данных последовательностей. В данной статье мы будем называть этот белок SNX30.

SNX9, SNX18 и SNX30 представляют собой очевидное подсемейство белков SNX позвоночных, имеющих одинаковую доменную структуру (рис.1А). За доменом Sh4 на N-конце следует домен низкой сложности (LC) переменной длины, который в SNX9 содержит мотивы связывания клатрина (PWSAW) и AP-2 (DPW) (Lundmark and Carlsson, 2003). . Эти мотивы отсутствуют в SNX18 и SNX30, но присутствуют участки консервативной последовательности других видов, которые являются кандидатами в качестве сайтов специфичного для белка взаимодействия. Кристаллическая структура SNX9 (аминокислоты 214-595) (Пилипенко и др., 2007) показала, что область PX-BAR образует димеризованную супердоменную структуру, которая стабилизируется большими площадями контакта между субдоменами и дополнительным доменом, называемым Yoke (Y) домен.Последний домен разделен на N-концевую (Y _N ) и C-концевую (Y _C ) части. На уровне последовательности SNX18 и SNX30 сходны с SNX9 в этих областях и, вероятно, принимают ту же конформацию. Эксперименты по мембранным канальцам с усеченными вариантами домена PX-BAR SNX9 (SNX9-PX-BAR) показали, что короткая последовательность (аминокислоты 201-213, предположительно формирующая проникающую через мембрану амфипатическую спираль) непосредственно перед определенным кристаллом структура необходима для формирования мембран (Пилипенко и др., 2007). Аминокислотные свойства этого участка консервативны в SNX18 (аминокислоты 225–237) и SNX30 (аминокислоты 179–191), и поэтому эти последовательности, вероятно, выполняют ту же функцию. Сравнение первичных структур различных доменов (рис. 1B) показывает, что предки SNX18 и SNX30 сначала ответвлялись от SNX9, а затем дублировались.

Рис. 1.

Семейство белков SNX9.(A) Доменная организация SNX9, SNX18 и SNX30. Объяснение обозначений доменов см. В тексте. Цифры относятся к последней аминокислоте в каждом домене белков человека. (B) Попарные идентичности последовательностей различных доменов. Последовательности отдельных доменов были выровнены с ClustalW, допуская вставки промежутков по умолчанию. (C) Иммуноблоттинг экстрактов тканей мыши с антителами против трех паралогов и с антителами против амфифизина-1 (Amph2). В каждую дорожку загружали одинаковое количество белка.Относительная молекулярная масса соответствующего белка по сравнению со стандартами белка указана справа.

Рис. 1.

Семейство белков SNX9. (A) Доменная организация SNX9, SNX18 и SNX30. Объяснение обозначений доменов см. В тексте. Цифры относятся к последней аминокислоте в каждом домене белков человека. (B) Попарные идентичности последовательностей различных доменов. Последовательности отдельных доменов были выровнены с ClustalW, допуская вставки промежутков по умолчанию.(C) Иммуноблоттинг экстрактов тканей мыши с антителами против трех паралогов и с антителами против амфифизина-1 (Amph2). В каждую дорожку загружали одинаковое количество белка. Относительная молекулярная масса соответствующего белка по сравнению со стандартами белка указана справа.

Поскольку было показано, что SNX9 имеет важные функции для генерации везикулярных носителей, было интересно исследовать экспрессию и функцию двух паралогов, SNX18 и SNX30.Здесь мы описываем общие свойства SNX18 и SNX30 и сосредотачиваемся на субклеточной локализации и партнерах по взаимодействию SNX18.

Антитела были получены против рекомбинантных SNX18 и SNX30 и были использованы вместе с ранее описанными антителами против SNX9 (Lundmark and Carlsson, 2003) для иммуноблоттинга паралогов в различных тканях мыши (рис. 1C). Большинство тканей экспрессировали все три белка, но в разной степени.Наибольшее количество SNX9 было обнаружено в печени, легких, поджелудочной железе, селезенке и яичках, тогда как SNX18 был обнаружен в основном в сердце, почках, печени и легких, а SNX30 — в легких, поджелудочной железе и яичках. В мозге почти не было всех трех белков, вместо этого он экспрессировал большое количество родственного белка амфифизина 1.

Было обнаружено, что

клеток HeLa экспрессируют все три члена семейства, которые могут быть иммунопреципитированы отдельно из цитозоля (рис.2А). Иммунопреципитированные полосы были подвергнуты анализу MALDI-TOF (таблица S1 дополнительных материалов), и паралоги были идентифицированы, как указано. В базе данных нуклеотидов NCBI депонирована последовательность кДНК человеческого SNX18, которая имеет неродственный С-конец (номер доступа BC117218). Из полученных масс пептидов мы не обнаружили доказательств присутствия этой изоформы в клетках HeLa. Вместо этого мы могли подтвердить подлинность клона, из которого мы получили наш рекомбинантный белок (номер доступа BC060791), потому что один из полученных пептидов соответствовал последней части С-концевой α-спирали в BAR-домене.В настоящее время неясно, существует ли какой-либо из трех паралогов в виде изоформ на уровне белка. SNX18 (71 кДа) и SNX30 (65 кДа) мигрируют на SDS-PAGE, как и ожидалось из их теоретического M _r , тогда как SNX9 мигрирует ошибочно на M _r , превышающем его теоретический вес (74 против 67 кДа). ). Иммунопреципитаты, кроме того, содержали динамин (100 кДа) и альдолазу (41 кДа) (стрелки на фиг. 2A), как ранее сообщалось для цитозольного SNX9 (Lundmark and Carlsson, 2003; Lundmark and Carlsson, 2004), хотя количества, которые — осажденные SNX18 и SNX30 были ниже.Никакие другие специфические компоненты, которые совместно осаждались с соответствующими SNX, не могли быть идентифицированы в этом эксперименте.

белков BAR-домена образуют функциональную, деформирующую мембрану и / или стабилизирующую единицу путем димеризации. В некоторых случаях, таких как амфифизин 1 и амфифизин 2 (Wigge et al., 1997), а также SNX1 и SNX2 (Rojas et al., 2007), было высказано предположение, что домен BAR может формироваться посредством гетеродимеризации между родственными белками.Из экспериментов по иммунопреципитации в сочетании с масс-спектрометрией (рис. 2A) и иммуноблоттингом (вставка на рис. 2A) мы пришли к выводу, что члены семейства SNX9 не существуют в клетке как внутрисемейные гетеродимеры. Более того, иммунофлуоресцентный анализ клеток HeLa показал, что эндогенные SNX9 и SNX18 вместе с экзогенно экспрессируемым полноразмерным myc-tagged SNX30 локализованы по-разному (Fig. 2B). Все три белка присутствовали в небольших точечных структурах и коротких трубочках по всей цитоплазме, но очевидной совместной локализации обнаружить не удалось.Этот вывод свидетельствует в пользу разных функций трех членов семьи.

Рис. 2.

Характеристика белков SNX9, SNX18 и SNX30 в клетках. (A) Цитозоль клеток HeLa подвергали иммунопреципитации антисывороткой против трех паралогов и преиммунной сывороткой и анализировали с помощью SDS-PAGE. Гель окрашивали кумасси. Показаны полосы, соответствующие IgG и иммунопреципитированным SNX9, SNX18 и SNX30.Идентичность SNX18 и SNX30 определяли с помощью MALDI-TOF. Стрелки показывают положение динамина 2 (вверху) и альдолазы (внизу). На вставке ниже показан анализ иммуноблоттинга с соответствующими антителами к иммунопреципитатам из общего детергентного экстракта клеток HeLa. Обратите внимание, что отдельные паралоги не образуют комплексов с другими членами семьи. (B) Эпифлуоресцентная микрофотография клетки HeLa, трансфицированной myc-SNX30 и окрашенной мышиным анти-myc, кроличьим анти-SNX9 и куриным анти-SNX18. Масштабная линейка: 10 мкм.Увеличенные изображения не показывают перекрытия в локализации трех белков. (C) Мембранную фракцию клеток HeLa отделяли центрифугированием с равновесной плотностью, и собранные фракции анализировали на плотность (треугольники) и общее количество белка (кружки). Распределение указанных белков анализировали иммуноблоттингом.

Рис. 2.

Характеристика белков SNX9, SNX18 и SNX30 в клетках. (A) Цитозоль клеток HeLa подвергали иммунопреципитации антисывороткой против трех паралогов и преиммунной сывороткой и анализировали с помощью SDS-PAGE.Гель окрашивали кумасси. Показаны полосы, соответствующие IgG и иммунопреципитированным SNX9, SNX18 и SNX30. Идентичность SNX18 и SNX30 определяли с помощью MALDI-TOF. Стрелки показывают положение динамина 2 (вверху) и альдолазы (внизу). На вставке ниже показан анализ иммуноблоттинга с соответствующими антителами к иммунопреципитатам из общего детергентного экстракта клеток HeLa. Обратите внимание, что отдельные паралоги не образуют комплексов с другими членами семьи. (B) Эпифлуоресцентная микрофотография клетки HeLa, трансфицированной myc-SNX30 и окрашенной мышиным анти-myc, кроличьим анти-SNX9 и куриным анти-SNX18.Масштабная линейка: 10 мкм. Увеличенные изображения не показывают перекрытия в локализации трех белков. (C) Мембранную фракцию клеток HeLa отделяли центрифугированием с равновесной плотностью, и собранные фракции анализировали на плотность (треугольники) и общее количество белка (кружки). Распределение указанных белков анализировали иммуноблоттингом.

SNX9, как было описано ранее, распределяется между цитозольным и мембраносвязанным пулами в клетке (Lundmark and Carlsson, 2003), и было обнаружено, что это справедливо также для SNX18 и SNX30.Когда выделенная мембранная фракция из клеток HeLa была разделена по плотности, SNX18 и SNX30 были обнаружены на немного более легких мембранах, чем SNX9 (рис. 2C). SNX18-положительные мембраны были обнаружены с той же плотностью, что и эндосомные мембраны, которые отличались специфическим для эндосомы белком EEA1, но отсутствовали во фракциях, содержащих клатрин. Однако все три белка связаны в широкой области, в которой распределяется динамин 2.

Чтобы выяснить, является ли связывание с динамином 2 общей чертой в семействе белков SNX9, соответствующий домен Sh4 был очищен как GST-слитые белки и использован в анализах с цитозолем из клеток HeLa.Мы действительно могли идентифицировать динамин 2 как основной белок, взаимодействующий со всеми тремя доменами Sh4 (рис. 3А). Предпочтение связывания для богатого пролином домена (PRD) в динамине 2 было протестировано путем извлечения очищенного белка, содержащего последовательность дикого типа или белков с введенными мутациями, охватывающими все типы I (RXXPXXP) и тип II (PXXPXR) Sh4- связывающие мотивы в PRD (Mayer, 2001). На рис. 3В показано, что все три паралога напрямую взаимодействуют с PRD, а результаты, полученные с мутированным PRD, показали, что связывание нарушается при модификации мотивов типа I (рис.3Б, мутанты 3 и 4). Предпочтение связывания для мотивов типа I было недавно показано для SNX9 (Alto et al., 2007), и такой же способ связывания, по-видимому, применим также и для двух других белков. Это контрастирует с доменом Sh4 амфифизина 2 (Fig. 3B), который обнаруживает пониженное связывание с мутантами типа II 1, 2 и 4, в соответствии с более ранними исследованиями (Owen et al., 1998). Как описано ранее, SNX9 локализуется в динамин-позитивных пунктах в клетках (Lundmark and Carlsson, 2003). Сверхэкспрессия SNX9 привела к появлению множества таких структур, что согласуется с его ролью в активации динамина на шейке везикул, покрытых клатрином (рис.3В, панель А со вставками). В клетках, сверхэкспрессирующих SNX18, было обнаружено большое количество полукоротких трубок. Интересно, что при совместном окрашивании на динамин эти пробирки обычно начинались или заканчивались отдельными точками, содержащими динамин (рис. 3C, панель b со вставками). Сверхэкспрессия SNX30 приводила к менее очевидному фенотипу, который был промежуточным по сравнению с фенотипом, наблюдаемым для SNX9 и SNX18 (данные не показаны, см. Фиг. 2B). Эти контрастирующие эффекты, наблюдаемые при сверхэкспрессии разных членов семейства, вероятно, отражают различия в функциях, таких как способность активировать деление динамина.

Делеция Sh4-домена и LC-области в SNX9 приводит к белку с повышенной мембранно-тубулирующей активностью при сверхэкспрессии в клетках, как показано ранее (Pylypenko et al., 2007). Это явление связано с активностью формирующих мембрану PX- и BAR-доменов, в сочетании с неспособностью этого мутанта рекрутировать динамин и способствовать разделению мембранных трубок на везикулы. Когда мы проанализировали эффект аналогичных мутантов в SNX18 и SNX30, мы обнаружили, что эти белки также образуют обширные тубулярные сети в клетках (рис.4А). Мы смогли обнаружить неоднородное перекрытие между SNX9- и SNX18-положительными пробирками при совместной экспрессии, показывая, что эти белки собираются на изогнутых поверхностях аналогичного диаметра (дополнительный материал, рис. S1A). Чтобы выяснить, был ли PX-BAR домен SNX18 достаточным для индукции деформации мембраны in vitro, мы инкубировали очищенный белок вместе с липосомами, полученными из липидов мозга. При концентрации 20 мкМ SNX18-PX-BAR индуцировал обширные мембранные трубочки, в которых трубки часто запутывались, давая отпечаток « шерстяного шара » (рис.4Б). Трубки были аналогичны по диаметру (примерно 20 нм, вставка на рис. 4В) по сравнению с трубками, созданными SNX9 (Пилипенко и др., 2007). Пока нам не удалось произвести PX-BAR из SNX30 в форме, которая могла бы использоваться для таких экспериментов.

Липидный состав обычно имеет решающее значение для способности белков периферических мембран взаимодействовать с мембранами-мишенями. Домены PX связываются преимущественно с фосфорилированными фосфоинозитидами, тогда как домены BAR взаимодействуют с заряженными поверхностями мембран.Домены PX и BAR SNX9 составляют супердомен, который идеально адаптирован как для специфичности связывания с мембраной, так и для образования кривизны. Для дальнейшего исследования специфичности связывания SNX18 мы использовали очищенный белок PX-BAR в анализе совместной седиментации липосом вместе с липосомами, содержащими различные фосфоинозитиды. В этом анализе связывание с мембраной определяли по количеству белка, обнаруженного во фракции осадка. Интересно, что только фосфатидилинозитол (4,5) -бисфосфат [PtdIns (4,5) P ₂ ] -содержащие липосомы и липосомы головного мозга [которые обогащены PtdIns (4,5) P ₂ липиды] давали существенное связывание белка (рис.4С). Этот результат означает, что, хотя SNX9 также отдает предпочтение PtdIns (4,5) P ₂ , SNX18 более специфичен, чем довольно беспорядочный SNX9 (Lundmark and Carlsson, 2003; Pylypenko et al., 2007; Yarar et al. др., 2008). Если SNX18 требует PtdIns (4,5) P ₂ для связывания с мембраной и канальцев, на него должен воздействовать лекарственный препарат иономицин, который снижает уровни PtdIns (4,5) P ₂ за счет увеличения Концентрация Ca ²⁺ (Варнаи, Балла, 1998).Действительно, даже очень короткие стимулы клеток HeLa иономицином приводили к полной потере канальцевого SNX18-PX-BAR (рис. 4D). Обработка клеток препаратом вортманнин, который снижает уровни PtdIns (3) P (Vanhaesebroeck et al., 2001), оказала лишь незначительное влияние на локализацию PX-BAR, что дополнительно подтверждает важность PtdIns (4, 5) P ₂ для функции SNX18.

Фиг.3.

SNX9, SNX18 и SNX30 взаимодействуют и колокализируются с динамином 2. (A) GST или GST-слитые белки с Sh4-доменами из SNX9, SNX18 или SNX30 инкубировали с (+) или без (-) цитозоля из HeLa клетки. После промываний связанный белок анализировали с помощью SDS-PAGE, и гель окрашивали кумасси. Идентичность динамина 2 (Dyn2) подтверждали иммуноблоттингом. (B) PRD динамина 2, содержащий последовательности дикого типа (wt) или мутантные (mut1-4), очищали и использовали в вытягивании с GST или GST-гибридными белками, содержащими Sh4-домены из SNX9, SNX18, SNX30. или амфифизин 2 (Amph3), как описано в разделе «Материалы и методы».Связанный белок вместе с общим белком (ввод) анализировали с помощью SDS-PAGE, и гели окрашивали кумасси. Последовательность C-концевой части PRD с указанными Sh4-связывающими мотивами типа I и типа II показана ниже. Выделены модифицированные аминокислоты в мутированных PRD. (C) Эпифлуоресцентная микрофотография клеток HeLa, экспрессирующих myc-tag-SNX9 (a) или myc-tag-SNX18 (b) и окрашенных в контрастный цвет для динамина 2 после вымывания цитозольных компонентов, как описано в материалах и методах.Увеличенные области в рамке вместе с иллюстрациями конкретных структур, помеченных анти-myc и анти-динамином-2, показаны справа. Масштабная линейка: 10 мкм.

Рис. 3.

SNX9, SNX18 и SNX30 взаимодействуют и колокализуются с динамином 2. (A) GST или GST-гибридные белки с Sh4-доменами из SNX9, SNX18 или SNX30 инкубировали с (+) или без ( -) цитозоль из клеток HeLa. После промываний связанный белок анализировали с помощью SDS-PAGE, и гель окрашивали кумасси.Идентичность динамина 2 (Dyn2) подтверждали иммуноблоттингом. (B) PRD динамина 2, содержащий последовательности дикого типа (wt) или мутантные (mut1-4), очищали и использовали в вытягивании с GST или GST-гибридными белками, содержащими Sh4-домены из SNX9, SNX18, SNX30. или амфифизин 2 (Amph3), как описано в разделе «Материалы и методы». Связанный белок вместе с общим белком (ввод) анализировали с помощью SDS-PAGE, и гели окрашивали кумасси. Последовательность C-концевой части PRD с указанными Sh4-связывающими мотивами типа I и типа II показана ниже.Выделены модифицированные аминокислоты в мутированных PRD. (C) Эпифлуоресцентная микрофотография клеток HeLa, экспрессирующих myc-tag-SNX9 (a) или myc-tag-SNX18 (b) и окрашенных в контрастный цвет для динамина 2 после вымывания цитозольных компонентов, как описано в материалах и методах. Увеличенные области в рамке вместе с иллюстрациями конкретных структур, помеченных анти-myc и анти-динамином-2, показаны справа. Масштабная линейка: 10 мкм.

Как показано выше (Рис.2B), эндогенная локализация SNX18 в клетках HeLa была определена с помощью иммунодетекционного анализа в виде отдельных небольших точек и коротких трубок, равномерно распределенных по цитоплазме. Антитела, генерируемые против SNX30, не приводили к надежному окрашиванию клеток, и этот белок не исследовался в дальнейшем. Мы сосредоточились на идентификации белков, которые совместно локализовались с пятном, наблюдаемым для SNX18, и обнаружили частичное перекрытие с AP-1 (рис. 5A). Поскольку известно, что SNX9 связывается с гомологичным комплексом AP-2 посредством мотивов в области LC, мы предположили, что такая же область в SNX18 может связываться с AP-1.Из всех доменов область LC больше всего различается между паралогами как по длине, так и по последовательности (см. Рис. 1A, B). Отдельные ушные домены комплексов AP, которые являются единицами взаимодействия дополнительных белков, были очищены как слитые с GST белки и проанализированы на их способность связывать область LC SNX18. Действительно, LC-область специфически взаимодействовала с ушным доменом γ1, но не с сопутствующим ушным доменом AP-1 (β1), ни с аналогичными ушными доменами AP-2, AP-3 или AP-4 (рис. 5B). ).Ранее описанный мотив последовательности, распознаваемый γ1 ear [W / F / Y] G [P / D / E] [W / F / Y / L / M] (Mattera et al., 2004), очень похож на мотив последовательности близкий гомолог γ2 ear и GAE-домены белков GGA. Используя очищенные белки, мы показали, что LC-область SNX18 специфически взаимодействует с γ1 и в меньшей степени с γ2, но незначительно с адаптерами GGA (рис. 5C). Это позволило нам предположить, что новый мотив может быть ответственным за специфическое взаимодействие SNX18 с AP-1.

Фиг.4.

Связывание с мембраной и -тубуляция с помощью доменов PX-BAR из SNX9, SNX18 и SNX30. (A) Эпифлуоресцентные микрофотографии клеток HeLa, экспрессирующих myc-меченые домены PX-BAR из SNX9, SNX18 и SNX30. Масштабная линейка: 10 мкм. Обратите внимание на длинные, окрашенные myc канальцы, образованные всеми тремя конструкциями PX-BAR. (B) Электронная микрофотография мембранных пробирок, созданных инкубацией липосом, полученных из липидов головного мозга, вместе с 20 мкМ очищенного белка SNX18-PX-BAR. На вставке показано увеличение указанной области в 2,5 раза.(C) Фосфоинозитид-связывающая специфичность SNX18-PX-BAR, проанализированная с помощью совместной седиментации липосом. SNX18-PX-BAR инкубировали с липосомами, полученными из липидов головного мозга (мозг), или с липосомами с определенным липидным составом без (PS) или с указанными фосфоинозитидами (см. «Материалы и методы»). После центрифугирования фракции осадка (P) и супернатанта (S) анализировали с помощью SDS-PAGE, и окрашенные Кумасси полосы количественно определяли денситометрией. (Ниже) Полоски показывают средние значения из двух экспериментов, с максимальным значением, указанным для каждого набора.(D) Эпифлуоресцентные микрофотографии, показывающие клетки HeLa, экспрессирующие myc-меченный SNX18-PX-BAR, обработанные иономицином или вортманнином, как указано. Обратите внимание на потерю мембранных канальцев после лечения иономицином. Масштабная линейка: 10 мкм. Все конструкции PX-BAR содержали смежные домены Y (см. Фиг. 1A).

Рис. 4.

Связывание с мембраной и -тубуляция с помощью доменов PX-BAR из SNX9, SNX18 и SNX30. (A) Эпифлуоресцентные микрофотографии клеток HeLa, экспрессирующих myc-меченые домены PX-BAR из SNX9, SNX18 и SNX30.Масштабная линейка: 10 мкм. Обратите внимание на длинные, окрашенные myc канальцы, образованные всеми тремя конструкциями PX-BAR. (B) Электронная микрофотография мембранных пробирок, созданных инкубацией липосом, полученных из липидов головного мозга, вместе с 20 мкМ очищенного белка SNX18-PX-BAR. На вставке показано увеличение указанной области в 2,5 раза. (C) Фосфоинозитид-связывающая специфичность SNX18-PX-BAR, проанализированная с помощью совместной седиментации липосом. SNX18-PX-BAR инкубировали с липосомами, полученными из липидов головного мозга (мозг), или с липосомами с определенным липидным составом без (PS) или с указанными фосфоинозитидами (см. «Материалы и методы»).После центрифугирования фракции осадка (P) и супернатанта (S) анализировали с помощью SDS-PAGE, и окрашенные Кумасси полосы количественно определяли денситометрией. (Ниже) Полоски показывают средние значения из двух экспериментов, с максимальным значением, указанным для каждого набора. (D) Эпифлуоресцентные микрофотографии, показывающие клетки HeLa, экспрессирующие myc-меченный SNX18-PX-BAR, обработанные иономицином или вортманнином, как указано. Обратите внимание на потерю мембранных канальцев после лечения иономицином. Масштабная линейка: 10 мкм. Все конструкции PX-BAR содержали смежные Y-домены (см.рис.1А).

Рис. 5.

SNX18 колокализуется и взаимодействует с AP-1. (A) Клетки HeLa окрашивали на эндогенный SNX18 и AP-1 и визуализировали с помощью эпифлуоресценции. Масштабная линейка: 10 мкм. Указанная в рамке область была увеличена, а стрелки указывают на обширную локализацию на периферии. (B) Эксперимент с понижением частоты с GST и GST-гибридными белками, содержащими ушные домены комплексов AP млекопитающих.Слитые белки, связанные с шариками, инкубировали с His-меченной LC-областью из SNX18, а связанный и несвязанный SNX18-LC анализировали с помощью SDS-PAGE и фильтровали с помощью His-зонда (Pierce). Гель, окрашенный кумасси, показывает слитые белки. (C) Эксперимент с понижением частоты с GST и GST-гибридными белками, содержащими ушные домены γ1 или родственной субъединицы γ2, или домены GAE GGA1 или GGA2. Понижение выполняли, как в B. (D) Демонстрация специфического сайта связывания γ1 в SNX18. Выравнивание показывает консервативный кислый участок в LC-области SNX18.Черный оттенок указывает на консервативные триптофаны и кислотные остатки, а серый оттенок указывает на фланкирующие аминокислоты с консервативными свойствами по крайней мере у четырех из пяти видов. Связанный с гранулами GST и GST-γ1-ear инкубировали с His-SNX18-LC дикого типа (wt) или мутантным (W154S и W158S, стрелки в выравнивании), и выпадение проводили, как в B.

Рис. 5.

SNX18 колокализуется и взаимодействует с AP-1. (A) Клетки HeLa окрашивали на эндогенный SNX18 и AP-1 и визуализировали с помощью эпифлуоресценции.Масштабная линейка: 10 мкм. Указанная в рамке область была увеличена, а стрелки указывают на обширную локализацию на периферии. (B) Эксперимент с понижением частоты с GST и GST-гибридными белками, содержащими ушные домены комплексов AP млекопитающих. Слитые белки, связанные с шариками, инкубировали с His-меченной LC-областью из SNX18, а связанный и несвязанный SNX18-LC анализировали с помощью SDS-PAGE и фильтровали с помощью His-зонда (Pierce). Гель, окрашенный кумасси, показывает слитые белки. (C) Эксперимент с понижением частоты с GST и GST-гибридными белками, содержащими ушные домены γ1 или родственной субъединицы γ2, или домены GAE GGA1 или GGA2.Понижение выполняли, как в B. (D) Демонстрация специфического сайта связывания γ1 в SNX18. Выравнивание показывает консервативный кислый участок в LC-области SNX18. Черный оттенок указывает на консервативные триптофаны и кислотные остатки, а серый оттенок указывает на фланкирующие аминокислоты с консервативными свойствами по крайней мере у четырех из пяти видов. Связанный с гранулами GST и GST-γ1-ear инкубировали с His-SNX18-LC дикого типа (wt) или мутантным (W154S и W158S, стрелки в выравнивании), и выпадение проводили, как в B.

Патч последовательности обнаружен в LC-областях SNX9, SNX18 и SNX30, который похож по последовательности, но расположен по-разному. Последовательность состоит из отрезка отрицательно заряженных аминокислот с двумя триптофанами, расположенными на расстоянии двух (SNX30) или трех (SNX9 и SNX18) остатков. Ранее было показано, что в SNX9 этот пластырь является частью второго сайта связывания клатрина и AP-2 (Lundmark and Carlsson, 2003), а также было обнаружено, что он обладает связывающим мотивом для гликолитического фермента альдолазы (Lundmark and Carlsson , 2004).В SNX18 эта область, которая является высококонсервативной у позвоночных (Fig. 5D, верхняя панель), является наиболее вероятной областью взаимодействия с AP-1. Чтобы проверить это, мы мутировали отдельные триптофаны в этой области в серины, что привело к значительному снижению связывания с ухом γ1 (рис. 5D, нижняя панель). Это показывает, что область, подобная той, что в SNX9, которая связывается с AP-2, также связывает SNX18 с AP-1 и, вероятно, отвечает за локализацию SNX18 в AP-1-положительных структурах в клетке.

Наблюдаемое взаимодействие между SNX18 и AP-1 предполагает общую роль этих белков в формировании транспортных носителей в TGN и / или эндосомах.В TGN AP-1 рекрутируется малой GTPase Arf1, чтобы генерировать почкование покрытых клатрином пузырьков (Gillingham and Munro, 2007). Однако мы не смогли обнаружить какой-либо совместной локализации SNX18 с отдельным пулом AP-1 или Arf1 в TGN (рис. 5A и дополнительный материал рис. S1B), а также не смогли обнаружить какую-либо совместную локализацию или взаимодействие между SNX18 и клатрином (дополнительный материал Рис. S1C, D). Таким образом, периферические AP-1- и SNX18-положительные точки, видимые с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, с большей вероятностью являются эндосомными структурами.В соответствии с этим мы обнаружили, что обработка клеток препаратом Брефельдин A (BFA), которая приводит к нарушению функции Гольджи из-за ингибирования загрузки Arf (Gillingham and Munro, 2007), не устраняет совместное окрашивание SNX18. и АП-1. Вместо этого, лечение BFA, что интересно, привело к увеличению совместной локализации AP-1 и SNX18 в периферических эндосомных точках (Рис. 6A). Подсчет количества SNX18-позитивных точек, которые совместно локализовались с AP-1 в клетках, показал BFA-зависимое увеличение на 73% количества локусов, в которых белки были обнаружены вместе (рис.6Б). Эффект BFA может быть дополнительно продемонстрирован иммунопреципитацией комплекса AP-1. В отличие от необработанных клеток, которые давали очень небольшую коиммунопреципитацию, эндогенный SNX18 значительно осаждался вместе с комплексом AP-1 в иммунопреципитатах из клеток, обработанных BFA (рис. 6C), подтверждая, что два белка действительно действуют как партнеры в сотовый. Наши результаты показывают, что SNX18 не является частью Arf1-, AP-1- и клатрин-зависимого механизма покрытия в TGN, а скорее участвует в механизме почкования, который зависит от отдельного пула эндосомного AP-1, устойчивого Брефельдину А.Затем мы исследовали, располагается ли и где AP-1 на коротких фенотипических трубках, наблюдаемых при сверхэкспрессии полноразмерного SNX18. К нашему удивлению, пробирки были лишены AP-1, и точечное эндосомное окрашивание AP-1 было полностью потеряно (рис. 6D). Тот факт, что AP-1 все еще присутствует в TGN, показал, что только пул AP-1, который был связан с эндосомами, мог быть изолирован за счет избыточной продукции SNX18.

Фиг.6.

SNX18 является частью эндосомного AP-1- и PACS1-позитивного аппарата почкования. (A) Флуоресцентная микрофотография клетки HeLa, обработанной BFA и окрашенной совместно на эндогенные SNX18 и AP-1. Увеличение области, выделенной рамкой, показано справа; стрелки указывают колокализованные точки. (B) График показывает степень совместной локализации между SNX18 и AP-1 в необработанных и обработанных BFA клетках HeLa. Столбики показывают процент SNX18-положительных точек, которые совместно локализовались с AP-1, как средние значения (s.e.m.) из 45 квадратов 5 × 5 мкм, размещенных на 25 случайно выбранных ячейках. Тест Стьюдента t показал P <0,01 между необработанными и обработанными клетками. (C) Лизаты из BFA-обработанных или необработанных клеток HeLa иммунопреципитировали (IP) антисывороткой против γ-адаптина или без первичного антитела (контроль) и анализировали иммуноблоттингом (Blot) с использованием антисыворотки против SNX18 и γ-адаптина. Коиммунопреципитация увеличивалась после лечения BFA. (D) Эпифлуоресцентная микрофотография, показывающая клетку HeLa, сверхэкспрессирующую myc-tagged SNX18 (зеленый) вместе с нетрансфицированными клетками, окрашенными на AP-1 (красный) после вымывания цитозольных компонентов.Для наглядности границы ячеек обведены пунктирными линиями. Обратите внимание на исчезновение периферической точки AP-1 в клетке, сверхэкспрессирующей SNX18. (E) Эпифлуоресцентная микрофотография, показывающая клетку HeLa, окрашенную на эндогенный SNX18 и PACS1. Стрелки на увеличенной объединенной вставке показывают точки, в которых совместно локализованы белки. Масштабные линейки: 10 мкм.

Рис. 6.

SNX18 является частью эндосомного AP-1- и PACS1-позитивного аппарата почкования. (A) Флуоресцентная микрофотография клетки HeLa, обработанной BFA и окрашенной совместно на эндогенные SNX18 и AP-1.Увеличение области, выделенной рамкой, показано справа; стрелки указывают колокализованные точки. (B) График показывает степень совместной локализации между SNX18 и AP-1 в необработанных и обработанных BFA клетках HeLa. Столбики показывают процент SNX18-положительных точек, которые совместно локализовались с AP-1, как средние значения (s.e.m.) из 45 квадратов 5 × 5 мкм, помещенных на 25 случайно выбранных ячеек. Тест Стьюдента t показал P <0,01 между необработанными и обработанными клетками. (C) Лизаты из BFA-обработанных или необработанных клеток HeLa иммунопреципитировали (IP) антисывороткой против γ-адаптина или без первичного антитела (контроль) и анализировали иммуноблоттингом (Blot) с использованием антисыворотки против SNX18 и γ-адаптина.Коиммунопреципитация увеличивалась после лечения BFA. (D) Эпифлуоресцентная микрофотография, показывающая клетку HeLa, сверхэкспрессирующую myc-tagged SNX18 (зеленый) вместе с нетрансфицированными клетками, окрашенными на AP-1 (красный) после вымывания цитозольных компонентов. Для наглядности границы ячеек обведены пунктирными линиями. Обратите внимание на исчезновение периферической точки AP-1 в клетке, сверхэкспрессирующей SNX18. (E) Эпифлуоресцентная микрофотография, показывающая клетку HeLa, окрашенную на эндогенный SNX18 и PACS1. Стрелки на увеличенной объединенной вставке показывают точки, в которых совместно локализованы белки.Масштабные линейки: 10 мкм.

Для того, чтобы дополнительно охарактеризовать природу мембран, которые были положительными как для SNX18, так и для AP-1, мы проанализировали, окрашивается ли SNX18 совместно с маркерными белками, о которых известно, что они локализуются в мембранных везикулах и динамических областях эндосом. SNX18 не локализовался вместе со сверхэкспрессируемым Rab5, Rab7, Rab9 или Rab11 (специфическими белками семейства GTPases rab) (Pfeffer, 2003; Zerial and McBride, 2001) или epsinR (ранее идентифицированный мембранный тубулятор, связанный с AP-1) ( Hirst et al., 2003; Kalthoff et al., 2002; Mills et al., 2003) (данные не показаны). Однако мы обнаружили, что значительное количество точек SNX18 было положительным по PACS1 (Fig. 6E), белку, который, как известно, функционирует в ретроградном переносе из эндосом вместе с AP-1 (Crump et al., 2001). Периферические PACS1-положительные точки также были устойчивы к BFA (Wan et al., 1998) (и данные не показаны), что согласуется с общей механистической основой. Эти данные демонстрируют, что SNX18 локализуется с PACS1 и отдельным пулом AP-1, рекрутируемым независимо от Arf1.Предыдущие данные подтвердили, что AP-1 и PACS1 принимают участие в образовании специфических носителей в эндосомах (Crump et al., 2001). Возможно, что SNX18 участвует в этом процессе, создавая высокую кривизну мембраны и рекрутируя динамин для тубулярного и / или везикулярного рассечения.

Пути переноса, которые исходят из ранней эндосомальной канальцевой сети, как полагают, в значительной степени вовлекают почкование и слияние переносчиков трубчатых мембран.Белки PX-BAR, которые все принадлежат к семейству SNX, обладают свойствами, хорошо подходящими для функции в этом контексте. Структура супердомена PX-BAR обладает как липид-связывающей специфичностью, так и функцией формирования мембраны. Там, где они присутствуют, дополнительные домены и области за пределами этого супердомена, по-видимому, опосредуют взаимодействия с другими белками, необходимыми для процесса сортировки и / или канальцевания. Информация о роли белков PX-BAR в различных путях переноса эндоцитов быстро накапливается.SNX1, SNX2, SNX5 и SNX6 участвуют в функции ретромера (Carlton et al., 2004; Griffin et al., 2005; Rojas et al., 2007; Wassmer et al., 2007), а недавно было высказано предположение, что SNX4 участвует в транспорт рецептора трансферрина в компартмент рециркуляции эндоцитов (Traer et al., 2007). SNX9 является хорошо зарекомендовавшим себя дополнительным белком, необходимым для деления покрытых клатрином эндоцитарных пузырьков, и мы показываем здесь, что SNX18 участвует в ремоделировании мембран в эндосомах вместе с AP-1 и PACS1.Функциональная роль SNX30 остается неопределенной из-за трудностей с локализацией белка в клетках и идентификацией конкретных партнеров по взаимодействию, но наши данные предполагают, что этот белок может играть роль тубулятора в еще одном событии переноса через мембрану. Однако нельзя полностью исключить, что SNX18 и SNX30 используются в качестве избыточных белков в одном и том же пути, потому что существует некоторая тенденция к реципрокной экспрессии в разных тканях, то есть там, где экспрессия SNX18 высокая, SNX30 низкая и наоборот (см. Инжир.1С). Однако их LC домены, которые несут предполагаемые мотивы, взаимодействующие с белками, очень непохожи, что указывает на возможность того, что у них есть разные белковые партнеры. Дальнейшие исследования SNX18 и SNX30 прольют свет на этот вопрос.

Признаком, который отличает белки семейства SNX9 от других белков PX-BAR, является наличие домена Sh4. Как было обнаружено ранее для SNX9 (Lundmark and Carlsson, 2003; Soulet et al., 2005), мы показываем здесь, что и в SNX18, и в SNX30 этот домен взаимодействует с динамином. Это взаимодействие может быть важным для опосредованного динамином рассечения трубчатых отростков (Ramachandran and Schmid, 2008). Мы продемонстрировали, что все белки семейства SNX9 связываются с динамином 2, но вполне вероятно, что они также взаимодействуют с гомологичными белками динамином 1 [как показано для SNX9 (Shin et al., 2007; Soulet et al., 2005)] и динамин 3. Однако динамин 1 ограничен мозгом, в котором все члены семейства SNX9 экспрессируются минимально.Интересно, что как SNX30 (see Fig. 1C), так и Dynamin 3 (Cao et al., 1998) в основном экспрессируются в семенниках, это указывает на то, что они могут образовывать функциональный комплекс. Возможно, что, кроме того, домены Sh4 SNX18 и SNX30 используются для взаимодействий с белками, полимеризующими актин, такими как N-WASP, как было предложено для SNX9 (Badour et al., 2007; Shin et al., 2007; Ярар и др., 2007). Такие взаимодействия могут быть важны для правильного роста и транспортировки трубчатого носителя.

Без присутствия домена Sh4, что, следовательно, приводит к неспособности рекрутировать динамин, белки семейства SNX9 больше не могут способствовать разрыву мембраны. Это приводит к образованию длинных мембранных трубок, часто начинающихся или заканчивающихся отдельными точками (см. Рис. 4А). Попытки выяснить мембранный источник этих трубок пока не увенчались успехом. Частично это связано с большой кривизной, возникающей после формирования трубки, которая может исключать потенциальные маркерные белки исходной органеллы.Белки семейства SNX9 являются очень сильными мембранными связующими. Подобно SNX9, SNX18, как было показано здесь, требует PtdIns (4,5) P ₂ для оптимального связывания. Поскольку обычно известно, что SNX связывают PtdIns (3) P , специфичность PtdIns (4,5) P ₂ может быть еще одним определяющим признаком, объединяющим это подсемейство. Наши результаты также предполагают, что блок PX-BAR не является единственным ответственным за дивергентную локализацию SNX9 и SNX18 (сравните эндогенную локализацию на рис.2B с выраженным PX-BAR в дополнительном материале (рис. S1A). Полноразмерные белки имеют уникальное распределение, несмотря на то, что специфичность связывания липидов и геометрия образованных трубок одинаковы. Взаимодействия белок-белок, опосредованные областями вне домена PX-BAR, вероятно, важны для правильной локализации, а фосфоинозитидная специфичность домена PX критична для усиления взаимодействия с мембраной-мишенью (Pylypenko et al., 2007). Помимо относительно высокой концентрации PtdIns (4,5) P ₂ на плазматической мембране, этот фосфоинозитид также обогащен в динамических областях как Гольджи, TGN, так и эндосом (Watt et al., 2002). Предпочтение фосфоинозитидов AP-1 было определено в отношении PtdIns (4) P (который обогащен по Гольджи), а также PtdIns (4,5) P ₂ (Crottet et al., 2002; Wang et al., др., 2003). Как обсуждалось выше, однако, мы не верим, что SNX18 обычно действует на Гольджи, и поскольку точно установлено, что AP-1 действует только на внутренние мембраны, маловероятно, что SNX18 действует на плазматической мембране. PtdIns (4,5) P ₂ -обогащенных локусов на эндосомах, создаваемых локально активированными липидными киназами, м. Служить в качестве сайтов инициации для образования зачатков канальцев AP-1-SNX18.

Конкретная роль AP-1 в TGN-эндосомной системе все еще остается неопределенной, и было предложено несколько различных путей, которые зависят от этого адаптера. Однако ясно, что субпопуляция AP-1 находится на мембранных структурах вне TGN, и были предложены два разных пути извлечения от эндосом к TGN, в которых участвует AP-1: путь epsinR и путь PACS1. Было показано, что EpsinR вместе с AP-1 и клатрином участвует в извлечении материала из трубчатых эндосом в TGN в динамин-зависимом процессе (Saint-Pol et al., 2004). Поскольку этот путь является BFA-чувствительным и клатрин-зависимым, мы думаем, что маловероятно, что SNX18 здесь задействован. Кроме того, мы не наблюдали совместной локализации сверхэкспрессированных epsinR и SNX18 в клетках, как обсуждалось выше. Характеристики SNX18 лучше соответствуют роли в функции извлечения, опосредованной PACS1, потому что мы действительно обнаружили частичную совместную локализацию двух белков (см. Рис. 6E). Однако, насколько нам известно, еще не было проверено, зависит ли путь PACS1 от динамина (как можно было бы ожидать от канальцевого процесса, в котором участвует SNX18), и необходимы дальнейшие исследования для более точного определения роли PACS1 в эндосомном переносе. и как SNX18 связан с этим путем.

Рекрутирование дополнительных белков за счет слабых взаимодействий через гибкие ушные домены составляет механизм, с помощью которого AP комплексы могут обеспечивать направленность процессу образования пузырьков (Schmid and McMahon, 2007). Предыдущие исследования мотивов, используемых для связывания с субъединицами α, γ, β1 и β2, выявили как сходство, так и расхождение в консенсусных связывающих мотивах. SNX9 использует кооперативное связывание с AP-2 через два мотива в области LC.Оба мотива используют большие гидрофобные остатки для стыковки с доменами уха (Lundmark and Carlsson, 2003). Мы показали здесь, что SNX18 обладает аналогичным мотивом в области LC. Этот мотив, однако, не обеспечивает связывание AP-2 с ушами (см. Фиг. 5B). Мы были заинтригованы, обнаружив, что кислотная последовательность D [D / E] DWDD [D / E] WDD участвует в связывании γ-уха, поскольку ранее описанный консенсусный мотив для этого придатка — [W / F / Y] G [P / D / E] [W / F / Y / L / M] (Mattera et al., 2004), в котором вместо трех между гидрофобными остатками есть только две аминокислоты.Это несоответствие может быть связано с дегенерацией мотива или может указывать на присутствие нового сайта связывания на ухе γ. Последний вариант привлекателен, поскольку были идентифицированы два различных сайта связывания как на α-, так и на β2-ушных доменах (Brett et al., 2002; Edeling et al., 2006a; Praefcke et al., 2004; Schmid et al., 2006 г.). Кроме того, как в SNX9, так и в SNX18 мы обнаружили, что последовательности, расположенные выше сайтов связывания, хорошо законсервированы и, следовательно, вероятно, играют важную роль в определении специфичности связывания.

Поскольку давно известно, что AP-1 работает вместе с клатрином для образования транспортных пузырьков, любопытно, что SNX18, как было обнаружено, не колокализируется с клатрином. В соответствии с этим открытием, исследования связывания in vitro с использованием LC-домена SNX18 не выявили какого-либо взаимодействия с клатрином (см. Дополнительный материал на рис. S1C, D), как было ранее обнаружено для LC-домена SNX9 (Lundmark and Carlsson, 2003). ).Следовательно, возможно, что клатрин не участвует в образовании эндосомных канальцев, которые являются положительными как для AP-1, так и для SNX18. Потенциально клатрин может работать только вместе с AP-1 для образования сферических везикул одинакового размера (например, в TGN), и что трубчатые удлинения не требуют (или даже подавляются) клатриновым покрытием. Если да, то в зависимости от того, какой тип носителя производится, AP-1 может работать как с клатрином, так и без него. Эта двойная роль также была предложена для AP-3 (Lubben et al., 2007). Фактически, при PACS1-AP-1-обеспечиваемом эндосомном сортировке неясно, действительно ли необходим клатрин. Если клатрин не участвует в образовании эндосомных носителей, это может объяснить, почему PACS1 не обогащен препаратами везикул, покрытых клатрином (Lubben et al., 2007).

Мы показали здесь, что SNX18 представляет собой белок, формирующий мембрану, с функцией AP-1-положительного BFA-резистентного эндосомного транспорта.Неожиданным открытием стало то, что обработка клеток BFA приводит к усилению ассоциации между SNX18 и AP-1. Было установлено, что истощение активности Arf в клетках при использовании BFA или при использовании доминантно-отрицательных конструкций Arf приводит к потере периферических мембранных белков, включая механизмы покрытия как COPI, так и AP-1, в Гольджи (Gillingham and Munro, США). 2007). Это имеет серьезные последствия для целостности мембранных компартментов и приводит к рассеянию Гольджи в эндоплазматической сети и сортировке эндосом.Было показано, что ни один единственный Arf не ответственен за этот драматический эффект, но было обнаружено, что комбинированное истощение Arfs с использованием siRNA реплицирует этот фенотип (Volpicelli-Daley et al., 2005). Мы обнаружили BFA-стимулированное комплексообразование между AP-1 и SNX18, что позволяет предположить, что AP-1 в этом случае рекрутируется на мембраны независимо от Arf, или что нечувствительный к BFA фактор обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) стимулирует Arf и впоследствии AP -1 для связи с эндосомами. ARNO и цитохезин являются членами небольших GEF, которые, помимо домена sec7, имеют домен PH.Активность GEF этих белков резко стимулируется при связывании с PtdIns (4,5) P ₂ -содержащих мембран (Casanova, 2007). Возможно, что один из этих GEF запускает Arf для рекрутирования AP-1 на эндосомальные мембраны. Однако, поскольку Arf в TGN заблокирован в непродуктивном комплексе BFA-GEF-Arf после обработки BFA, маловероятно, что тот же самый Arf ответственен за усиленную локализацию AP-1 вместе с SNX18. Следовательно, если белок Arf участвует в стимулировании SNX18-позитивного почкования, вполне вероятно, что нечувствительный к BFA PtdIns (4,5) P ₂ -стимулированный GEF активирует отдельный Arf, отдельный от того, который активирован в TGN. .Существует, однако, также возможность, что рекрутирование различных комплексов AP на мембраны эндоцитов (в отличие от мембран Гольджи) не требует прямого связывания с Arf. Эти процессы сборки могут больше полагаться на специфические липидные взаимодействия, посредством которых Arf может влиять на отрастание мембран посредством регуляции липид-модифицирующих киназ и фосфатаз, как показано для Arf6 (Donaldson, 2003).

Филогения многоклеточных животных, требующая постепенно более сложной эндосомной системы для сортировки грузов, требует дополнительных транспортных носителей и белков периферических мембран.Следовательно, тогда как дрожжи не экспрессируют какой-либо ортолог SNX9, насекомые и черви обладают единственной версией молекулы, и с появлением позвоночных появились три паралога с различными функциями в процессах мембранных канальцев. Помимо гомологии последовательностей и сходства в структуре доменов, существует также функциональная основа для категоризации SNX9, SNX18 и SNX30 в отдельное подсемейство белков. Мы предполагаем, что, основываясь на описанных взаимодействиях, члены семейства SNX9 составляют независимые единицы разрыва мембраны вместе с динамином, которые рекрутируются в события переноса мембраны, управляемые комплексами AP.Белки семейства SNX9 идеально подходят для этой задачи благодаря способности домена PX-BAR к мембранным трубкам, а также способности связывать динамин и способствовать его активности GTPase.

Ремоделирование мембраны белком PX-BAR SNX18 способствует образованию аутофагосом | Журнал клеточной биологии

Плазмиды

трансфицировали с использованием FuGene (Roche) или Lipofectamine 2000 (Invitrogen). В первичном скрининге использовались миРНК Dharmacon SMARTpool ON-TARGET plus (Thermo Fischer Scientific).Во вторичном скрининге использовали соответствующие отдельные олигонуклеотиды Dharmacon ON-TARGET плюс. См. Таблицы S1 и S2 для получения информации о количестве миРНК Dharmacon и последовательностях миРНК. siSNX18-1, -2, -3 и -4 соответствуют Dharmacon J-013438-09, -10, -11 и -12. Следующие олигонуклеотиды миРНК были получены от Invitrogen (Stealth): siSNX18-5, 5′-CAGGAUCGCUGUAACACUAUUUCUU-3 ‘; siSNX9-1, 5’-AAGAGAGUCAGCAAUCAUGUCU-3 ‘; и siSNX9-2, 5’-AACCUACUAACACUAAUCGAU-3 ‘. Другие использованные последовательности миРНК были от Thermo Fisher Scientific: siAtg14L, 5’-GCAAAUCUUCGACGAUCCCAUAUUU-3 ‘; siAtg7, 5’-GCCCACAGAUGGAGUAGCA-3 ‘; siULK1, 5’-UCACUGACCUGCUCCUUAA-3 ‘; siAtg16L1-1, 5’-УГУГГАУГАУУАУКАУУА-3 ‘; siAtg16L1-2, 5’-GUUAUUGAUCUCCGAACAA-3 ‘; siRab11a, 5’-GUAGGUGCCUUAUUGGUUU-3 ‘; и siRab11b, 5’-CAAGAGCGAUAUCGAGCUA-3 ‘.Пулы SMART (Thermo Fisher Scientific) использовали против: siLC3A, M-013579-00; siLC3B, М-012846-01; СиГАБ, М-012368-01; и siGAB L1, M-014715-01. SiRNA доставляли в клетки с помощью Lipofectamine RNAi max (Invitrogen). Для экспериментов по спасению устойчивые к миРНК плазмиды доставляли в клетки путем трансфекции с помощью Extremegene (Roche) на следующий день после трансфекции миРНК. Для SDS-PAGE клетки лизировали в 25 мМ Hepes, pH 7,5, 125 мМ K-ацетат, 2,5 мМ Mg-ацетат, 5 мМ EGTA, 1 мМ DTT и 0,5% NP-40 с добавлением полного ингибитора протеазы (Roche ).Концентрацию белка измеряли с помощью анализа белка (Bio-Rad Laboratories) для анализа равных количеств клеточного лизата на SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом с использованием указанных первичных антител и вторичных антител, конъюгированных с HRP, обнаруженных с помощью набора субстратов Supersignal West Dura Extended Duration Substrate kit. (Пирс). Визуализацию и количественную оценку уровней белка проводили с использованием модуля документации геля Syngene, приобретения GeneSnap и программного обеспечения для анализа GeneTools (все от Syngene). В некоторых случаях вестерн-блоттинг проводился с использованием вторичных антител, конъюгированных с дальним красным флуорофором, а обнаружение и анализ выполнялись с помощью системы визуализации Odyssey (LI-COR).

.