Мерс с 200: Mercedes C200 4MATIC 2020-2021 года

Содержание

Mercedes C200 4MATIC 2020-2021 года

* Реальный цвет автомобиля и оснащение могут отличаться от показанного на изображении

Забронируйте автомобиль онлайн и зафиксируйте цену

Выберите модификацию

Выберите цвет

Выберите салон

Двухлитровый бензиновый двигатель Mercedes C-200 4MATIC делает автомобиль мощным, эффективным и экономичным. Выдавая 184 л.с., он способен разогнать седан до «сотни» с места за 8,1 с. Пиковая скорость составляет 234 км/ч. В смешанном цикле расход бензина находится в пределах 6,6-6,5 л/100 км.

За рулем нового С-200 4MATIC Вы будете держать дорожную ситуацию под полным контролем. 9-ступенчатая автоматическая коробка передач обеспечивает четкое переключение скоростей, а система постоянного полного привода помогает сохранить управление даже на скользком или вязком покрытии. Посетите салон дилера, осмотрите лично С200 4MATIC и испытайте его в деле, записавшись на тест-драйв.

Базовая комплектация:

Вы можете индивидуально сконфигурировать Ваш автомобиль C-Класса до мельчайших деталей. Или просто наслаждаться обширной базовой комплектацией:

  • Ходовая часть AGILITY CONTROL с селективной системой амортизации
  • Решетка радиатора со звездой «Мерседес-Бенц» и двумя ламелями матового цвета «Серебристый иридий»
  • Задний бампер со стилизованной под диффузор вставкой черного цвета
  • Боковые полированные молдинги из алюминия
  • Декор из элементов, покрытых черным рояльным лаком
  • Мультифункциональное рулевое колесо с 3 спицами, обтянутое черной кожей
  • Накладки на пороги впереди с надписью «Mercedes-Benz»

Технологические системы:

  • Система DYNAMIC BODY CONTROL
  • Система AIR BODY CONTROL
  • Автоматическая коробка передач 9G-TRONIC
  • Полный привод 4MATIC
  • Беспроводная система зарядки для мобильных устройств
  • Полностью цифровой дисплей приборов со стилями индикации «классический», «прогрессивный» и «спортивный»
  • Мультимедийный дисплей высокого разрешения с соотношением сторон 16:9 и диагональю 10,25″
  • Проекционный дисплей
  • Система COMAND Online
  • Функция управления комфортом ENERGIZING
  • Светодиодные фары MULTIBEAM LED
  • Новое поколение Mercedes-Benz Intelligent Drive

Технические характеристики

Двигатель Мощность, кВт (л. с.) Тип топлива Привод Максимальная скорость, км/ч [АКП] Время разгона 0–100 км/ч, с [АКП]
R4 135 (184) Бензин Полный 234 8.1

Габаритные размеры

*Количество автомобилей ограничено. Специальная цена действительна при сдаче в Trade-in автомобиля «Mercedes-Benz» или другого премиального бренда, оформлении полиса КАСКО и кредита в «Мерседес-Бенц Банк Рус». На автомобилях может быть установлено дополнительное оборудование, в связи с чем конечная цена автомобиля может отличаться от начальной или специальной (с учетом скидок и программ) цены на стоимость установленного дополнительного оборудования.

Мерседес C200 технические характеристики, обзор, Mercedes C200 фото, тест драйв с видео

Автомобили Mercedes — Benz любят за консерватизм и безупречный стиль, Mercedes C200 Kompressor не стал исключением. Он считается одним из лучших образцов С-класса, с присущим только ему спортивным характером.

Первая модель сошла со штудгартского конвейера в 2001 году, после чего многократно трансформировалась. В 2012 году появилась новая версия, и уже покорила европейский рынок.

Mercedes C200 2012 год

Перед Новым Годом, 29 декабря, была анонсирована обновленная модель, ее продемонстрировали в рамках Детройтского автосалона. Презентация прошла с блеском, о модифицированной версии Mercedes C200 Kompressor отзывы — самые положительные.

Модификация затронула внешний вид автомобиля. У него появились общие черты с дизайном E класса, руль позаимствовали у новой модели CLS. Форма головной оптики, светодиодные фонари и бамперы заметно отличаются от предыдущих моделей.

Внутри Мерседес С 200 Компрессор обновили приборную доску. Черный пластик заменили алюминием и деревом, что в целом придало интерьеру салона больше солидности.

К системе управления добавлены 5 функций активной безопасности: контроль мертвых зон, система удержания полосы, самовыключающийся дальний свет, контроль утомляемости. Установлена более совершенная мультимедийная система.

В модели Mercedes C200 технические характеристики изменились не значительно, за исключением мотора. Появилась возможность укомплектовать автомобиль 4 – х цилиндровым двигателем турбо, 1.8 л, мощность которого — 201 л.с.

Все эволюционные достижения модели с 2001 по 2011 год, стали основой комплектации версии Mercedes С200 2012 года.

Эволюция Мерседес С200 Kompressor

Первая модель Mercedes C200 Kompressor появилась в январе 2001 года. Тогда, это было 3-х дверное купе CL203, с мотором — 2 л, и мощностью всего 163 л.с. Скорость машины не превышала 230 км/ч. Вес составлял 1365 кг. Габариты были стандартными для среднего автомобиля.

Версия второго поколения, Mercedes C200 Kompressor W203 имела разновидность кузова седан на платформе одноименной модели D – класса. В 2004 году — обе версии машин в прежнем виде, перестали выпускать.

Модель третьего поколения Mercedes C200 W204 выставлялась в начале марта 2007 года на подиуме Женевского автосалона, в тот же месяц начались ее продажи. Это был удобный четырехдверный седан, который приобрел подчеркнутую строгость в дизайне, и расширенную колесную базу. Вместе с ним, была представлена модификация с кузовом универсал Touring.

мерседес с 200 фото

мерседес 200 фото 

мерседес с200 фото

фото мерседес с 200

мерседес с 200 фото

мерседес 200 фото 

мерседес с200 фото

фото мерседес с 200

Модель подверглась классическому делению на три категории: Classic, Elegance и Avantgarde, с кардинальными различиями во внутреннем оснащении. Особенный шик автомобилю, придают трансформации от тюнинг – ателье AMG, и не только во внешнем виде. Усилиями разработчиков, Mercedes C200 AMG с более мощным двигателем, становится полноценным высокоскоростным автомобилем.

Mercedes C200 технические характеристики

Модель Мерседес С 200 SW CDI может быть полноприводной 4MATIC и заднеприводной. Предложена комплектация с одним из нескольких вариантов четырехрядных моторов: на дизельной основе — OM611, OM651, V6 OM642; и бензиновой -M271, V6 M272. Стандартная ручная 6-ти ступенчатая КП, с вариантами автоматической пятиступенчатой, или семиступенчатой — 7G-Tronic. Скоростной предел – 235 км/ч. Вес – 1975 кг. Габариты: высота – 2,76 м. длина 4,58 м, а также ширина – 1,77 м.

Продажи остаются на прежнем высоком уровне, при том, что на Mercedes C200 цена снижаться не будет. Но для этого нет необходимости, С – класс, как и прежде, остается символом высокого уровня достатка владельца.

Видео Mercedes C200


 

Технические характеристики автомобиля Mercedes-Benz C 200 Kompressor (W203)

Технические характеристики Mercedes-Benz C 200 Kompressor

Mercedes-Benz C 200 Kompressor

  1. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 1 из 23
  2. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 2 из 23
  3. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 3 из 23
  4. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 4 из 23
  5. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 5 из 23
  6. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 6 из 23
  7. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 7 из 23
  8. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 8 из 23
  9. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 9 из 23
  10. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 10 из 23
  11. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 11 из 23
  12. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 12 из 23
  13. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 13 из 23
  14. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 14 из 23
  15. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 15 из 23
  16. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 16 из 23
  17. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 17 из 23
  18. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 18 из 23
  19. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 19 из 23
  20. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 20 из 23
  21. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 21 из 23
  22. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 22 из 23
  23. Фотографии Mercedes-Benz C 200 Kompressor из каталога AutoNet.ru. Фото 23 из 23

В марте 2000 года состоялась презентация третьего поколения среднеразмерных «мерседесов» С-класса на новой платформе W203. Новинка стала чуть больше, прибавила в динамике и обрела куда более спортивный характер. Машина рассчитана на молодых и активных людей, любящих быструю езду, получающих удовольствие от вождения. В базовую комплектацию автомобиля вошло более двадцати технических новшеств. Например, в салоне установлены две передние и две боковые подушки безопасности. Так же устанавливаются мультифункциональное рулевое колесо, электронная система управления скоростью движения Speed Tronic, центральный дисплей, электронная система стабилизации движения EPS, бортовая система диагностики и многое другое. Выпускаются в трех комплектациях: Classic;Elegance;Avangarde. Автомобили с одинаковыми двигателями, но в разных комплектациях немного отличаются экстерьером, а в частности — бампером и решетками радиатора.

Автомобильный каталог содержит описание, технические характеристики и фотографии автомобиля Mercedes-Benz C 200 Kompressor.

Продажа подержанных автомобилей Mercedes-Benz C

Отзывы владельцев автомобиля Mercedes-Benz C

  • 25.10.2007

    Магнит_25102007

    Оценка автора

    Объективность

    Это вам не пижонистые французы или скороспелые япошки) Это классика! Попадая в небольшой салон W202, ощущаешь вечность. Легким движением закрывается массивная дверца, мягко заводится надежный движок и ты начинаешь парить над дорогой, испытывая волны стабильности и только положимтельные эмоции.

    подробнее
  • 23.12.2008

    Самсонов Дмитрий Федорович

    Оценка автора

    Объективность

    Осенью 2008 года приобрел автомашину Мерседес С-класса, 2009 модельного года, а если точнее то Мерседес-Бенц С230 2008 года выпуска, кузов 204, черного цвета, масса 1560кг., c семиступенчатым автоматом с системой ручного переключения передач, комплектация Авангард, объем двигателя 2496 куб. см. атмосферник (нет компрессора или тнвд), 204 лошади под капотом ( 150 кВт.), задний классический привод. Долго выбирал между разными машинами.Сначала склонялся в сторону японцев, уж больно устраивала цена, качество, комплектация, аппетит к бензину и ломкость их. Затем поглядывал на…

    подробнее
  • 12.05.2009

    Коновалов Алексей Вячеславович

    Оценка автора

    Объективность

    Это чудо немецкого автопрома было куплено 3.5 года назад. Изначально стоял мотор обьемом 2.4 литра — соотвественно машина была туповата. Замена мотора на 3.2 литра решила все проблемы с разгоном. Правда пришлось поменять главную пару в коробке и поставить задний редуктор с меньшим передаточным числом. Никаких претензий к авто за весь срок эесплуатации данного экземпляра.

    подробнее

Отзывы владельцев Mercedes-Benz C (Мерседес-Бенц С) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Отзывы владельцев Mercedes-Benz C (Мерседес-Бенц С) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки — Авто Mail.ru —

Коробка передач

Объем двигателя, л

—В целом да. Немного капризна к топливу. Но повсеместная проблема с цепью на пробеге от 40 до 120 это их боль, которую компания официально не хочет признавать. А так комфортное авто, недорогое в…

14 комментария

Это вторая машина в собственности и третья с приличным опытом вождения. Комфортная, безопасная, динамичная, надёжная — проще упомянуть о паре недостатков чем перечислять все достоинства. Приличная…В 2017 году продали мне неликвидное авто , на запрос о ремонте по гарантии отказывали, придумывали отмазки, втихую поставили битые диски и резину.. Есть все документы и обращения с их подписями и…

52 комментария

Машина безумно нравится, несмотря на то, что раньше ездил только на лексусах и тойотах! Мерседес — совсем другой мир автопрома, на несколько шагов впереди остальных! Сочетание управляемости и комфорта…

14 комментария

Всем привет! Купил Мерсика за цену среднеупакованной Весты. Пользуюсь 2 года. Машина в разы лучше Весты, прокатился на тест-драйве и на Весте и на Х рее за теже деньги для интереса. Теперь не понимаю…

27 коментариев

Осталась очень довольна, продала с большим сожалением, машинка отличная, не смотря на скромный обьем двигателя радовала своей динамикой. При этом скромно кушала. Не смотря на довольно скромный размер…

11 комментарий

В целом доволен, автомобиль собранный, небольшой вес и полный привод позволяют перемещаться с комфортом в любые погодные условия, будь хоть даже сильный снег при котором рекомендуют не выезжать на…Очень доволен. Качество, скорость, управляемость, экономичность. Жду следующей модели мерседес. Только уже Е класс хочу. Хотя надо вначале ценник посмотреть …мега автомобиль всё супер очень тихо по шумке едет музыка бесподобна всё устраивает нет никаких нареканийВторой новый мерседес с класс. До него был с180 w 204 Рестайл особая серия проехал на нем 115000. Вообще без проблем. Комфортный оч приземистый. Понравился. Решил пора менять сомнений не было только…

31 комментарий

Год отъездил – надоела ешка, а вышедший новый C-класс понравился визуально и снаружи и интерьером своим веселеньким. Черный цвет тоже надоел, почти все машины были у меня черными, решил серенький…

6

Не капризная в эксплуатации.

21 комментарий

немнвжко маловат( до нее 37 лет был волга), а в осталном хорошь (главное меньше жрет и тепло в салоне).

1

В руках этот чудо автомобиль почти год. До неё сразу скажу были тоже немцы 2 БМВ 5 Е39 2.5(2002г.в.) и 2.2 всё конечно же на механике)) затесалась между ними и Ауди 6 2002 3.0(2002г.в.). Мерседесы…

1

Покупали 3 года назад как первую машину. Полностью устраивает, обслуживание недорогое, заводится в любой мороз. Запчасти дешевле чем на тойоту, ладу и тд. А 111 мотор самый неприхотливый. С ребенком…

32 комментария

После 3 лет эксплуатации могу сказать, — эта машина стоит того чтобы её покупать. Первый Mercedes в моей двадцатилетней практике, до этого был японский автопром во всём разнообразии (более 30 машин…

22 комментария

У меня был Mercedes 280 бензин с АКПП, почему-то такой модели в справочнике здесь нет. Купил на пробеге 70 тыс км, столько же проехал. До этого ездил на Камри — по сравнению с ней Мерседес требовал…

52 комментария

хороший авто, прошел 260000 км, менял стойки передние,катализатор прогорел…чуть не сгорел авто на ходу. во время нужно делать ТО и обращать внимание на компьютер.

1

машина в целом отличная! стоит своих денег. у меня машина американец. все комплектация есть почти для своего года. причем на ладах 2015 года таких комплектации нет)) круиз контроль кондер. подогрев…

11 комментарий

Устарел но жив на все 100! Быстро перемещает в пространстве незаметно накручивая километры на колёса.Очень чистый воздух для дыхания внутри,а так же плавность хода впечатляет.Кое где коррозия но пока…

1

Помогите людям с выбором — расскажите о своем опыте использования автомобиля.

Написать отзыв

<div data-module=»SlotModel» data-view=»SlotView.345798″ data-id=»345798″ data-qa=»LazyBody.block.cpfModules»></div>

Новые автомобили Mercedes-Benz в наличии | АВТОДОМ Пулково

Автоцентр «АВТОДОМ Пулково» построен по самым высоким стандартам бренда. Современное оборудование, профессиональная команда.

Официальный дилер Mercedes-Benz в Санкт-Петербурге приглашает всех ценителей роскоши и технического совершенства ознакомиться с модельным рядом легендарных автомобилей от концерна Daimler AG. На сайте вы можете за несколько кликов узнать информацию о стоимости, характеристиках и предлагаемых услугах, а посетив салон, получите премиальный уровень сервиса, персональное обслуживание и квалифицированную помощь в выборе авто.

Автомобили Mercedes-Benz ― совершенство в каждой детали.

«The Best or Nothing» (Лучшее или Ничего) ― именно такой философии придерживается автоконцерн, создавая авто, которые по своим характеристикам превосходят самые смелые ожидания. Бренд Mercedes-Benz ― это уникальное сочетание бескомпромиссного качества, технических инноваций, премиального комфорта и элегантного дизайна. Автомобили немецкого концерна объединяют в себе неудержимую мощь, динамику и абсолютную безопасность. Убедиться в этом вы можете лично, записавшись на тест-драйв у дилера Mercedes-Benz «Автодом Пулково».

На площадке дилерского центра представлены все модели именитых немецких авто, поэтому вам точно будет из чего выбрать машину, олицетворяющую сильный характер и смелые амбиции. При необходимости менеджеры автосалона Mercedes-Benz расскажут технических возможностях, ценах, доступных комплектациях. Подробная консультация перед покупкой поможет сделать взвешенный выбор, который будет приносить истинное удовольствие в поездах по городу и за его пределами.

Оцените все плюсы сотрудничества с официальным дилером

Решение купить Mercedes-Benz ― это серьезный шаг, свидетельствующий о зрелости и утонченном вкусе. Чтобы на пути к воплощению своей мечты вы испытывали только положительные эмоции, обращайтесь в официальный дилерский центр «Автодом Пулково». Компания осуществляет продажу новых авто, а также оказывает целый спектр сопутствующих услуг:

  • трейд-ин;
  • лизинг;
  • реализация в кредит;
  • страхование;
  • техническое обслуживание и сервис.

Решив приобрести Mercedes-Benz в официальном ДЦ, вы можете быть уверенным, что каждый этап покупки будет ярким, запоминающимся, наполненным удивительным предвкушением. В «Автодом Пулково» заботятся о комфорте клиентов и предлагают лучший сервис, соответствующий незыблемым корпоративным стандартам Mercedes-Benz.

Если вы желаете, чтобы экстерьер и внутреннее убранство салона Mercedes-Benz отражали ваш уникальный стиль, проконсультируйтесь у менеджеров о возможности комплектации автомобиля дополнительным оборудованием, совершенными мультимедийными системами, а также узнайте о доступных цветах кузова и наличии моделей из лимитированных серий. В «Автодом Пулково» для вас подберут оптимальное решение, удовлетворяющее самым смелым пожеланиям.

Обслуживание у официального дилера ― гарантия того, что ваш Mercedes-Benz останется на 100% оригинальным

Чтобы купленный автомобиль радовал, как можно дольше, сохраняя непревзойденную динамику и уникальные ходовые характеристики, важно уделить внимание своевременному ТО и ремонту. Обратившись в «Автодом Пулково», вы можете купить Mercedes-Benz у официального дилера, а также обеспечить качественный фирменный сервис для авто. При обслуживании используются запчасти и комплектующие, рекомендованные производителем, что позволяет гарантировать полную сохранность всех характеристик, а во время ремонта и ТО вам будет обеспечен премиальный уровень комфорта с возможностью выдачи подменного автомобиля.

Mercedes-Benz A200: машина для тревожных родителей

Споры о том, какого пола Mercedes-Benz – мужского или женского, можно заканчивать: она женщина. Голосовая помощница новых Mercedes-Benz (впервые появилась на А-Klasse и только что на GLE) оживает при обращении «привет, Мерседес!». Не обижает ее и фамильярное «эй, Мерседес!». При этом у Мерседес очень высокая самооценка – на вопрос, как дела, она отвечает: «По-моему, я отлично справляюсь».

Но чтобы познакомиться с Мерседес и узнать, на что способен A-Klasse c русифицированной мультимедийной системой MBUX (Mercedes-Benz User Experience), понадобится AppStore. Там надо скачать приложение Mercedes me и зарегистрировать в нем автомобиль. Причем в AppStore приложение расположено в категории «образ жизни».

Да-да, Mercedes-Benz строит собственную экосистему, так что в недалеком будущем для миллионов поклонников марки появятся крючки посильнее, чем универсальный подрулевой переключатель плюс подрулевой селектор АКПП, к которым очень быстро привыкаешь и потом с трудом возвращаешься к иным эргономическим решениям. В сегодняшнем мире именно экосистемы становятся ключевым элементом формирования и удержания аудитории бренда. Что прекрасно иллюстрирует Apple – одна из самых дорогих компаний мира, которую фондовый рынок оценивает так высоко в том числе из-за огромной аудитории преданных клиентов.

Четвертое поколение Mercedes-Benz A-Klasse было представлено в феврале, но русификация MBUX и ее тестирование заняли без малого год. Система умеет уже немало (или еще немного – смотря с какими мерками подходить). Владелец A-class может дать разрешение на подключение к автомобилю до 20 мобильных устройств, и на каждом через Mercedes me можно видеть текущее техническое состояние машины: пробег, запас топлива, уровень масла и проч. Можно дистанционно заблокировать или разблокировать автомобиль. Когда придет время менять масло или колодки, Мерседес сообщит об этом своему владельцу, а если тот по каким-либо причинам проигнорирует сообщение, свяжется с сервисом, выбранным владельцем. И главное, Mercedes me всегда показывает карту с точкой, где в настоящий момент находится автомобиль. Для ревнивых супругов это может стать проблемой, а вот для тревожных родителей, изводящих себя мыслями, куда пропало их чадо, – решением. Теоретически MBUX может выполнять даже функции противоугонной системы, но предполагается, что злоумышленники научатся ее глушить, и потому производитель рекомендует устанавливать спутниковую противоугонную систему.

«Привет, Мерседес!» – сказала я, впервые сев в машину. «Чем могу помочь?» – отозвалась машина. Я задумалась. «Включи обогрев для сиденья», – неуверенно попросила я. «Включаю обогрев для левого сиденья», – согласилась Мерседес. Надо признать, что сначала A200 показалась мне очень тесной, хотя я достаточно хрупкого телосложения и езжу на компактном автомобиле. В оправдание Mercedes могу сказать, что на спортивное сиденье я плюхнулась в огромном пуховике и шапке и оно не было под меня отрегулировано. Без верхней одежды зимой в машине я никогда не ездила, но тут решила рискнуть. И А200 не подвела: впоследствии я всегда садилась в машину, сняв пуховик, но никогда не мерзла – салон прогревался очень быстро.

Мультимедийная система A-класса оборудована двумя дисплеями с диагональю 10,25 дюйма, которые объединены в единый блок с небольшим разделительным сектором: один экран расположен в центре, другой – за рулевым колесом. MBUX позволяет регулировать множество опций и функций автомобиля – от настроек режимов двигателя, трансмиссии, подвески до выбора цвета контурной подсветки салона и радиостанции. Управлять настройками можно как на сенсорном экране, так и с помощью тачпада на центральном тоннеле или сенсорных кнопок на руле: интуитивно все понятно, и привыкаешь довольно быстро. Комбинации приборов на обоих экранах можно менять, кажется, бесконечно – например, вместо тахометра вывести навигатор, а вместо спидометра – музыкальный проигрыватель.

Трудности перевода

Мерседес легко понимает данные адресной книги синхронизированного смартфона и безошибочно набирает номера произнесенных вслух контактов – причем записанных как кириллицей, так и латиницей. Трудности перевода возникли, когда я решила поменять цвет подсветки: она у А-Klasse аж на 64 тона, в том числе подсвечиваются вентиляционные отверстия. При регулировании температуры салона они меняют цвет – на синий при понижении температуры, на красный – при повышении. «Эй, Мерседес! Поменяй цвет подсветки!» – прошу я. «Чем могу вам помочь?» – удивилась машина. «Подсветка салона, синий» – попробовала я. «Могу я чем-то помочь?» – проигнорировала Мерседес. «Цвет подсветки красный», – я решила не сдаваться. «Желтый – нет, синий – нет, но мне нравятся все цвета», – ответила машина. Разгадка нашлась позже: нужно было попросить Мерседес «поменять комфортную подсветку салона» – это словосочетание, которому ее научили маркетологи, Мерседес знает. А в тот раз я решила больше не спорить и поменять подсветку вручную. Зато мы поговорили о погоде – Мерседес рассказала, что ожидается снег и -3. Когда я попросила включить обогрев салона, она не ответила. «Мне холодно», – говорю. Молчит. «Температура – 23», – вновь попыталась я. «В 23.00 ожидается температура -3», – отозвалась Мерседес. На том и закончили разговоры о погоде.

Без возражений!

Муж разместился на спортивном сиденье с видимым удовольствием, внимательно осмотрев все кнопки, изучив функции на экранах, и надолго погрузился в настройки музыки. Аудиосистема в автомобиле, согласились мы, прекрасная, как и шумоизоляция.

Трехлетняя дочка, узнавшая, что у нас несколько дней будет говорящая машина, подошла к ней любопытством: «Это она? Красивая. А когда она начнет разговаривать?» Мы пояснили, что машина отзывается на «привет, Мерседес!». Примерно половину дороги к бабушке дочь пыталась привлечь внимание машины словами «пивет, Меседес», но так и осталась незамеченной. Это ее нисколько не огорчило, она с удовольствием слушала музыку, смотрела на подсветку и в конце концов уснула, убаюканная плавным ходом. Семьей в три человека мы разместились достаточно комфортно, хотя, конечно, семейной машину не назовешь.

Зато ее можно назвать молодежной. Отвезя дочку к бабушке, мы решили покататься для души и поехали с друзьями в Звенигород по вечернему пустому Новорижскому шоссе. На дороге А200 реагировала на любое мое движение – было ощущение, что она точно знала, как именно я хочу ехать и куда перестраиваться. По Москве мы ехали в режиме «эко», А-Klasse немного лениво разгонялась со светофоров. Но в режиме «спорт» на шоссе заметно оживилась. Ускорялась очень быстро, но при этом совсем не резко, плавно перестраивалась и входила в повороты. Скорость в салоне не чувствуется совершенно, друзья были очень удивлены, увидев, что время прибытия по изначальным расчетам навигатора мы обогнали на 15 мин. Кстати, навигатор тоже включается голосовой командой, его можно вывести на любой из двух дисплеев, трафик он показывает в режиме реального времени и с учетом пробок.

Правда, в этой поездке нам пришлось ввести новое правило – марку машины называть нельзя, если только ты не хочешь у нее что-то попросить: Мерседес, подслушивавшая наши разговоры, всегда реагировала на свое имя, даже если мы в этот момент просто сравнивали Mercedes-Benz с другими машинами или обсуждали ее технические характеристики. В один из таких моментов Мерседес оживленно включилась в дискуссию: «Могу я вам помочь?» «Нет», – говорю я. «Чем я могу вам помочь?» – настаивала помощница. «Ничем», – терпеливо отвечаю я. «Могу я вам чем-то помочь?» – продолжила Мерседес. «Не отвечай ей ничего, – тихонько попросил муж. – Она просто не терпит отказов».

Пока, Мерседес

На обратном пути пошел снег. Дорога стала очень заснеженной и скользкой, возвращались мы в режиме «комфорт» со скоростью 40–60 км/ч. Ехать быстрее я боялась, хотя А200 была готова – уверенно перестраивалась без малейшего намека на занос, несмотря на сантиметровый слой подмерзшего снега на дороге.

Немного занесло нас уже на въезде во двор дома, при этом Мерседес включила предупредительный сигнал, активировала камеру заднего вида (она выдвижная и всегда чистая вне зависимости от погодных условий) и показала данные датчиков парковки о том, что со всех сторон свободно и угрозы столкновения нет.

Кстати, датчики парковки для меня оказались невероятно удобной опцией. Во-первых, благодаря им можно было включить поиск парковочных мест. Не то чтобы я их не видела, но машина была для меня новой, ее габариты тоже, поэтому оценить размер парковочного места с ходу удавалось не всегда. Хотя и верить Мерседес на слово не стоило – зачастую она показывала парковочные места перед въездом в подъезд, на тротуарах или даже в полосе движения. Так что, как говорится, доверяй, но проверяй. При параллельной парковке и заезде в бокс зеркала немного поворачивались во время остановок, чтобы предоставить максимальный угол обзора, а на экран выводилась информация с датчиков со всех сторон машины. Для меня эти функции оказались незаменимыми, парковка – легкой и удобной даже с непривычки.

Расход топлива более чем порадовал: при всевозможных пробках, которые я собрала, расход составил 8,1 л на 100 км при средней скорости 24 км/ч (за предыдущие 2500 км – 9,1 л при 24 км/ч).

Жаль, что я так и не успела попрощаться с Мерседес, – очень уж торопилась. Интересно, что бы она ответила мне на «пока, Мерседес»?

В тест-драйве принимал участие Александр Губский

описание, характеристики, фото и видео

С моей точки зрения, сейчас существует явно выраженная тенденция к производству безликих автомобилей. Я же хотел иметь автомобиль, имеющий свое лицо, поэтому купил этот Mercedes, почти не раздумывая. Тем не менее, рассматривал и конкурентов. Смотрел на «трешку» BMW, Audi А4… Но, на мой взгляд, водители BMW отличаются агрессивным стилем езды, a Audi А4 — скорее женский автомобиль. А мой Мерседес С200 — это что-то вроде респектабельного «унисекса», и, пожалуй, он последний из классических авто. Чего стоит только эмблема, трехлучевая звезда, возвышающаяся на капоте, а не интегрированная в решетку радиатора!

И, надеюсь, это действительно надежная машина. К примеру, Ford Focus тест драйв которого здесь, который у меня был, сгнил за два года. А на Mercedes предполагаю ездить очень долго. И это единственная из моих машин, с учетом всех предыдущих, которая мне со временем нравится все больше. В общем, почти не выбирал, а просто шел покупать. Тем более что хотел именно в белом цвете. Да еще и обвес от AMG! Цену это увеличило, но получилось здорово. Мотор здесь базовый, турбированный, 1,8 литра, мощностью156 л.с. Ранее все мои машины были с «атмосферниками», и впечатления от турбины самые благоприятные. Едешь со скоростью 140 км/ч, нажимаешь на педаль газа и тут же получаешь значительное ускорение.

Изначально хотел дизельный двигатель, но разница в цене достаточно ощутимая. Да и бензиновый мотор неплох. Даже в зимний период расход по городу не превышает11 литров. Коробка автомат. Кстати, с АКП это тоже мой первый автомобиль, и пока еще до конца к ней не привык. Удобство в городе несомненное, но мне все равно, как-то ближе «механика». Была бы версия Мерседес С200 «с ручкой», взял бы ее, мне нравится полноценное управление автомобилем. Да и кажется мне, что автомат немного «тормозит». Возможно, это только ощущения, сравнивать мне особо не с чем. А вот задний привод требует особенных навыков управления, особенно зимой. Правда, я еще в одиннадцать лет управлял дедовской «копейкой», так что с «классикой» знаком.

Автомобиль без особой вычурности, как внутри, так и снаружи. Все просто. Салон бы даже назвал аскетичным. Зато это самая просторная машина из тех, что у меня были. Правда, езжу, в основном, один, и на то, насколько удобно пассажирам задних сидений, внимания не обращал. В плане эргономики все очень удобно. Правда, удобство пользования подрулевыми лепестками АКП пока не почувствовал. Управляется автомобиль отменно, отлично стоит на дороге, а при переключении в спортивный режим подвеска становится жестче, классные ощущения. А вот необходимый размер шин нашел с трудом: задние колеса здесь шире, чем передние. Единственный минус связан с нашими дорожными реалиями: дорожный просвет маловат. Поэтому в дальние зимние путешествия стараюсь не отправляться.

Обзор Mercedes C200 CGI Видео

Рекомендую прочитать:

Иммуногенность и структуры рационально разработанного спайкового антигена БВРС-КоВ перед слиянием

Значимость

Коронавирусы, такие как коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), вызывают тяжелый респираторный дистресс-синдром с высокой летальностью. Спайковый (S) гликопротеин является детерминантой диапазона хозяев и является мишенью для нейтрализующих антител и разработки субъединичной вакцины. Мы описываем инженерную стратегию стабилизации растворимых белков S в конформации до слияния, которая приводит к значительному увеличению экспрессии, конформационной гомогенности и возникновению мощных ответов антител.Крио-ЭМ-структуры стабилизированного белка S БВРС-КоВ в комплексе со стебл-направленным нейтрализующим антителом обеспечивают молекулярную основу для требований протеазы клетки-хозяина и определяют место иммунного давления. Мы также определили четыре конформационных состояния тримера, в которых каждый рецептор-связывающий домен либо упакован вместе в дистальной части мембраны, либо повернут в конформацию, доступную для рецептора.

Abstract

Коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) — это бета-коронавирус линии С, который с момента своего появления в 2012 году вызывал вспышки среди людей со летальностью около 36%.Как и в других коронавирусах, гликопротеин spike (S) БВРС-КоВ опосредует распознавание рецептора и слияние мембран и является основной мишенью гуморального иммунного ответа во время инфекции. Здесь мы используем дизайн на основе структуры для разработки обобщаемой стратегии сохранения белков коронавируса S в антигенно оптимальной конформации до слияния и демонстрируем, что наш сконструированный иммуноген способен вызывать высокие титры нейтрализующих антител против БВРС-КоВ. Мы также определили структуры с высоким разрешением тримерного S-эктодомена БВРС-КоВ в комплексе с G4, нейтрализующим антителом, направленным на стебель.Структуры показывают, что G4 распознает гликозилированную петлю, которая является вариабельной среди коронавирусов, и они определяют четыре конформационных состояния тримера, в которых каждый рецептор-связывающий домен либо плотно упакован в дистальной части мембраны, либо повернут в доступную для рецептора конформацию. Наши исследования предполагают потенциальный механизм инициации слияния посредством последовательных событий связывания с рецептором и обеспечивают основу для структурного дизайна вакцин против коронавируса.

Коронавирусы представляют собой оболочечные одноцепочечные РНК-вирусы с положительным смыслом.Они имеют самые большие геномы (26–32 т.п.н.) среди известных РНК-вирусов и филогенетически разделены на четыре рода (α, β, γ и δ), при этом бета-коронавирусы далее подразделяются на четыре линии (A, B, C и D). . Коронавирусы заражают широкий спектр видов птиц и млекопитающих, включая человека (1). Из шести известных коронавирусов человека четыре (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-HKU1 и HCoV-NL63) ежегодно циркулируют среди людей и обычно вызывают легкие респираторные заболевания, хотя степень тяжести может быть выше у младенцев, пожилых людей, и с ослабленным иммунитетом.Напротив, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV), принадлежащие к линиям бета-коронавирусов C и B, соответственно, являются высокопатогенными. Оба вируса попали в человеческую популяцию из животных-резервуаров в течение последних 15 лет и вызвали вспышки с высокой летальностью (2, 3).

БВРС-КоВ был изолирован в 2012 году от пациента в Саудовской Аравии и до сих пор циркулирует на Аравийском полуострове (3, 4).Первичная передача, скорее всего от верблюдов, в настоящее время считается наиболее распространенным путем передачи (5⇓ – 7), а верблюды считаются вторичным или промежуточным резервуаром БВРС-КоВ, а летучие мыши служат основным резервуаром ( 8). Передача от человека к человеку, особенно в результате тесного контакта между пациентами и медицинскими работниками в медицинских учреждениях, является еще одним важным путем передачи (9) и была причиной вспышки БВРС-КоВ в Южной Корее (10). . Высокая патогенность и передаваемость воздушно-капельным путем SARS-CoV и MERS-CoV вызвали обеспокоенность по поводу возможности новой пандемии коронавируса.К сожалению, вакцины против отдельных коронавирусов недоступны, не говоря уже о вакцинах, которые в целом защищают от нескольких коронавирусов.

Как и все коронавирусы, БВРС-КоВ использует гликопротеин с большим поверхностным шипом (S) для распознавания рецептора и проникновения в клетки-мишени (11, 12). Белок S MERS-CoV синтезируется как одноцепочечный неактивный предшественник, который расщепляется фурин-подобными протеазами хозяина в продуцирующей клетке на две нековалентно связанные субъединицы, S1 и S2 (13). Субъединица S1 содержит рецептор-связывающий домен (RBD), который распознает рецептор клетки-хозяина DPP4 (CD26) (14⇓ – 16).Субъединица S2 содержит слитый пептид, два гептадных повтора и трансмембранный домен, все из которых необходимы для опосредования слияния вирусной мембраны и мембраны клетки-хозяина, подвергаясь большой конформационной перестройке. Субъединицы S1 и S2 тримеризуются с образованием большого спайка перед слиянием (~ 600 кДа) с ~ 25 N -связанных гликанов на мономер. Недавние крио-ЭМ структуры тримерных эктодоменов S-белка префузии из вируса гепатита мышей (MHV), HCoV-HKU1 и HCoV-NL63 выявили общую грибовидную архитектуру с тремя идентичными субъединицами S1, образующими переплетенный колпачок, покоящийся на вершине пружины. шток S2 с нагружением (17⇓ – 19).Интересно, что в этой конформации RBD на С-конце S1 недоступны для связывания с рецептором, что позволяет предположить, что конформационные изменения необходимы для экспонирования RBD. Недавно была получена частичная крио-ЭМ структура эктодомена S белка SARS-CoV, которая содержала один из трех RBD, повернутых в доступную для рецептора конформацию (20). Эта конфигурация тримера может представлять начальное промежуточное состояние, хотя многие вопросы остаются без ответа, например, почему вращается только один из RBD.

Как первичный гликопротеин на поверхности вирусной оболочки, S-белки являются основной мишенью нейтрализующих антител, вызванных естественной инфекцией, и являются ключевыми антигенами в экспериментальных вакцинах-кандидатах (11, 21, 22). Однако эктодомен S-белка из БВРС-КоВ менее стабилен и его труднее продуцировать, чем другие S-белки, и растворимые конструкции RBD были в центре внимания структурных исследований (14, 16), усилий по выделению антител (21, 23). ⇓ – 25) и разработка субъединичной вакцины (26).Недостатком этого подхода является то, что коронавирусы могут легко генерировать мутации ускользания антител в RBD (23, 27, 28). Таким образом, использование смеси антител, в том числе некоторых, направленных против эпитопов, не связанных с RBD, является предпочтительной стратегией (29) и успешно применяется для лечения болезни, вызванной вирусом Эбола (30). Однако из-за сложности получения S-белков БВРС-КоВ, стабилизированных до слияния, описано несколько антител, не относящихся к RBD, и меньше известно об их эпитопах. Антитела против конформации стебля S2 до слияния особенно привлекательны, поскольку стебель более консервативен, чем кэп S1.Следовательно, способность продуцировать стабилизированные до слияния S-белковые эктодомены из высокопатогенных коронавирусов в сочетании со структурной характеристикой эпитопов, не относящихся к RBD, которые распознаются мощными нейтрализующими антителами (31), значительно облегчила бы разработку широких защитных вмешательств для текущих и новые коронавирусы. Подобные подходы в настоящее время разрабатываются для ВИЧ-1 и гриппа (32⇓ – 34). Примечательно, что идентификация стволовых антител против НА гриппа (35) представляет собой сдвиг парадигмы в подходе к разработке универсальной противогриппозной вакцины, причем недавние исследования продемонстрировали значительные перспективы (33, 34).

В этом исследовании мы рационально разработали общую стратегию сохранения белков бета-коронавируса S в конформации до слияния. Стабилизированный перед слиянием белок S БВРС-КоВ (MERS S-2P) сохранял высокоаффинное связывание со своим димерным рецептором DPP4 и панелью нейтрализующих антител и вызывал высокие титры нейтрализующих антител у мышей. Конструкция MERS S-2P также способствовала одночастичным крио-ЭМ исследованиям комплекса с G4, первым идентифицированным антителом, направленным против S2 MERS-CoV (31).G4 был выделен от иммунизированных мышей и показал его нейтрализующий эффект, однако его эпитоп на S2 был неизвестен. Структуры показали, что G4 распознает проксимальную к мембране поверхность вариабельной гликозилированной петли в домене коннектора S2 и избегает гликозилирования за счет своего угла подхода, который направлен вверх от вирусной мембраны. Структуры также определяют четыре конфигурации вершины тримера, которые представляют недоступное для рецептора основное состояние и три доступных для рецептора промежуточных продукта.В совокупности эти результаты продвигают наше понимание проникновения БВРС-КоВ и опосредованной антителами нейтрализации и обеспечивают основу для структурного дизайна вакцинных антигенов для высокопатогенных коронавирусов, в том числе тех, которые, как ожидается, появятся в будущем.

Результаты

Разработка белков коронавируса S, сохраняющих префузионную конформацию.

Для улучшения экспрессии и конформационной гомогенности эктодомена S-белка БВРС-КоВ мы разработали варианты, основанные на нашей ранее определенной структуре тримерного S-белка из линии A бета-коронавируса HCoV-HKU1 (18) (рис.1 A и B ). Недавняя работа над гибридными белками ВИЧ-1 и респираторно-синцитиального вируса (RSV) (32, 36, 37) продемонстрировала, что замены пролина в петле между первым гептадным повтором (HR1) и центральной спиралью ограничивают преждевременный запуск слияния. белка и часто увеличивают выходы экспрессии эктодоменов до слияния. Введение одиночных замен пролина в аналогичную область в субъединице S2 БВРС-КоВ резко увеличило уровни экспрессии эктодоменов, а две последовательные замены пролина в остатках V1060 и L1061 (далее именуемые «2P») привели к более чем 50-кратному увеличению повышение урожайности (рис.1 C и рис. S1 A ). Как свидетельствует отрицательная окраска EM, вариант 2P сохранял прототипную морфологию до слияния (фиг. 1 D ). Гомологические замены в S-белках из SARS-CoV (рис. 1 C и D и рис. S1 B ) и HCoV-HKU1 (рис. S1 B и C ) также увеличивали уровни экспрессии. эктодоменов и улучшенная конформационная однородность. Таким образом, введение двух последовательных остатков пролина в начало центральной спирали, по-видимому, является общей стратегией для сохранения белков бета-коронавируса S в прототипной конформации до слияния.

Рис. 1.

Структурная инженерия белков S MERS-CoV и SARS-CoV. ( A ) Доменная архитектура белка S HCoV-HKU1 и выравнивание последовательности спираль-поворот-спираль между гептадным повтором 1 (HR1) и центральной спиралью (CH). Два остатка, окрашенные в красный цвет, являются остатками, мутировавшими в пролин для сохранения S2 в конформации до слияния. FP, гибридный пептид; HR2, гептадный повтор 2; TM, трансмембранный домен. ( B ) Структура HCoV-HKU1 S2. Остатки, показанные в виде палочек в увеличенной области, представляют собой остатки, мутировавшие в пролин в вариантах 2P.( C ) Профили гель-фильтрации эктодоменов S-белка дикого типа (пунктирные линии) и сконструированных 2P (сплошные линии) из MERS-CoV (синий) и SARS-CoV (красный). Каждый белок был получен в результате временной трансфекции объемом 1 л. Все четыре белка экспрессировались с С-концевым доменом тримеризации фибритина Т4. Сайт фурина S1 / S2 был мутирован в MERS S-WT и MERS S-2P. ( D ) Средние двумерные классы отрицательно окрашенных MERS S-WT, MERS S-2P, SARS S-WT и SARS S-2P. Включены все частицы.Для конструкций WT видны конформации как до слияния (синие прямоугольники), так и после слияния (красные прямоугольники), тогда как для мутантов 2P наблюдается только конформация до слияния.

Рис. S1. Замены

пролина в S2 увеличивают уровни экспрессии белков коронавируса S. ( A и B ) Уровни экспрессии WT и пролин-замещенных S-белков из MERS-CoV ( A ) и SARS-CoV и HCoV-HKU1 ( B ) по оценке с помощью SDS / PAGE. ( C ) Профили гель-фильтрации WT HCoV-HKU1 S (HKU1 S-WT) и стабилизированного HCoV-HKU1 S (HKU1 S-2P).Каждый белок был получен из 500 мл клеток FreeStyle 293-F.

Чтобы исследовать влияние замен 2P на функцию S-белка, были созданы псевдовирусы MERS-CoV с WT или 2P-содержащими S-белками. В отличие от псевдовирусов WT, которые были высокоинфекционными в клетках Huh7.5, экспрессирующих DPP4, псевдовирусы, содержащие замены 2P в S-белке, были по существу неинфекционными (рис. 2 A ). Это отсутствие инфекционности, вероятно, связано со способностью введенных пролинов предотвращать конформационные перестройки, что предположительно увеличивает энергию активации, необходимую для слияния.Однако, чтобы исключить возможность локальной неправильной упаковки в результате замен 2P, полноразмерные WT и 2P-содержащие S белки были экспрессированы на клетках 293T, а реактивность поликлональных сывороток и конформационно-зависимых антител оценивалась с помощью проточной цитометрии. (Рис.2 B ). Поликлональные сыворотки, а также нейтрализующие антитела против N-концевого домена (NTD) (mAb G2), RBD (mAb D12) и субъединицы S2 (mAb G4) одинаково хорошо реагировали с клетками, экспрессирующими WT или 2P-содержащие S-белки. .Контрольные клетки, экспрессирующие RBD, слитые с трансмембранным доменом, реагировали только с поликлональными сыворотками и антителом D12, как и ожидалось. Все три антитела также связывались с эктодоменами рекомбинантного белка S БВРС-КоВ, содержащими замены 2P (MERS S-2P), посредством «pull-down» (рис. 2 C ). Мы также определили, что MERS S-2P связывается с растворимой версией его рецептора, DPP4, с 9,4 нМ K d (рис. 2 D ), что аналогично сообщаемым значениям связывания DPP4. к изолированному RBD (14).В совокупности эти данные демонстрируют, что замены 2P предотвращают слияние, но не изменяют конформацию белка S.

Рис. 2.

Характеристика БВРС С-2П. ( A ) Псевдовирусы MERS-CoV, кодирующие репортерный ген люциферазы, получали с белками WT (S WT, синий) или 2P (S-2P, красный) S. Мок-псевдовирусы (серый цвет), не экспрессирующие S-протеин, служили контролем. Инфекционность клеток Huh7.5 определяли путем измерения RLU. Пунктирная линия представляет фоновый RLU.( B ) Связывание белков WT и 2P S, экспрессируемых на клеточной поверхности, а также связанного с мембраной RBD с поликлональными сыворотками (Poly) и моноклональными антителами, измеренное с помощью проточной цитометрии; 101F представляет собой антитело, специфичное к F RSV. ( C ) SDS / PAGE анализ совместно очищенных комплексов немеченого MERS S-2P и моноклональных антител. AM14 представляет собой антитело, специфичное к F RSV. ( D ) Связывание растворимого DPP4 с иммобилизованным MERS S-2P, измеренное с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Наилучшее соответствие данных модели привязки 1: 1 показано красным.

Иммуногенность MERS S-2P.

Для определения иммуногенности тримера MERS S-2P мы вакцинировали мышей и сравнили ответы с ответами, вызванными мономерным белком S1 и тримером S WT (31). Каждый из иммуногенов вызывал нейтрализующие антитела к аутологичному штамму БВРС-КоВ England1 дозозависимым образом. Мономеры S1 и тримеры SWT имели более крутой дозовый эффект, чем тример S-2P, который достиг плато нейтрализующей активности при более низкой дозе (рис. 3 A ).При дозе 0,1 мкг MERS S-2P проявлял значительно более сильную нейтрализующую активность, чем S1, против четырех из шести протестированных гомологичных псевдовирусов MERS-CoV. Вакцинация S-2P также вызвала большую нейтрализацию, чем вакцина S WT, против трех из шести протестированных гомологичных псевдовирусов БВРС-КоВ (фиг. 3 B ). Эти данные демонстрируют, что сохранение S БВРС-КоВ в его конформации до слияния увеличивает широту и эффективность нейтрализующей активности, вызванной вакцинацией.

Рис.3.

Иммуногенность MERS S-2P у мышей. ( A ) Реципрокная сыворотка IC 90 , нейтрализующая активность против аутологичного репортера лентивируса псевдотипа MERS England1 в зависимости от дозы вакцины. ( B ) Реципрокная сыворотка IC 90 , нейтрализующая активность против множественных гомологичных псевдовирусов БВРС-КоВ сывороток мышей, иммунизированных 0,1 мкг белка. Для обеих панелей среднее геометрическое значение титра IC 90 (GMT) каждой группы представлено символами ( A ) или столбцами ( B ).Планки погрешностей представляют собой геометрические SD. Значения P обозначены как * P <0,05 и ** P <0,01. Предел обнаружения для анализа представлен пунктирными линиями; для сывороток ниже предела обнаружения был назначен обратный титр IC 90 , равный 10.

Структура MERS S-2P, связанного с антителом G4.

Мы объединили MERS S-2P с S2-направленным G4 Fab и провели крио-ЭМ одиночных частиц полученных комплексов, чтобы структурно охарактеризовать наш иммуноген и предоставить информацию на атомном уровне, необходимую для будущих инженерных работ (рис.4 A , рис. S2 и таблицы S1 и S2). Мы наблюдали несколько отдельных субпопуляций белков S, которые различались расположением вершины S1, и эти субпопуляции обрабатывались отдельно, как более подробно описано ниже. Кроме того, карты плотности крио-ЭМ были хуже разрешены в областях S1 NTD, как это было в случае недавно определенной структуры белка SARS-CoV S (20). В результате мы кристаллизовали этот домен и определили его структуру до 2,0 Å, используя часть крио-ЭМ карты в качестве «поисковой модели» для молекулярного замещения (рис.S3 и Таблица S3). Мы также кристаллизовали и определили структуру несвязанного G4 Fab до 1,57 Å (Таблица S3), и обе эти рентгеновские структуры были использованы в дальнейшем уточнении моделей, полученных из крио-ЭМ.

Рис. 4.

Структура БВРС-КоВ S-2P в комплексе с G4 Fab. ( A ) Структура эктодомена MERS S-2P в комплексе с G4 Fab, если смотреть вдоль ( слева, ) и выше ( справа, ) вирусной мембраны. Один протомер тримерного S-белка показан в виде ленты и окрашен, как на диаграмме первичной структуры.Два оставшихся протомера показаны в виде молекулярных поверхностей и окрашены в белый и серый цвета. CD, коннектор домена; CH — центральная спираль; Fd — домен тримеризации Фолдона; СД-1, подобласть 1; SD-2, субдомен 2. ( B и C ) Увеличенное изображение сайтов протеазы S1 / S2 ( B ) и S2 ‘( C ). Пунктирные линии представляют собой неупорядоченные остатки. Стрелки указывают положение расщепления протеазой.

Рис. S2.

Крио-ЭМ обработка данных. Данные были отсортированы и уточнены согласно блок-схеме.В частности, чтобы устранить неоднородность конфигураций RBD в нашем наборе данных, мы использовали метод сортировки данных, который включает вычитание областей постоянной плотности из наших исходных данных с последующей локальной классификацией полученных проекционных изображений.

Таблица S1.

Сбор данных Cryo-EM

Таблица S2.

Крио-ЭМ обработка и проверка модели

Рис. S3.

Кристаллическая структура НТД MERS-CoV S1. ( A ) Структура NTD MERS-CoV S1 может быть разделена на верхнюю, центральную и нижнюю области (86).Два β-листа ядра NTD окрашены в зеленый и пурпурный цвета, а остальная часть NTD — в голубой. ( B ) Структура NTD окрашена в виде радуги от синего до красного, от N до C конца соответственно. ( C ) Хроматограмма экстрагированного иона (экстрагированная теоретическая масса 442,15 при 5 м.д.), МС и МС / МС спектры лиганда, выделенного из очищенного NTD БВРС-КоВ. Концентрированный NTD нагревали при 98 ° C в течение 10 мин и денатурированный белок осаждали центрифугированием. Супернатант обессоливали и анализировали, как описано ранее (87), на масс-спектрометре Q Exactive Plus с модификацией, согласно которой ионы +1 также отбирались для фрагментации.Анализ данных проводился в QualBrowser. ( D ) Хроматограмма экстрагированных ионов (теоретическая масса извлеченной 442,15 при 5 м.д.), МС и МС / МС спектры очищенной фолиевой кислоты (Sigma), ресуспендированной в 5% метаноле и 1% муравьиной кислоте и проанализированных, как описано выше. ( E ) Химическая структура фолиевой кислоты. ( F ) Кристаллическая структура NTD MERS-CoV S показана в виде ленты с картой Fo-Fc до размещения и уточнения фолиевой кислоты, показанной на 2,0 сигма (серая сетка). Фолиевая кислота (показана в виде палочек) была смоделирована для этой плотности и использована для дальнейшего структурного уточнения.Атомы кислорода красные, а атомы азота синие.

Таблица S3.

Сбор кристаллографических данных и статистика уточнения

В целом структура белка S-2P MERS подобна ранее определенным структурам до слияния белков альфа- и бета-коронавируса S (17–20). Наши модели состоят из остатков 18–1223 и, подобно другим структурам, лишены второго гептадного повтора в S2, который может быть гибким в отсутствие липидного бислоя. Субъединица S2 MERS-CoV устроена так же, как и другие субъединицы S2 коронавируса, со среднеквадратичными значениями ∼1.5 Å для общего ядра из ∼260 атомов Cα. Для эффективного инфицирования клеток-мишеней белку S БВРС-КоВ требуется двухэтапная протеазно-опосредованная активация для облегчения слияния мембран. Расщепление фурина на стыке S1 / S2 происходит в вирус-продуцирующей клетке, тогда как расщепление на сайте S2ʹ перед гибридным пептидом происходит во время проникновения вируса на поверхность клетки или в эндосомы и может опосредоваться несколькими протеазами, включая фурин. , TMPRSS2 и катепсин L (11, 13, 38). Однако непонятно, почему фурин может получать доступ к сайту S1 / S2, но не к сайту S2ʹ во время биосинтеза белка.Сайт фурина S1 / S2 (RSVR), который остается нерасщепленным в нашей конструкции из-за мутагенеза (ASVG), расположен на доступной петле, подверженной воздействию растворителя, которая неупорядочена в наших структурах (Fig. 4 B ). Напротив, сайт S2ʹ (RSAR) менее открыт, особенно Arg887 в положении P1, который взаимодействует с Asp892 и Phe895 в слитом пептиде (фиг. 4 C ). В нашей структуре пептидная связь между Arg887 и Ser888 остается недоступной для протеаз, предполагая, что S2ʹ не может быть эффективно расщеплен до тех пор, пока не произойдет конформационное изменение в S2 во время процесса слияния.Повторная укладка HR1 после связывания DPP4 и отщепления S1 может вызвать такое изменение и связывать конечный этап протеолитической активации с прикреплением клетки-хозяина, тем самым гарантируя, что необратимая повторная укладка S2 происходит в нужное время и в нужном месте. Действительно, инкубация вирионов БВРС-КоВ с растворимым рецептором DPP4 увеличивает эффективность расщепления фурином по сайту S2ʹ (13).

Структуры S2 БВРС-КоВ также содержат хорошо разрешенный домен (остатки 1152–1223), расположенный между HR1 и HR2, который не был полностью разрешен в связанных белковых структурах бета-коронавируса HCoV-HKU1, MHV и SARS-CoV S, но был наблюдается в структуре белка альфа-коронавируса HCoV-NL63 S (17⇓⇓ – 20).Этот соединительный домен содержит эпитоп для G4, который является первым описанным S2-специфическим антителом, которое нейтрализует БВРС-КоВ (31). Локальное разрешение карт, используемых для анализа интерфейса антитела с S2, превышает 3,7 Å. Большая часть эпитопа G4 (710 Å 2 из 880 Å 2 общей скрытой площади поверхности) состоит из гликозилированной, открытой для растворителя петли, которая выходит из двух β-цепей и окружена определяющими комплементарность областями ( CDR) G4 (рис.5 А ). Связывание G4 было субстехиометрическим, что позволяло сравнивать связанный и несвязанный эпитоп G4. В несвязанных протомерах петля была плохо упорядочена, что свидетельствует о ее гибкости в растворе (рис. S4). Arg1179 является критическим для связывания G4, так как он образует катион-π-взаимодействие с HCDR2 Tyr53, а также солевой мостик с HCDR1 Asp31 (Fig. 5 B ). Кроме того, связывание G4 приводит к образованию двух гидрофобных ядер, которые включают остатки S2 вне удлиненной петли.Эти взаимодействия могут стабилизировать коннекторный домен, который, вероятно, является гибким, учитывая плохо разрешенную плотность, наблюдаемую в других структурах белка S бета-коронавируса.

Рис. 5.

G4 распознает переменную петлю в области коннектора S2. ( A ) Структура G4 Fab, связанного с вариабельной петлей, содержащейся в субъединице S2. Остатки 1171–1187 MERS S-2P показаны в виде ленты с боковой цепью Asn1176 и двумя присоединенными фрагментами N -ацетилглюкозамина, показанными в виде полосок.Вариабельные домены G4 показаны в виде молекулярной поверхности. ( B ) Интерфейс привязки G4. Боковые цепи взаимодействующих остатков показаны в виде полосок, а остатки, замещенные в вариантах G4-escape, окрашены в оранжевый цвет. Черная пунктирная линия обозначает соляной мостик. ( C ) Выравнивание последовательностей изолятов БВРС-КоВ (зеленый) и других бета-коронавирусов линии С (коричневый). Жирным шрифтом обозначены сайты гликозилирования, связанные с N и . ( D ) Вид сбоку одного протомера S2, связанного с G4 Fab.Справа S2 показан как поверхность молекулы и окрашен в соответствии с консервацией последовательности, определенной сервером ConSurf с использованием 66 различных последовательностей коронавируса (85).

Рис. S4.

G4 Fab заполняемость. ( A и B ) Данные MERS S-2P / G4 содержали два стехиометрических класса G4. Большинство данных (69,6%) содержали два G4 Fab, связанных со спайком MERS S-2P ( A ), а остальные данные (30,4%) содержали три связанных G4 Fab ( B ). ( C и D ) Стереоизображения эпитопа G4.Эпитопы, которые имеют связанные Fab G4 ( C ), являются хорошо упорядоченными, тогда как эпитопы, которые остаются несвязанными ( D ), имеют неупорядоченную петлю.

Хотя эпитоп G4 содержится в относительно консервативной субъединице S2, открытая петля, с которой он в первую очередь связывается, варьирует как по последовательности, так и по длине, даже среди бета-коронавирусов линии C (фиг. 5 C и D ). Вариабельность этой петли напоминает вариабельные петли, обнаруженные в gp120 ВИЧ-1, которые возникают в результате давления, оказываемого ответом антител хозяина.Действительно, мы смогли выделить варианты ускользания БВРС-КоВ путем выращивания вируса в присутствии G4, и мутации ускользания (T1175I / P, R1179G / M / T и S1185L) накапливались внутри и вокруг этой вариабельной петли (рис. 5 B и Таблица S4). Помимо вариабельности последовательности и длины, эта петля всегда содержит по крайней мере один потенциальный N -связанный сайт гликозилирования (рис. 5 C ), который, как и вариабельные петли gp120 ВИЧ-1, помогает экранировать открытую петлю. от распознавания антител.G4 обходит гликановую маску за счет своего угла подхода, который направлен вверх от вирусной мембраны (Fig. 4 A ). Это позволяет G4 распознавать сторону петли, проксимальную к мембране, и избегать гликановых фрагментов, прикрепленных к Asn1176. Требование этого ограниченного подхода, вероятно, происходит за счет аффинности связывания, поскольку G4 имеет более высокое сродство к дегликозилированному MERS S-2P (рис. S5). Поскольку эта петля вариабельна среди бета-коронавирусов, она, вероятно, должна быть устранена в антигенах вакцины, разработанных для того, чтобы вызывать нейтрализующий ответ против S2.В качестве доказательства концепции мы экспрессировали вариант MERS S-2P, в котором эта петля была заменена линкером Gly-Ser. Этот вариант экспрессируется на сопоставимых уровнях с белком MERS S-2P, но имеет значительно сниженное связывание с G4 (фиг. S5). Добавление одного или более N -связанных сайтов гликозилирования в усеченную петлю могло бы дополнительно помочь защитить эту область от распознавания антителом. В совокупности эти данные идентифицируют вариабельную петлю в S2, которая, вероятно, находится под иммунным давлением и может быть удалена, чтобы потенциально избежать вирус-специфических ответов антител в вакцинном антигене, разработанном для обеспечения защиты от нескольких коронавирусов.

Рис. S5. Сродство

G4 Fab, измеренное калориметрическим методом изотермического титрования. ( A C ) Данные ITC по связыванию G4 Fab с MERS S-2P ( A ), дегликозилированным MERS S-2P ( B ) и мутировавшим вариабельную петлю MERS S-2P ( С ). Красные линии представляют собой наилучшее соответствие данных модели с одним узлом привязки. Схема последовательности и вторичной структуры для переменного цикла показана над титрами.

Конформации белка S, доступного для рецепторов.

Как упоминалось выше, во время наших крио-ЭМ исследований мы наблюдали отдельные субпопуляции белков S, которые различались расположением вершины S1, и обработка этих субпопуляций по отдельности выявила четыре различных конфигурации коронки S1 (Рис.6 A , Рис. S6 и фильмы S1 и S2). Мы идентифицировали небольшую субпопуляцию данных крио-ЭМ (5,4%) в плотно упакованной «закрытой» конформации, что указывает на то, что ни замены 2P, ни связывание G4 не препятствуют отбору образцов этой конформации.В самом деле, замены 2P не взаимодействуют с RBD и позволяют Arg1057 в HR1 поддерживать свое взаимодействие с Tyr577 в RBD (Fig. 6 B ). В оставшихся трех субпопуляциях наших крио-ЭМ данных (всего 94,6%) наблюдаются «открытые» тримеры с одним, двумя или тремя RBD в «внешней» конформации, которая простирается от спайка и не взаимодействует с S2 или гликозилированная поверхность соседних NTD (рис. 6 A и C ). В этой расширенной конфигурации детерминанты связывания рецептора выставлены на вершине комплекса и полностью доступны для взаимодействия с DPP4 (рис.6 D ).

Рис. 6. Конформации

RBD, наблюдаемые в S-белке БВРС-КоВ. ( A ) Вид сверху и сбоку четырех структур MERS S-2P, определенных с помощью крио-ЭМ одиночных частиц. Каждый имеет уникальное расположение трех RBD (зеленый). Процент частиц в наборе данных, принадлежащих каждой из четырех структур, показан под структурами. ( B ) Взаимодействие между RBD (зеленый) и спиралью-петлей-спиралью S2, охватывающей центральную спираль (оранжевый) и HR1 (желтый).Два пролина, введенные в S2, показаны в виде стержней, как и боковые цепи взаимодействующих остатков в RBD и HR1. Электронная плотность показана в виде прозрачной поверхности. ( C ) Наложение одного протомера с RBD «внутрь» и другого протомера с RBD «на выходе». ( D ) Наложение кристаллической структуры RBD-DPP4 (код PDB ID 4KR0) на тримеры с тремя входами RBD ( слева, ) или двумя входами RBD и одним выходом RBD ( справа, ). Существенные конфликты препятствуют связыванию DPP4 до тех пор, пока RBD не повернется наружу.

Рис. S6.

Соответствие MERS-CoV S RBD. ( A ) MERS-CoV S предполагает как открытые (DPP4-доступные), так и закрытые (DPP4-недоступные) конформации. Небольшая часть данных (5,4%) демонстрирует закрытую конформацию, характеризующуюся наличием всех трех RBD «внутри». Большинство наших данных (94,6%) относится к открытой конформации, характеризующейся наличием по крайней мере одного RBD «вне». Лишь очень небольшая часть данных (0,3%) содержит все три RBD «вне». ( B ) Плотность, соответствующая RBD, окрашена в зеленый цвет и показана «дюйм.”( C ) Плотность, соответствующая RBD, окрашена в зеленый цвет и показана« вне ». ( D ) Наложение одного протомера с RBD «внутрь» и другого протомера с RBD «снаружи».

Четыре конфигурации тримеров, наблюдаемые в наших данных, предполагают потенциальный механизм индуцированного рецептором запуска, который включает последовательную активацию протомеров. В этой модели мы предполагаем, что связывание DPP4 с временно экспонированными RBD функционирует как молекулярный храповик, который приводит тример к открытой конформации с тремя RBD-out (рис.7). Эта конформация, вероятно, внутренне нестабильна, потому что RBDs больше не помогают опосредовать тримеризацию S1 или стерически ингибировать рефолдинг S2, сидя на вершине центральной спирали. В поддержку этой модели отметим, что конформация с тремя выходами RBD наблюдается только в 0,3% наших крио-ЭМ данных. Потребуются дальнейшие эксперименты, чтобы проверить эту предложенную модель индуцированного рецепторами запуска, но последовательная активация протомеров в слитом белке класса I недавно была продемонстрирована для вируса лейкемии мышей Молони (39).

Рис. 7.

Упрощенная модель связывания DPP4, приводящего к срабатыванию БВРС-КоВ S. Модель утверждает, что все три RBD находятся в состоянии равновесия между доступной для рецептора «внешней» конформацией и плотно упакованной, недоступной для рецептора «внутренней» конформацией. Связывание DPP4 действует как молекулярный храповик, который блокирует RBD в конформации «вне» до тех пор, пока не будут связаны все три RBD. Эта открытая конформация тримера нестабильна, и субъединицы S1 в конечном итоге диссоциируют от S2. Как только субъединицы S2 больше не ограничиваются S1, слияние мембран может происходить посредством промежуточного звена перед шпилькой.Протомеры MERS-CoV S окрашены в розовый, синий и зеленый цвета, а неразрешенная область HR2 изображена пунктирной линией. Димерный DPP4 окрашен в оранжевый цвет.

Обсуждение

Примерно одна треть инфекций БВРС-КоВ закончились смертельным исходом, что делает его наиболее смертоносным коронавирусом, описанным на сегодняшний день (40). Белок S MERS-CoV, который опосредует связывание рецепторов и слияние мембран, является основной антигенной мишенью для разработки вакцин против коронавируса (22). Введение двух последовательных замен пролина в начале центральной спирали — наша конструкция 2P — представляет собой общий подход к получению растворимых префузионных эктодоменов коронавируса S и преодолевает первое препятствие в разработке субъединичной вакцины.Из-за ограниченных углов скручивания основной цепи замена пролина может препятствовать повторной укладке линкера между центральной спиралью и HR1, что для слитых белков класса I является ключевым шагом в переходе к постфузионной конформации (41). Жесткость спирали-петли-спирали, обеспечиваемая пролинами, ослабляет или отменяет активность слияния мембран S белка, как показано на Рис. 2 A . Подобные результаты были получены, когда пролины были заменены на HA гриппа (42), и поскольку слитые белки класса I имеют аналогичный механизм слияния мембран, замена пролина нашла широкое применение при разработке субъединичных вакцин.Для Env ВИЧ-1 замена I559P в gp41 помогла получить стабильный тример эктодомена, обозначенный «SOSIP» (32), что облегчило структурный анализ с высоким разрешением этой критической мишени вакцины (43–45). Для RSV замена S215P в гликопротеине слияния (F) значительно увеличивала выход и стабильность тримеров эктодомена до слияния (36). Это согласуется с нашими выводами для белка S БВРС-КоВ, где конструкция 2P привела к> 50-кратному увеличению выхода тримерного белка S в его антигенно нативной конформации до слияния (рис.1 С ). В отличие от других методов инженерии на основе структуры, таких как введение дисульфидных связей или мутации, заполняющие полости (46), информация на атомном уровне не так важна для инженерии на основе пролина, и структура гомологичного белка с низкой идентичностью последовательности может служат шаблоном (рис. 1 A и B ). Таким образом, стратегия на основе пролина должна быть полезной для разработки вакцин-кандидатов против появляющихся коронавирусов, структуры которых еще не определены.

Наши исследования также охарактеризовали взаимодействие первого в своем классе нейтрализующего антитела (G4), направленного против субъединицы S2, которая более консервативна, чем кэп S1 (31). Предыдущее картирование сайтов нейтрализации белков коронавируса S было сосредоточено на RBD. Однако для RBD-специфических mAb был описан уход от нейтрализации, и было высказано предположение, что более широкий охват эпитопов за пределами RBD может улучшить защиту от заражения MERS-CoV (31). Эпитоп G4 в значительной степени консервативен между различными изолятами БВРС-КоВ, и, таким образом, G4-подобные антитела представляют собой привлекательный класс перекрестно-реактивных антител против БВРС-КоВ для терапевтического использования.Однако эпитоп G4 варьирует среди более крупного семейства бета-коронавирусов (рис. 5 C ), что позволяет предположить, что он подвержен иммунному давлению. Для других коронавирусов, таких как MHV и SARS-CoV, были выделены S2-направленные антитела, которые распознают эпитопы, содержащие слитый пептид (47, 48), который относительно консервативен среди коронавирусов. Антитело, которое распознает эту область стебля S2 таким образом, чтобы избежать большей части вариабельности окружающих последовательностей, может в целом нейтрализовать различные коронавирусы.Недавно были описаны мощные антитела, направленные против гибридного пептида Env ВИЧ-1 (49, 50), что дает надежду на то, что аналогичные антитела для коронавирусов также могут быть получены с помощью усилий по выделению антиген-специфических антител. Использование наших сконструированных префузионных S-белков в качестве зондов для сортировки В-клеток от инфицированных доноров должно значительно облегчить эти усилия и привести к разработке широкого защитного иммунотерапевтического средства.

В наших структурах тримерного префузионного белка S MERS-CoV мы наблюдаем ноль, один, два или три RBD, повернутых в доступное для рецептора положение «вне» (рис.6). Мы предполагаем, что эта гибкость воздействия RBD играет роль в контролируемом времени взаимодействия рецепторов, что в конечном итоге приводит к запуску S в направлении постфузионного состояния с более низкой энергией (Рис. 7). Кроме того, временное воздействие RBD, которые обладают высокой иммуногенностью, помогло бы скрыть нейтрализующие эпитопы от гуморальной иммунной системы. Эта «конформационная маскировка» нейтрализующих эпитопов была также описана для Env ВИЧ-1 (51), который, как и белки S коронавируса, существует в нескольких различных конформациях: закрытое основное состояние, доступное для CD4 и доступное для CCR5 (52).Для коронавирусов на этот феномен намекали в частично разрешенной структуре белка SARS-CoV S, где один RBD наблюдался в доступной для рецептора конформации «вне» (20). Было показано, что в структурах S-белков из MHV и HCoV-HKU1 все три RBD находятся в плотно упакованной, закрытой конфигурации (17, 18). MHV spike может не нуждаться в временном воздействии на RBDs, так как он связывается со своим белковым рецептором CEACAM1 через S1 NTD (53–55), и этого взаимодействия, как полагают, достаточно для входа (56).Для HCoV-HKU1 белковый рецептор еще не идентифицирован, но было показано, что субъединица S1 связывает O -ацетилированные сиаловые кислоты (57). Следовательно, необходимы дополнительные структурные и вирусологические исследования для выяснения молекулярных механизмов опосредованного S-белком проникновения в клетки.

Конструирование вирусных слитых белков класса I в префузионной конформации может значительно повысить иммуногенность за счет сохранения чувствительных к нейтрализации конформационных и четвертичных эпитопов.Это подтверждается неэффективностью вакцинных антигенов гликопротеина RSV F после слияния и перспективой получения стабилизированных до слияния гликопротеинов F RSV (36, 46, 58). Недавно было показано, что мономер S1 БВРС-КоВ вызывает у мышей RBD-специфические нейтрализующие антитела и защищает макак-резус от пневмонии, вызванной БВРС-КоВ, но защита была улучшена у животных, примированных полноразмерными S-антигенами, которые индуцировали нейтрализующие антитела, направленные против на сайты, не относящиеся к RBD (31). Эти данные, вместе с наблюдением, что RBD имеет позиционную вариабельность, предполагают, что вирус развил несколько механизмов, позволяющих уклоняться от нейтрализации RBD-специфическими антителами.Вариабельность последовательности RBD усугубляется позиционной вариабельностью, которая позволяет маскировать конформацию и временное воздействие на четвертичные поверхности и сайты, чувствительные к нейтрализации. Наша демонстрация здесь того, что стабилизированный до слияния тример S БВРС-КоВ (S-2P) вызывает более устойчивые нейтрализующие реакции антител у мышей, чем мономер S1 или S WT, предполагает, что MERS S-2P является предпочтительным антигеном для разработки вакцины и становится более привлекательным. из-за включения эпитопов, не относящихся к RBD, и благоприятных производственных характеристик.

Таким образом, наша конструкция 2P, структуры эктодомена БВРС-КоВ в комплексе с G4 и демонстрация улучшенной экспрессии и иммуногенности префузионных S-белков послужат основой для дальнейшей разработки иммуногенов вакцины БВРС-КоВ и обеспечат важный шаг в разработке вакцины против коронавируса с широкой защитой.

Методы

Продукция эктодоменов S-белка.

Был синтезирован ген с оптимизированными кодонами млекопитающих, кодирующий остатки 1-1291 S MERS-CoV (штамм England1) с С-концевым доменом тримеризации фибритина Т4, сайтом расщепления HRV3C, 8xHis-меткой и Twin-Strep-tag. и субклонировали в вектор экспрессии эукариот pαH.Сайт узнавания фурина S1 / S2 748-RSVR-751 был мутирован в ASVG для получения одноцепочечного белка S0.

На основе этой конструкции была создана серия пролин-замещенных вариантов, и полученные плазмиды были трансфицированы в 40 мл клеток FreeStyle 293-F (Invitrogen). Через три часа после трансфекции добавляли кифунензин до конечной концентрации 5 мкМ. Культуры собирали через 6 дней, и секретированный белок очищали из супернатанта с использованием 0,5 мл смолы Strep-Tactin (IBA).Затем уровни экспрессии белка оценивали с помощью SDS / PAGE (10 мкл связанной с белком смолы кипятили и загружали на дорожку). Аналогичные стратегии были использованы для создания и тестирования пролин-замещенных вариантов SARS-CoV S (штамм Tor2, остатки 1–1190) и HCoV-HKU1 S (штамм N5, остатки 1–1276).

Для крупномасштабной экспрессии трансфецировали 0,5–1 л клеток FreeStyle 293-F. Через три часа после трансфекции добавляли кифунензин до конечной концентрации 5 мкМ. Культуры собирали через 6 дней, и белок очищали из супернатанта с использованием смолы Strep-Tactin (IBA).К белку добавляли протеазу HRV3C (1% мас. / Мас.) И реакционную смесь инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Расщепленный белок дополнительно очищали с использованием колонки Superose 6 16/70 (GE Healthcare Biosciences).

Производство G4 Fab.

Fab-область тяжелой цепи G4 была слита с сайтом расщепления HRV3C и фрагментом Fc человеческого IgG1 и субклонирована в эукариотический вектор экспрессии pVRC8400. Эту плазмиду котрансфицировали легкой цепью G4 в клетки Expi293 (Invitrogen), и секретируемое антитело очищали с использованием агарозы с протеином A (Fisher).К белку добавляли протеазу HRV3C (1% мас. / Мас.) И реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Расщепленное антитело снова пропускали через агарозу с белком A для удаления Fc-фрагмента, и несвязанный Fab дополнительно очищали с использованием колонки Superdex 75 (GE Healthcare Biosciences).

Производство МЭРС С-2П в комплексе с G4 Fab.

Очищенный MERS S-2P смешивали с 1,5-кратным молярным избытком G4 Fab. После инкубации на льду в течение 1 ч комплекс отделяли от избытка Fab с помощью эксклюзионной хроматографии.

Негативное пятно EM.

Белки MERS-CoV и SARS-CoV S-2P при необходимости разбавляли трис-буферным физиологическим раствором, а затем наносили на медные сетки 400 меш и окрашивали 1% уранилацетатом. Сетки получали изображение с помощью Tecnai T12 Spirit с высоким напряжением 120 кВ и дополнительной металлооксидной полупроводниковой камеры Tietz TemCam-F416 при увеличении 52000 ×, что дает размер пикселя 2,05 Å на пиксель при 1,5 мкм в фокусе. Изображения были собраны с помощью Leginon (59) и обработаны в рабочем процессе Appion (60).Проекционные изображения были взяты из необработанных микрофотографий с использованием подхода разности Гаусса (61). Изображения были разделены на два, а затем выровнены с использованием безреференсной двухмерной классификации с итеративным многомерным статистическим анализом / многореферентным выравниванием (62) для идентификации и удаления аморфных проекционных изображений из стопок изображений. Затем стеки изображений были преобразованы в 16 классов, представляющих весь очищенный стек.

Крио-ЭМ-сбор данных.

Примерно 3 мкл комплекса MERS S-2P / G4 Fab смешивали с 1 мкл 0.04% раствор амфипола A8-35 (Anatrace) непосредственно перед нанесением образца на сетку CF-2 / 2-4C C-Flat (Protochips; Electron Microscopy Sciences), прошедшую плазменную очистку в течение 5 с с использованием смеси Ar / O 2 (Плазменная система Gatan Solarus 950). Затем сетку промокали и погружали в жидкий этан с помощью ручного замораживающего поршня. Восемьсот тринадцать микрофотографий были собраны за один сеанс с помощью программного решения Leginon на FEI Titan Krios, работающем при 300 кВ и установленном с прямым электронным детектором Gatan K2 (59).Каждая микрофотография была собрана в режиме счета при номинальном увеличении 29000 ×, что привело к калиброванному размеру пикселя 1,02 Å на уровне объекта. Использовалась мощность дозы ~ 10 e на (пиксель камеры) в секунду, и каждый кадр фильма был захвачен при времени экспозиции 200 мс. Общая доза для каждой микрофотографии фильма составляла 66 e / Å 2 . Номинальный используемый диапазон расфокусировки составлял от -0,7 до -2,5 мкм.

Крио-ЭМ обработка данных.

Кадры на каждой микрофотографии фильма были выровнены и суммированы с помощью MotionCorr (63).Затем была проведена оценка CTF с использованием CTFFind3 (64), а возможные проекционные изображения MERS S-2P / G4 были идентифицированы с использованием подхода разности Гаусса (61). Затем была проведена безреференсная двухмерная классификация в RELION версии 1.4 (65). После двухмерной классификации 37 180 хороших проекционных изображений были улучшены асимметрично (разрешение 4,0 Å), а также при ограничении C3 (разрешение 3,6 Å) по сравнению с эталонной картой отрицательных пятен, визуализированной с разрешением 60 Å. Проекционные изображения и асимметрично уточненная карта были введены в классификацию RELION 3D, в результате чего были выделены три класса с двумя связанными копиями G4 Fab, но с разными конфигурациями коронки S1 (разрешение 4.7 Å, 4,8 Å и 5,0 Å). Четвертый класс данных характеризовался наличием трех связанных копий G4 Fab (разрешение 4,5 Å). Этот последний класс данных был дополнительно уточнен при ограничении симметрии C3 (разрешение 4,0 Å). Поскольку плотность, соответствующая коронке S1, все еще демонстрировала больший беспорядок, чем в других отношениях хорошо упорядоченные классы данных, была проведена процедура локальной классификации (рис. S2). Здесь были созданы три маски, каждая из которых охватывает как «входящую», так и «выходную» конфигурацию RBD в соответствующих позициях RBD.Применяя каждую из этих масок в отдельных параллельных протоколах классификации, в каждом случае получали разделение области однородной плотности от области неоднородной плотности. Затем было получено вычитание однородной плотности из необработанных проекционных изображений путем проецирования карты однородной плотности в соответствии с направлениями Эйлера проекционного изображения, уже полученными в результате уточнения. Полученные в результате изображения проекции локальной плотности RBD затем были подвергнуты классификации RELION 3D с использованием карты однородной плотности (отсутствие плотности в области RBD, которая должна быть классифицирована) в качестве затравки.В каждом из трех случаев это привело к появлению двух классов данных, соответствующих позиции RBD «вход» или «выход». Затем исходные необработанные изображения проекции были перекомпилированы в четыре конформационно чистых класса данных, соответствующих трем RBD «вход», двум RBD «вход» и одному RBD «выход», одному RBD «вход» и двум RBD «выход» и трем RBD «. вне.» Проекционные изображения асимметричных классов были повернуты для правильного совмещения (0 °, 120 ° или 240 ° Эйлера) перед дальнейшим уточнением. Каждый из четырех классов был индивидуально уточнен относительно справочной карты в 60 Å, смоделированной из нашей координатной сборки MERS S-2P, но без включения каких-либо координат RBD (результирующее разрешение карты 4.0 Å, 4,6 Å, 4,8 Å и 11,5 Å). Симметричные классы (три RBD «вход» или три RBD «выход») были первоначально уточнены асимметрично, чтобы подтвердить правильную классификацию положений «вход» и «выход», прежде чем дальнейшее уточнение наложило ограничение C3. Все разрешения были оценены по критерию FSC 0,143 в RELION с использованием маски с мягкими краями и спадом по Гауссу, охватывающей целые структуры и скорректированной на корреляции масок.

Построение и уточнение крио-электромагнитных моделей.

Исходная модель MERS S-2P была получена с помощью инструмента моделирования гомологии MODELLER (66) в UCSF Chimera (67) с использованием HCoV-HKU1 S (код PDB ID 5I08) в качестве шаблона.Значительное ручное ремоделирование, а также создание de novo домена S2, который соединяет центральную спираль с HR2, было выполнено в Coot (68). Рентгеновские структуры для MERS S1 NTD и MERS S1 RBD (код PDB ID 4KR0) были использованы для замены соответствующих областей (RBD добавлен только в модели, где это необходимо), и полученная модель гомологии была объединена с рентгеновскими структурами G4 Fab. . Полученные модели затем итеративно уточнялись и вручную перестраивались по соответствующим картам плотности (без ремоделирования доменов S1 NTD или RBD) с использованием итеративного локального уточнения Rosetta (69) и Coot.Затем все атомное уточнение Rosetta было выполнено по модульному принципу, при этом хорошо разрешенные области уточнялись при небольших ограничениях, а области с более высоким B-фактором уточнялись при постепенно более строгих ограничениях. Добавление лигандов и дальнейшее уточнение проводили в Rosetta с использованием соответствующих карт плотности в качестве ограничений (70) и уточняли в PHENIX (71). Модели оценивались с использованием MolProbity (реализация командной строки oneline-analysis) (72) и EMRinger (реализация командной строки) (73) и Privateer (реализация командной строки) (74) и CARP (веб-сервер) (75), где это было необходимо.

Производство MERS-CoV S1 NTD.

Ген, кодирующий NTD S1 MERS-CoV (остатки 1–353) с С-концевым сайтом расщепления HRV3C и Fc-фрагментом человеческого IgG1, вставляли в эукариотический вектор экспрессии pαH. Через три часа после временной трансфекции плазмиды в клетки FreeStyle 293-F добавляли кифунензин до конечной концентрации 5 мкМ. Через 6 дней супернатант пропускали через колонку с агарозой с протеином А и проводили дегликозилирование на колонке путем добавления EndoH (10% мас. / Мас.) При комнатной температуре.Через 12 ч колонку промывали PBS и элюировали NTD, инкубируя смолу с HRV3C (1% мас. / Мас.). NTD дополнительно очищали с использованием колонки Superdex 75 (GE Healthcare Biosciences).

Кристаллизация и сбор рентгеновских данных.

Очищенный Fab G4 концентрировали до 9,5 мг / мл в TBS (2 мМ Трис, pH 8,0 и 50 мМ NaCl) для кристаллизации. Кристаллы получали при комнатной температуре с использованием метода диффузии паров в режиме «сидя-капля» путем смешивания 0,1 мкл белка с 0.1 мкл резервуарного раствора, содержащего 0,1 M MES, pH 6,5, 0,2 M хлорида магния и 10% (вес / вес) PEG 4000. Кристаллы вымачивали в резервуарном растворе с добавлением 20% (об. / Об.) Глицерина и мгновенно замораживали в жидкий азот. Данные дифракции рентгеновских лучей были собраны на канале связи SBC 19-ID (усовершенствованный источник фотонов, Аргоннская национальная лаборатория).

Очищенный NTD БВРС-КоВ S1 концентрировали до 11,7 мг / мл в TBS для кристаллизации. Первые попадания были получены на экране Wizard Precipitant Synergy (76).Кристаллы получали при комнатной температуре с использованием метода диффузии паров сидя-капля путем смешивания 0,1 мкл белка с 0,1 мкл резервуарного раствора, содержащего 0,1 М имидазола HCl, pH 6,5, 6,6% (мас. / Мас.) PEG 8000 и 1% ( об. / об.) 2-метил-2,4-пентандиол. Кристаллы вымачивали в резервуарном растворе с добавлением 20% (об. / Об.) Глицерина и замораживали в жидком азоте. Данные дифракции рентгеновских лучей были собраны на канале SSRL BL14-1 (Стэнфордский источник синхротронного излучения, Национальная ускорительная лаборатория SLAC).

Определение и уточнение кристаллической структуры.

Дифракционные данные обрабатывались с помощью программного пакета CCP4: данные были проиндексированы и интегрированы в iMOSFLM (77), масштабированы и объединены с AIMLESS (78). Раствор молекулярной замены для данных G4 Fab был получен с использованием PHASER (79) и PDB ID 3QQ9 в качестве модели поиска. Структура была построена вручную в Coot (68) и уточнена с помощью PHENIX (71). Статистика сбора и уточнения данных представлена ​​в таблице S3.

Для набора данных NTD MERS-CoV S1 молекулярная замена с использованием структур NTD из MHV и бычьего коронавируса (BCoV) не смогла найти решения.Поэтому часть EM-карты, соответствующая NTD, была извлечена и использована в качестве модели поиска для молекулярной замены с использованием PHASER-MR в графическом интерфейсе PHENIX в соответствии с недавно опубликованным протоколом (80). Раствор содержал только одну молекулу в асимметричном звене, поэтому некристаллографическая симметрия не могла быть использована для улучшения фаз. Следовательно, основной β-лист BCoV NTD был вручную подогнан под электронную плотность, и итерационные раунды ручного построения с помощью Coot и уточнения с помощью PHENIX дали модель, содержащую 184 остатка.Используя эту структуру в качестве входных данных, MR-ROSETTA (81) смог создать модель, содержащую 282 остатка. Затем эту модель использовали в качестве исходных данных для Buccaneer (82), который создал модель, содержащую все 341 остаток. После добавления вручную N -связанных гликанов с Coot наблюдалась дополнительная электронная плотность, которая не соответствовала каким-либо химическим веществам в кристаллизационном буфере или криорастворе. Мы идентифицировали химическое вещество как фолиевую кислоту с помощью масс-спектрометрии и поместили молекулу в плотность (рис.S3). Считается, что фолиевая кислота соочистилась с NTD из экспрессионной среды млекопитающих, но остается неизвестным, играет ли фолиевая кислота или ее близкий химический аналог физиологическую роль в инфекционном цикле БВРС-КоВ. Окончательная структура была уточнена с помощью PHENIX, а статистика сбора и уточнения данных представлена ​​в таблице S3. Программное обеспечение, используемое для определения рентгеновских кристаллических структур, курировалось SBGrid (83).

Эксперименты с протеином А.

MERS S-2P коэкспрессировался с каждым антителом путем котрансфекции 10 мкг плазмиды MERS S-2P с 5 мкг плазмиды тяжелой цепи и 5 мкг плазмиды легкой цепи в 40 мл клеток FreeStyle 293-F (Invitrogen).Через три часа после трансфекции добавляли кифунензин до конечной концентрации 5 мкМ. Культуры собирали через 6 дней, и белок очищали из надосадочной жидкости с использованием 0,5 мл смолы с протеином А (Thermo Fisher). После обширной промывки PBS 10 мкл связанного с белком смолы кипятили и анализировали с помощью SDS / PAGE.

Эксперименты по поверхностному плазмонному резонансу.

8xHis-меченный белок MERS S-2P был захвачен на сенсорном чипе NTA до ~ 660 единиц ответа на каждый цикл с использованием Biacore X100 (GE Healthcare).Чип регенерировали дважды после каждого цикла, используя 350 мМ EDTA, а затем 0,5 мМ NiCl 2 . После трех инъекций рабочего буфера как в связанные с лигандом, так и в контрольные проточные кюветы вводили возрастающие концентрации растворимого эктодомена DPP4 (от 1,6 нМ до 50 нМ с конечной повторностью 12,5 нМ). Данные вычитали с двойными ссылками и соответствовали модели связывания 1: 1 с использованием программного обеспечения Scrubber2.

Иммунизация мышей.

Эксперименты на животных проводились в соответствии со всеми соответствующими правилами и политиками Национального института здравоохранения США.Национальные институты здравоохранения, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Комитет по уходу и использованию животных Центра исследований вакцин рассмотрели и одобрили все эксперименты на животных. Самок мышей BALB / cJ в возрасте 6-8 недель (лаборатория Джексона) иммунизировали белком MERS S1, MERS S WT или MERS S-2P в 0 и 3 недели. Белок (0,1 мкг, 1 мкг или 10 мкг), разведенный в PBS, смешивали в соотношении 1: 1 с системой адъювантов 2 × Sigma. Мышам прививали 100 мкл внутримышечно (по 50 мкл в каждую заднюю ногу). Через две недели после последней иммунизации сыворотки собирали для измерения ответов антител.

Производство псевдовирусов.

Эксперименты по производству, инфекционности и нейтрализации псевдовирусов были завершены, как описано ранее, с небольшими изменениями (31). Мы синтезировали кДНК, кодирующие белок-спайк, с помощью набора QuikChange XL (Stratagene) и ввели дивергентные аминокислоты в родительский ген-спайк (штамм England1), предсказанный на основе транслированных последовательностей других штаммов: Bisha1 (номер доступа в GenBank KF600620), Buraidah2 (номер доступа в GenBank). KF600630), Флорида, США2 (регистрационный номер GenBank).AIZ48760), Indiana USA1 (инвентарный номер GenBank AHZ58501), JordanN3 (инвентарный номер GenBank KC776174) и Korea002 (инвентарный номер GenBank AKL59401). Все конструкции были подтверждены с помощью секвенирования. Клетки HEK293T были получены из ATCC и культивированы в DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина при 37 ° C и 5% CO 2 . Для получения псевдовирусов MERS-CoV спайковые плазмиды CMV / R-MERS-CoV котрансфицировали в клетки HEK293T с помощью упаковывающей плазмиды pCMVDR8.2 и трансдукцию плазмиды pHR ‘CMV-Luc с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 (Promega). Мок-псевдовирусы были получены путем исключения плазмиды S MERS-CoV. Через 72 часа после трансфекции супернатанты собирали, фильтровали и замораживали при -80 ° C.

Эксперименты по заражению и нейтрализации псевдовирусов.

Клетки Huh7.5 были предоставлены Деборой Р. Тейлор, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, Силвер-Спринг, Мэриленд, и культивированы в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина при 37 ° C и 5% CO 2 .Инфекционность псевдовируса оценивали на клетках Huh7.5, помещенных в течение ночи в 96-луночные черно-белые изопланшеты (PerkinElmer). К покоящимся клеткам Huh7.5 добавляли двукратные серийные разведения псевдовирусов в трех повторностях. После 2-часовой инкубации добавляли свежую среду. Клетки лизировали через 72 часа и добавляли субстрат люциферазы (Promega). Люциферазную активность измеряли в относительных единицах люциферазы (RLU) при 570 нм на SpectramaxL (Molecular Devices). Для экспериментов по нейтрализации серийные разведения мышиной сыворотки (1:40, четырехкратное, восемь разведений) смешивали с различными штаммами псевдовирусов, титры которых были ранее определены как целевые 50 000 RLU.Сигмоидальные кривые, усредненные в трех повторах для каждого разведения, были построены на основе показаний RLU; Титры 90% нейтрализации (IC 90 ) рассчитывали, рассматривая неинфицированные клетки как 100% нейтрализацию и клетки, трансдуцированные только вирусом как нейтрализацию 0%.

Анализ связывания с клеточной поверхностью.

Анализы связывания с клеточной поверхностью проводили, как описано ранее, с небольшими изменениями (31). Клетки HEK 293T высевали и выдерживали в течение ночи до достижения 80% слияния.Клетки трансфицировали плазмидами, экспрессирующими S-WT, S-2P или RBD MERS-CoV, сконструированными с трансмембранным доменом HA гриппа, с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 (Promega). Через 24 ч клетки отделяли 4 мМ EDTA в PBS, окрашивали красителем для определения жизнеспособности ViViD (Invitrogen), а затем окрашивали mAb (10 мкг / мл) или поликлональными сыворотками (1: 200), полученными от мышей, вакцинированных MERS-CoV. Затем клетки S. окрашивали козьим антимышиным IgG, Alexa-488 (Invitrogen). Клетки сортировали с помощью LSR (BD Biosciences).Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc.), используя следующую стратегию гейтирования: размер и гранулярность> отдельные клетки> живые клетки (отрицательные ViViD)> Spike + (положительные антитела). Фон флуоресценции рассчитывали с использованием нетрансфицированных клеток, окрашенных каждым соответствующим mAb, и вычитали из данных.

Эксперименты по изотермической калориметрии титрования.

Калориметрическое титрование Fab G4 в MERS S-2P, дегликозилированный MERS S-2P или MERS S-2P с удаленной переменной петлей проводили с использованием калориметра изотермического титрования (ITC) PEAQ (Malvern) при 25 ° C.Все белки диализовали в PBS. Концентрация белка в ячейке с образцом составляла 3,0–3,7 мкМ, тогда как концентрация G4 Fab в шприце для инъекций составляла 57,5 ​​мкМ. Титрование состояло из 15 инъекций. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения для анализа MicroCal PEAQ-ITC (Malvern) и соответствовали модели независимого связывания.

Устойчивость вирусов к опосредованному антителами ингибированию инфекционности.

Варианты БВРС-КоВ, ускользающие от G4-опосредованной нейтрализации инфекционности, были отобраны путем серийного пассирования рекомбинантного штамма БВРС-КоВ EMC / 2012 в культурах клеток Vero 81 (84), дополненных прогрессивно возрастающими концентрациями антител, в конечном итоге достигающими 3.6 мкг / мл на уровне конечного пассажа, P5. Начальное количество G4, 0,4 мкг / мл, соответствовало концентрации антител, необходимой для уменьшения ~ 40 бляшкообразующих единиц MERS-CoV на ~ 70% в анализе нейтрализации уменьшения бляшек с использованием монослоев клеток Vero 81. Супернатанты культур переносили на свежие клетки через 48 часов после инфицирования, и всего 13 G4-устойчивых изолятов MERS-CoV, представляющих три серии параллельных пассажей, были клонированы в виде бляшек из культур P5 на монослоях клеток Vero 81 в присутствии 1 мкг / мл G4.Изоляты бляшек размножали в культурах клеток Vero без антител в колбах размером 25 см 2 с последующим выделением полной РНК из монослоев инфицированных вирусом клеток с использованием реагента TRIzol (Invitrogen). Два перекрывающихся ампликона кДНК, охватывающих весь ген S, были получены с помощью ОТ-ПЦР с использованием SuperScript III RT (Invitrogen) и высокоточной термостабильной ДНК-полимеразы Easy-A (Agilent Technologies) (40 циклов амплификации продукта RT). Полученные продукты ПЦР S-гена подвергали дидезокси-секвенированию с использованием праймеров на основе S-гена, и считывания были сопоставлены с нативной последовательностью S-гена EMC / 2012 (номер доступа GenBank.JX869059.2) с помощью MacVector для выявления мутаций, связанных с нейтрализацией-уходом от G4. Адаптивные мутации в культуре клеток в спайке, идентифицированные в культурах без антител P10 и P20 EMC / 2012, были исключены из анализа изменений, возникающих при отборе G4.

Благодарности

Мы благодарим членов J.S.M. и A.B.W. лаборатории за критическое прочтение рукописи, Э. Шипмана за помощь в экспрессии белка, Бенджамина Кабрера и членов Программы трансляционных исследований Центра исследований вакцин (VRC) за техническую помощь в экспериментах на иммуногенность, Дж.Адольф-Брайфогл и С. Рэмиш за помощь в моделировании розеттского лиганда, а также ученым, работающим с пучком, за поддержку сбора рентгеновских данных в SBC 19-ID (Аргоннская национальная лаборатория) и Национальной ускорительной лаборатории BL14-1 SLAC. Эта работа была поддержана грантами P20GM113132 (для JSM) и R01AI127521 (для JSM и ABW), контрактом NIH HHSN261200800001E, соглашением 6×142 (для MRD и JDC) и внутренним финансированием Национального института аллергии и инфекционных заболеваний для поддержки работы в VRC ( Б.С.Г.). Аргонн находится в ведении UChicago Argonne, LLC для Департамента энергетики США (DOE), Управления биологических и экологических исследований по контракту DE-AC02-06Ch21357. Использование Стэнфордского источника синхротронного излучения (SSRL), Национальная ускорительная лаборатория SLAC, поддерживается Министерством энергетики, Управлением науки, Управлением фундаментальных энергетических наук по контракту DE-AC02-76SF00515. Программа SSRL по структурной молекулярной биологии поддерживается Управлением биологических и экологических исследований Министерства энергетики США и Национальным институтом общих медицинских наук NIH (включая P41GM103393).

Сноски

  • Вклад авторов: J.P., N.W., K.S.C., D.W., R.N.K., A.N.K., M.R.D., J.D.C., B.S.G., A.B.W. и J.S.M. спланированное исследование; J.P., N.W., K.S.C., D.W., R.N.K., H.L.T., C.A.C., M.M.B., E.L.A., A.N.K., J.D.C. и J.S.M. проведенное исследование; L.W., W.S. и W.-P.K. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; J.P., N.W., K.S.C., D.W., R.N.K., A.N.K., M.R.D., J.D.C., B.S.G., A.B.W. и J.S.M. проанализированные данные; и J.P., N.W., D.W., A.B.W. и J.S.M. написал газету.

  • Заявление о конфликте интересов: J.P., N.W., K.S.C., R.N.K., H.L.T., C.A.C., B.S.G., A.B.W. и J.S.M. являются изобретателями по заявке на патент США № 62 / 412,703, озаглавленный «Протеины шипов коронавируса перед слиянием и их использование». L.W., W.S., W.-P.K. и B.S.G. являются изобретателями по заявке на патент США № PCT / US2016 / 019395, озаглавленный «Иммуногены коронавируса ближневосточного респираторного синдрома, антитела и их использование».

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

  • Размещение данных: Крио-ЭМ реконструкции были депонированы в Банке данных электронной микроскопии (EMDB) (коды доступа EMD-8783 – EMD-8793). Атомные модели были депонированы в Protein Data Bank (коды PDB 5W9H – 5W9P). Атомные модели и структурные факторы для кристаллических структур NTD БВРС-КоВ и G4 Fab также были депонированы в банке данных белков (коды PDB ID 5VYH и 5VZR, соответственно).

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1707304114/-/DCSupplemental.

Свободно доступен в Интернете через опцию открытого доступа PNAS.

Mercedes-Benz S-Class 2021 года Обзор, цены и характеристики

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *